超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定保健食品中西地那非的不確定度評(píng)估

【摘" "要】" "基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）對(duì)保健食品中西地那非添加量進(jìn)行了不確定度評(píng)估。通過對(duì)樣品量取、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品稀釋定容、重復(fù)性測(cè)量等實(shí)驗(yàn)過程中引入的不確定度進(jìn)行評(píng)定和分析，計(jì)算得到在保健食品中的西地那非的總量為0.7878 mg/L 時(shí)，擴(kuò)展不確定度為0.0795 mg/L，包含因子k為2。引起測(cè)量不確定度的因素主要是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的配制（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0433）、最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0226），其次為樣品的量取、定容、稀釋以及測(cè)量重復(fù)性。該評(píng)估模型可為采用UPLC-MS/MS測(cè)定西地那非的不確定度評(píng)定提供參考。

【關(guān)鍵詞】" "不確定度；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）；西地那非；保健食品；外標(biāo)法

【Abstract】" " In this study， the uncertainty of sildenafil addition in functional foods was evaluated based on Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry （UPLC-MS/MS）. By evaluating and analyzing the uncertainty introduced in the experimental process of sample measurement， standard material solution preparation， standard curve fitting， sample dilution and volume determination， and repeatability measurement， the expanded uncertainty was 0.0795 mg/L and the coverage factor k was 2 when the total amount of sildenafil in functional food was 0.7878 mg/L. The measurement uncertainty was mainly caused by the preparation of standard solution preparation （urel（C）=0.0433） and the least square fitting standard working curve （urel（ y ）= 0.023）， then by the sample weighing，dilution and detection. The evaluation system could be used to provide a reference for the uncertainty evaluation of the determination of sildenafil in functional food by UPLC-MS/MS.

【Key words】" nbsp; "uncertainty; Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry （UPLC-MS/MS）; sildenafil; functional food; external standard method

〔中圖分類號(hào)〕" O657.63" "" " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕" A" " " " "〔文章編號(hào)〕 1674 - 3229（2024）04 - 0082 - 07

0" " "引言

隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)水平的提升，人們的健康意識(shí)顯著增強(qiáng)，對(duì)健康產(chǎn)品的需求不斷升級(jí)?！秶?guó)民營(yíng)養(yǎng)計(jì)劃（2017-2030年）》明確了“著力發(fā)展保健食品”的國(guó)家戰(zhàn)略布局，對(duì)深化保健食品管理提出新的要求［1-2］。保健食品具有特定的保健功能，但并非藥品，其發(fā)揮作用的方式與藥物不同，不具備治療疾病的功能［3-4］。研究報(bào)道，在所有保健品種類中，增強(qiáng)免疫力和緩解疲勞類的保健食品占了很大比例［5］。因此，該類保健品具有巨大的市場(chǎng)，更成為非法添加的重災(zāi)區(qū)，其中最常見的是那非類物質(zhì)的添加［6-9］。西地那非作為處方藥，具有松弛平滑肌、擴(kuò)張血管、改善性功能的功效，但需要在醫(yī)生指導(dǎo)下服用，如果濫用會(huì)出現(xiàn)惡心、頭暈，嚴(yán)重時(shí)可造成心肌梗死［10］。國(guó)家明文規(guī)定嚴(yán)禁在保健食品中添加西地那非，但近年來我國(guó)查處的保健食品中非法添加西地那非的案例屢見不鮮［11-12］。市場(chǎng)監(jiān)督管理部門高度重視這一現(xiàn)象，針對(duì)該類保健食品陸續(xù)發(fā)布補(bǔ)充檢測(cè)方法以及檢測(cè)項(xiàng)目批準(zhǔn)件。

