木薯氰苷合成關(guān)鍵酶基因MeCYP79D2的克隆及表達分析

摘""要：氰苷含量是木薯改良的重要靶標(biāo)性狀，MeCYP79D2是木薯氰苷合成的限速酶基因之一。本研究以食用木薯品種SC9為材料，克隆木薯細(xì)胞色素P450酶家族中的MeCYP79D2基因，通過生物信息學(xué)軟件對其進行分析，利用實時熒光定量PCR檢測其在不同木薯種質(zhì)塊根中的表達特性，采用高效液相色譜儀測定氰化物的含量，并分析其與MeCYP79D2基因表達量的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示：MeCYP79D2基因編碼區(qū)序列長度為1625"bp，編碼528個氨基酸，屬于不穩(wěn)定脂溶性親水蛋白，具有38個磷酸化位點；序列比對表明該基因保守性較高；系統(tǒng)進化分析顯示MeCYP79D2與橡膠及麻風(fēng)樹關(guān)系較近；氰苷含量不同的木薯種質(zhì)資源塊根中MeCYP79D2基因表達量與氰苷含量存在極顯著正相關(guān)；茉莉酸甲酯處理后，根中MeCYP79D2基因的表達顯著上調(diào)且氰苷含量顯著升高。本研究結(jié)果表明MeCYP79D2參與氰苷合成，為解析木薯氰苷生物合成的分子機制研究提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：木薯；細(xì)胞色素P450單加氧酶；氰苷；基因克隆

中圖分類號：S533""""""文獻標(biāo)志碼：A

Cloning"and"Expression"Analysis"of"Key"Enzyme"Gene"MeCYP79D2"for"Cyanoside"Synthesis"in"Cassava

XIAO"Xinhui1，"YU"Xiaoling2，"ZHANG"Jie1，"FU"Naifang1，"XUE"Maofu1，"WEI"Zhuowen1，"YE"Jianqiu1，"WANG"Ming1*

1."Tropical"Crops"Genetic"Resources"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Germplasm"Resources"Conservation"and"Utilization"of"Cassava，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："The"level"of"cyanogenic"glucosides"content"is"an"important"trait"for"the"edible"quality"of"cassava，"and"MeCYP79D2"is"one"of"the"key"enzyme"genes"regulating"cassava"cyanogenic"glucosides"synthesis."This"study"used"the"edible"variety"SC9"as"the"material，"cloned"the"MeCYP79D2"gene"in"the"cytochrome"P450"enzyme"family"of"cassava，"analyzed"it"using"bioinformatics"software，"and"detected"its"expression"characteristics"in"different"cassava"germplasm"tubers"using"real-time"quantitative"PCR."The"cyanogenic"glucosides"content"was"measured"using"HPLC，"and"its"correlation"with"the"expression"level"of"MeCYP79D2"genenbsp;was"analyzed."The"results"showed"that"the"length"of"the"coding"region"sequence"of"MeCYP79D2"gene"was"1625"bp，"encoding"528"amino"acids."It"belonged"to"an"unstable"lipophilic"hydrophilic"protein"with"38"phosphorylation"sites."Sequence"alignment"indicated"that"the"gene"was"highly"conserved，"and"phylogenetic"analysis"showed"that"MeCYP79D2"was"closely"related"to"rubber"and"leprosy"trees."There"was"a"significant"positive"correlation"between"the"expression"of"MeCYPD2"gene"and"the"content"of"cyanogen"glycosides"in"cassava"roots"of"germplasms"with"different"levels"of"cyanogen"glycosides."After"treatment"with"methyl"jasmonate，"the"expression"of"MeCYP79D2"gene"in"roots"was"significantly"upregulated"and"the"content"of"cyanogenic"glucosides"was"significantly"increased."The"results"of"this"study"indicates"that"MeCYP79D2"is"involved"in"cyanogenic"glucosides"synthesis，"providing"a"theoretical"basis"for"studying"the"molecular"mechanism"of"cassava"cyanogenic"glucosides"biosynthesis.