自2006年開始，國(guó)家監(jiān)管部門發(fā)布的西地那非補(bǔ)充檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法［13-15］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）［16-17］以及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）［18-19］，檢測(cè)的樣品涉及酒類、保健食品、功能飲料等。液質(zhì)聯(lián)用方法的出現(xiàn)，顯著提高了西地那非檢出的靈敏度和準(zhǔn)確性。2009年之后發(fā)布的檢測(cè)方法都采用了液質(zhì)聯(lián)用的方法，液質(zhì)聯(lián)用方法的不確定評(píng)估模型已被廣泛建立［20-23］。在2018年7月發(fā)布的最新方法中，特別提出利用UPLC-MS/MS，UPLC的速度、靈敏度以及分離度遠(yuǎn)高于HPLC［24-25］，但UPLC-MS/MS應(yīng)用在西地那非檢測(cè)的不確定度評(píng)估尚無報(bào)道。

本研究參考BJS201805《食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定》中的方法一，通過UPLC-MS/MS對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析［26］。依據(jù)CNAS-RB/T 030-2020 《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》［27］、GB/T 27418-2017《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》［28］等文件，對(duì)結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)，并且評(píng)估各個(gè)不確定度分量，查找影響UPLC-MS/MS檢測(cè)食品中西地那非不確定度的因素，最終確定檢測(cè)結(jié)果的置信區(qū)間和置信水平，為檢測(cè)過程的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1" " "材料與方法

1.1" "材料與儀器

保健酒（能力驗(yàn)證品）" "大連海關(guān)技術(shù)中心；

西地那非檸檬酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品" "天津阿爾塔生物科技有限公司；

甲醇（色譜純）" " 德國(guó)Merck公司；

甲酸（質(zhì)譜純）" " 上海TCI公司；

實(shí)驗(yàn)用水 符合國(guó)際GB/T 6682-2008的一級(jí)水。

Waters Xevo TQD型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀" 美國(guó)沃特世科技有限公司；

旋渦混合器" 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；

微量移液器" 美國(guó)RAININ公司。

1.2" "實(shí)驗(yàn)方法

參考《食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定》方法一：超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法中的樣品前處理與檢測(cè)方法［26］。

1.2.1" "標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確量取西地那非檸檬酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液（西地那非質(zhì)量濃度為1 mg/mL）10 μL 配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；接著吸取10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10 μL，配制成1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以上儲(chǔ)備液置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩７謩e吸取1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成濃度為2、5、10、20、50 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2" "樣品前處理

取試樣適量，搖勻，用微量移液器吸取1 mL樣品置于50 mL容量瓶中，補(bǔ)充適量甲醇并進(jìn)行超聲處理15 min，待樣品降至室溫，用甲醇補(bǔ)足至50 mL，處理后的樣品經(jīng)過微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，利用甲醇水溶液（體積比為1：1）稀釋續(xù)濾液至適當(dāng)濃度，備用。

1.2.3" 儀器條件

1.2.3.1" 液相色譜條件 色譜柱：Waters CORTECS T3（2.1×100 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液，B為甲醇；流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

1.3" "數(shù)學(xué)模型

根據(jù)食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定方法，分析物西地那非的含量計(jì)算公式如下：

式中：X表示試樣中待測(cè)組分的含量，單位為毫克每升（mg/L）；[ρ]表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣品溶液中待測(cè)組分的含量，單位為納克每毫升（ng/mL）；V表示樣品溶液定容體積，單位為毫升（mL）；Vm表示樣品取樣量，單位為升（L）；f為稀釋倍數(shù)。

2" " "結(jié)果與分析

2.1" "不確定度主要來源

上述方法測(cè)定保健食品中的西地那非可能引入的不確定度包括：樣品稱量和定容、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、儀器重復(fù)測(cè)定等因素，詳細(xì)來源見圖1。

2.2" "樣品稱量過程的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品量取體積為1.0 mL，由1000 μL可調(diào)式移液槍引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度包括兩個(gè)部分：第一，移液槍體積的不確定度，按照J(rèn)JG 646-2006《移液器計(jì)量檢定規(guī)程》規(guī)定［29］ ，1000 μL移液槍移取1000 μL液體的允許誤差為±10.0 μL，按均勻分布k=[3]換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為[103]=5.77，則一次稱量過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

第二，移取溶液體積的變動(dòng)性，可通過重復(fù)移取進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，重復(fù)6次，得到標(biāo)準(zhǔn)偏差為5 uL，則移取溶液體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

故，兩個(gè)分量合成的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3" "樣品定容過程中引入的不確定度

樣品稀釋過程中使用玻璃器均為A級(jí)，樣品定容和稀釋過程中使用50 mL容量瓶，根據(jù)JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［30］規(guī)定的偏差要求，A級(jí)單標(biāo)線50 mL容量瓶的容量允許差為±0.05 mL，按均勻分布換算成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

容量瓶校準(zhǔn)在20 ℃進(jìn)行，環(huán)境溫度一般波動(dòng)范圍控制在 ±5 ℃，在20 ℃下，甲醇和玻璃的體積膨脹系數(shù)分別為1.2×10-3，2.5×10-5 ℃ -1，按均勻分布k＝[3]，則試驗(yàn)溫度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則樣品溶液稀釋過程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4" "標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的不確定度

2.4.1" 西地那非檸檬酸鹽溶液引入的不確定度

西地那非檸檬酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液由天津阿爾塔科技有限公司提供，純度為99.5%，標(biāo)準(zhǔn)證書給出的擴(kuò)展不確定度為±5%，包含因子k=2，則引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4.2" "配制西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

2.4.2.1" "配制100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度

使用10 mL 容量瓶配制儲(chǔ)備液，其不確定度包括兩部分：第一，容量瓶體積的不確定度，按JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［30］，A級(jí)單標(biāo)線10 mL容量瓶的容量允許差為±0.02 mL，按均勻分布k=[3]，容量瓶體積引入的不確定度為：

第二，移液槍體積的不確定度，按照J(rèn)JG 646-2006《移液器計(jì)量檢定規(guī)程》規(guī)定［29］，1000 μL移液槍移取1000 μL容量的允許誤差為±10.0 μL，按均勻分布k=[3]換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為[103]=5.77，則一次稱量過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（Vp1）為0.0058 。

故配制100 μg/mL 儲(chǔ)備液引入的不確定度為：

2.4.2.2" "配制1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度

使用10 mL 容量瓶配制儲(chǔ)備液，其不確定度包括兩部分：第一，10 mL容量瓶體積的不確定度urel（Vf2）為0.0012。

第二，200 μL移液槍移取100 μL容量的允許誤差為±2.0 μL，按均勻分布k=[3]，則一次移取過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

故配制1 μg/mL儲(chǔ)備液引入的不確定度為：

2.4.2.3" "配制2 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度

其不確定度包括兩部分：第一，容量瓶體積的不確定度，按JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［30］，A級(jí)單標(biāo)線10 mL容量瓶的容量允許差為±0.02 mL，按均勻分布k＝[3]，容量瓶體積引入的不確定度urel（Vf2）為0.0012。

第二，20 μL移液槍移取20 μL容量的允許誤差為±0.8 μL，按均勻分布k=[3]，則一次移取過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

故配制2 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度為：

2.4.2.4" "配制5 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度

使用10 mL 容量瓶配制儲(chǔ)備液，其不確定度包括兩部分：第一，10 mL容量瓶體積引入的不確定度urel（Vf2）為0.0012。

第二，200 μL移液槍移取50 μL容量的允許誤差為±1.5 μL，按均勻分布k=[3]，則一次移取過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

故配制5 ng/mL儲(chǔ)備液引入的不確定度為：

2.4.2.5" "配制10 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

使用10mL 容量瓶配制儲(chǔ)備液，其不確定度包括兩部分：第一，10 mL容量瓶體積引入的不確定度urel（Vf2）為0.0012。

第二，200 μL移液槍移取100 μL容量的允許誤差為±2 μL，按均勻分布k=[3]，則一次移取過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

故配制10 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的相對(duì)不確定度為：

2.4.2.6" "配制20 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

使用10 mL 容量瓶配制儲(chǔ)備液，其不確定度包括兩部分：第一，10 mL容量瓶體積引入的不確定度urel（Vf2）為0.0012。

第二，200 μL移液槍移取200 μL容量的允許誤差為±3.0 μL，按均勻分布k=[3]，則一次移取過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