Keywords："cassava;"cytochrome"P450;"cyanogenic"glucosides;"gene"cloning

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.11.003

木薯（Manihot"esculenta"Crantz）是世界熱帶地區(qū)的主要糧食作物，是重要的淀粉、能源及飼料加工原料，全球以木薯為原料的食品多達上千種[1-2]。因木薯中含有氰苷化合物，人們在食用時要經(jīng)過一定的處理，費工費時，極大限制了木薯食用化的發(fā)展。氰苷是一種廣泛存在于高粱、木薯、雜糧雜豆（利馬豆和野生蕎麥等）、牧草（白三葉和百脈根等）等植物中的代謝產(chǎn)物，其被水解酶水解后能釋放有毒化合物氰氫酸，可抵抗病原微生物的侵害和昆蟲啃食，也能在植物體內(nèi)被分解作為氮源[3-4]。木薯中含有1種或2種氰苷化合物，為亞麻苦苷和百脈根苷，其中亞麻苦苷含量占95%以上[5]。木薯分為甜木薯和苦木薯，主要差別在于塊根中氰苷類化合物含量的高低，低于50"mg/kg為甜木薯，反之則為苦木薯，甜木薯主要用于食用和飼用，苦木薯主要用于加工利用[6]。

細(xì)胞色素P450單加氧酶（cytochrome"P450，"CYP450）是一類普遍存在于動植物和真菌中的超大酶類家族，約占植物基因組編碼蛋白質(zhì)的1%[7]。它作為一種末端加氧酶，可以催化各類羥基化、環(huán)氧化、脫烷基化反應(yīng)，參與植物激素、萜類、生物堿類、黃酮類等次生代謝產(chǎn)物的合成與代謝，在生物過程中發(fā)揮重要作用[8-9]，廣泛分布在玉米[10]、水稻[11]、小麥[12]、番茄[13]、茶樹[14]等作物中。氰苷生物合成途徑中涉及三大類酶，其中兩類均屬于細(xì)胞色素CYP450單加氧酶家族，為CYP79和CYP71亞族成員，另一類為葡萄糖轉(zhuǎn)移酶。氰苷生成過程中首先通過CYP450，將α-氨基酸羥基化形成N-羥基氨基酸，然后形成醛肟，進一步形成腈，最后一步是由糖基轉(zhuǎn)移酶催化的半氰醇的糖基化反應(yīng)生成氰苷[15]。CYP450作為氰苷合成途徑中的第一步關(guān)鍵酶，在調(diào)控植物氰苷含量方面發(fā)揮著重要作用。前人研究表明，抑制CYP79D1與CYP79D2基因的表達會降低木薯中氰苷含量，從而降低木薯毒性[16]。因此，解析木薯氰苷類化合物代謝的分子機制，選育氰化物含量低的木薯品種，是木薯食用化利用的重要研究方向。

本研究以食用木薯品種SC9為材料，克隆MeCYP79D2基因并進行生物信息學(xué)分析，研究其在氰苷含量不同的木薯種質(zhì)資源塊根中的表達情況，并對其在MeJA誘導(dǎo)下的表達量進行分析，初步分析氰苷代謝關(guān)鍵調(diào)控酶基因MeCYP79D2的序列及表達差異，以期為后續(xù)相關(guān)基因功能和調(diào)控機理研究奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

MeCYP79D2基因克隆供試材料為SC9木薯品種的葉片和塊根，基因熒光定量檢測供試材料為國家木薯種質(zhì)資源圃保存的16份種質(zhì)資源。主要試劑：與凝膠電泳有關(guān)試劑購自北京擎科生物科技有限公司；乙腈、甲酸購自海南冷港科技有限公司。主要儀器設(shè)備：基因擴增儀（TaKaRa，日本）、超微量分光光度計（Implen"N60，德國）、實時熒光定量PCR儀（Thermo，美國）和液相色譜儀（Agilent"1260，美國）。PCR引物合成和DNA測序由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2""方法

1.2.1""總RNA提取及cDNA合成""采用RNAprep"Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen）提取樣品總RNA，并用核酸檢測儀檢測其濃度和質(zhì)量。待RNA質(zhì)量檢測合格后，按照RevertAid"RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo）說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2""基因克隆""在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www."ncbi.nlm.nih.gov/）中下載MeCYP79D2基因序列，利用Primer3Plus（https：//www.bioinformatics."nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi）在線軟件設(shè)計特異性擴增MeCYP79D2基因編碼區(qū)（CDS）序列的引物（5￠-ATGGCCATGAACGTCTCCAC-3￠和5￠-TCAAGGTGAAGTGGGGTAGA-3￠）。擴增體系為：cDNA模板2"μL、MeCYP79D2-F（10"μmol/L）0.5"μL、MeCYP79D2-R（10"umol/L）0.5"μL、Phanta"Max"Master"Mix（2×）23.5"μL、無菌水補足至50"μL。擴增程序：95"℃預(yù)變性5"min；95"℃"30"s，56"℃"30"s，72"℃"1"min，35個循環(huán)；72"℃"10"min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.3""生物信息學(xué)分析""對MeCYP79D2的同源序列、進化關(guān)系、蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能等方面進行生物信息學(xué)分析，使用的數(shù)據(jù)庫和軟件見表1。

1.2.4""熒光定量PCR檢測""利用RNAprep"Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen）提取16份種質(zhì)資源的塊根RNA。取1"μg"RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，稀釋10倍后作為模板。使用Primer3Plus（https：//www.bioinformatics.nl/"cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi）在線軟件設(shè)計木薯MeCYP79D2基因的熒光定量PCR引物（正向引物：5'-ACTTCAGAGATCATTTC TCC AG CTA-3'，反向引物：5'-ACATTCTTGTT GC TC TT GTACTGGT-3'），選用MeActin為內(nèi)參基因（正向引物：5'-TGATGAGTCTGGTC CATCCA-3'，反向引物：5'-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3'）。擴增體系（10"μL）：cDNA模板1"μL、10"μmol/L熒光定量PCR引物各0.2"μL、ChamQ"Universal"SYBR"qPCR"Master"Mix（2×）5"μL、ddH2O"3.6"μL。反應(yīng)程序：95"℃預(yù)變性30"s；95"℃"10"s、60"℃"20"s，40個循環(huán)。每樣品設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.5""氰化物含量的測定""參照王琴飛等[17]的方法利用高效液相色譜儀分析樣品中氰苷含量。色譜柱：Waters"Atlantic"C18，4.6"mm×150"mm，粒徑5"μm，柱溫25"℃。流動相：A為含0.1%甲酸的80%乙腈/水（V/V），B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序：起始時（0"min），A為10%，B為90%；15"min時，A和B均為50%；18"min時，A為100%，持續(xù)2"min；22"min時，A為10%，B為90%；平衡柱子5"min。流速為0.6"mL/min，漂移管溫度為95"℃，霧化溫度為80"℃，氣流速度為2.0"L/min，增益為3，進樣體積為10"μL。采用外標(biāo)法計算樣品中亞麻苦苷和百脈根苷的含量。

1.3""數(shù)據(jù)處理

采用Excel"2016和SPSS"20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析。應(yīng)用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，使用Tukey’s"HSD法進行顯著性測驗（Plt;0.05）。使用Graphpad（v8.0.2）繪制相基因?qū)Ρ磉_量和氰苷含量柱狀圖。

2""結(jié)果與分析

2.1""MeCYP79D2基因克隆

采用同源克隆策略，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索獲得木薯品種Col22的MeCYP79D2基因cDNA全長1626"bp，編碼541個氨基酸。以木薯SC9葉片RNA為模板，擴增MeCYP79D2基因全長，將克隆得到的目的基因純化、測序后進行序列比對。MeCYP79D2基因編碼區(qū)長度為1625"bp，編碼528個氨基酸（圖1）。與Col22的MeCYP79D2基因核苷酸序列比對，在117和1560位置上存在單堿基突變，942位置上存在單堿基缺失，相似性達99.82%。蛋白質(zhì)序列比對發(fā)現(xiàn)有192個位點存在差異，占比38.35%。

2.2""MeCYP79D2蛋白氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中對MeCYP79D2氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域進行搜索，結(jié)果如圖2所示，MeCYP79D2包含細(xì)胞色素P450酶（cytoch ro me_"P450）結(jié)構(gòu)域和CYP79結(jié)構(gòu)域非特異性位點，屬于細(xì)胞色素P450酶超家族（cytochrome_P450"superfamily）。通過Blastp同源比對，發(fā)現(xiàn)木薯MeCYP79D2氨基酸序列（XP_021629850.1）與橡膠樹（Hevea"brasiliensis，XP_021674957.2）、麻風(fēng)樹（Jatropha"curcas，AXF53803.1）、蓖麻（Ricinus"communis，XP_002534163.3）、水銀草（Mercurialis"annua，XP_050203649.1）、亞麻（Linum"usitatissimum，WAL01197.1）、雷公藤