故配制20 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度為：

2.4.2.7" "配制50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

使用10 mL 容量瓶配制儲(chǔ)備液，其不確定度包括兩部分：第一，10 mL容量瓶體積引入的不確定度urel（Vf2）為0.0012。

第二，1000 μL移液槍移取500 μL容量的允許誤差為±5 μL，按均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

故配制50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度為：

2.4.2.8" "配制標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

2.5" "標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度

由于超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀具有較高的靈敏度，不考慮進(jìn)樣量及儀器示值誤差，儀器穩(wěn)定性是造成所測(cè)樣品峰面積不確定度的主要原因。因此對(duì)5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別重復(fù)測(cè)定3次，樣品重復(fù)測(cè)定6次，所得結(jié)果見表3。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程為y=132.838x-11.6703，本方法為外標(biāo)法，故采用標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合測(cè)量不確定度。

根據(jù)公式：

式中：Sy表示標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)得峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差；b表示標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程的斜率；p表示樣品溶液測(cè)定次數(shù)；n表示標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的測(cè)定次數(shù)。

因此，由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.6" "重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度

樣品重復(fù)性測(cè)定的不確定度主要來源于實(shí)驗(yàn)過程中方法、人員操作、試劑耗材等導(dǎo)致的峰面積的變動(dòng)。由此可見，不確定度[uR]很難精確評(píng)估，因此以A類評(píng)估為主，B類評(píng)估為輔，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定6個(gè)平行樣品，對(duì)6次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（見表4），其標(biāo)準(zhǔn)偏差[sy]作為不確定度[Uy]，包含了以上變動(dòng)性導(dǎo)致的不確定度。

重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差：

則測(cè)量重復(fù)性的不確定度為：

2.7" "不確定度的合成、擴(kuò)展和表示

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中西地那非不確定度分量及測(cè)量結(jié)果如表5所示。

合成不確定度：

取包含因子k=2，保健食品中西地那非含量為0.7878 μg/mL，則擴(kuò)展不確定度為：

3" " "結(jié)論

本研究針對(duì)最新的保健食品中西地那非的檢測(cè)方法——超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，首次對(duì)該方法的不確定度進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合是檢測(cè)結(jié)果的不確定度的主要來源，樣品的量取、定容、稀釋和重復(fù)性測(cè)定對(duì)不確定度的影響相對(duì)較小。在標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中由微量移液器引入的不確定度較高，因此可選擇體積較大的計(jì)量器具來配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)而降低由微量移液器引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度可以通過使用更多濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液來構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且避免在高濃度或者低濃度出現(xiàn)非線性響應(yīng)，進(jìn)而增加擬合精度。通過對(duì)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中西地那非的不確定度進(jìn)行評(píng)定，找出影響結(jié)果不確定度的主要因素，對(duì)影響檢測(cè)結(jié)果的環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)而保證精準(zhǔn)檢測(cè)。

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責(zé)任編輯" "孫" "澗

［收稿日期］" "2024-02-26

［基金項(xiàng)目］" "國(guó)家自然科學(xué)基金（81402889）

［作者簡(jiǎn)介］" "郭巧云（1986- ），女，博士，天津醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校質(zhì)譜應(yīng)用技術(shù)實(shí)驗(yàn)室副教授，研究方向：臨床質(zhì)譜技術(shù)及應(yīng)用。

龔子珊（1986- ），女，博士，天津醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校質(zhì)譜應(yīng)用技術(shù)實(shí)驗(yàn)室講師，#并列第一作者，研究方向：臨床" " " 質(zhì)譜技術(shù)及應(yīng)用。

［通信作者］" "徐亮（1982- ），男，博士，天津醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校質(zhì)譜應(yīng)用技術(shù)實(shí)驗(yàn)室、天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院教授，研究方向：分析化學(xué)。