（Tripterygium"wilfordii，XP_038697057.1）、大蒲桃（Syzygium"grande，KAI6691975.1）、蒜頭果（Malania"oleifera，XP_057972653.1）、大桉（Eucalyptus"grandis，XP_010030374.3）、番木瓜（Carica"papaya，XP_021887085.1）等的氨基酸序列相似性較高，分別為88.35%、77.45%、75.60%、70.85%、67.23%、68.74%、60.79%、62.57%、61.19%、59.47%。利用DNAMAN"7.0軟件對木薯MeCYP79D2氨基酸序列與上述10個物種進行序列比對，結(jié)果表明，不同物種的MeCYP79D2氨基酸序列具有較高的保守性，其中與橡膠樹和麻風(fēng)樹相似度較高（圖3），說明MeCYP79D2基因的功能與橡膠樹和麻風(fēng)樹的CYP79D2功能相似。

利用MEGA7.1[18]軟件中neighbor-joining法[19]將木薯MeCYP79D2氨基酸序列與其他10個物種構(gòu)建同源進化樹（圖4），結(jié)果顯示，木薯與橡膠樹、麻風(fēng)樹屬于同一分支，其中與橡膠樹在進化關(guān)系上最為接近，與序列比對結(jié)果一致。

2.3""MeCYP79D2蛋白理化性質(zhì)預(yù)測

利用ProtParam在線軟件分析預(yù)測MeCYP79D2蛋白分子結(jié)構(gòu)式為C2758H4366N742O781S27，相對分子量為61.28"kDa，理論等電點為8.90，預(yù)測該蛋白由541個氨基酸殘基組成，其中亮氨酸（Leu）比

例最高，為9.1%，半胱氨酸（Cys）比例較低，為1.3%；不穩(wěn)定系數(shù)為40.40，脂肪系數(shù)為89.78，總平均親水性為?0.239，依據(jù)總平均親水性小于0為親水蛋白，推測MeCYP79D2蛋白為不穩(wěn)定的脂溶性親水蛋白。

使用ProtScale在線工具對MeCYP79D2蛋白的親/疏水性進行預(yù)測分析，結(jié)果如圖5所示。第34位氨基酸得分最高，為2.100，疏水性最強，第445位氨基酸得分最低，為?2.063，親水性最強，第0～50位氨基酸有1個典型的疏水性區(qū)域，"該區(qū)域存在1個跨膜結(jié)構(gòu)。通過TMHMM軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)MeCYP79D2蛋白的第1～18位氨基酸位于細(xì)胞膜內(nèi)，第19～41位氨基酸之間有1個跨膜螺旋區(qū)，第42～541位氨基酸位于細(xì)胞膜外，推測MeCYP79D2蛋白是一個跨膜蛋白（圖6），與ProtScale預(yù)測的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)結(jié)果相符。SignalP預(yù)測結(jié)果顯示，MeCYP79D2蛋白不含信號肽。

采用NetPhos"3.1"Server軟件對MeCYP79D2蛋白的磷酸化修飾位點進行分析，結(jié)果如圖7所示。MeCYP79D2蛋白具有38個潛在磷酸化修飾位點，占氨基酸序列的7.0%，其中絲氨酸位點20個，蘇氨酸位點15個，酪氨酸位點3個，主要能被蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）、細(xì)胞分裂周期蛋白2（cdc2）和酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）等蛋白激酶磷酸化。

2.4""MeCYP79D2蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA軟件對MeCYP79D2蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果如圖8所示。MeCYP79D2蛋白主要以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主，分別為224個和197個，分別占氨基酸序列的45.10%和36.41%；另外還含有27個β-轉(zhuǎn)角和73個延伸鏈，分別占氨基酸序列的4.99%和13.49%?；谀臼鞢YP79D2的晶體結(jié)構(gòu)（Q9M7B7.1A）對MeCYP79D2蛋白進行三級結(jié)構(gòu)建模，結(jié)果如圖9所示，二者相似度為99.63%。

2.5""MeCYP79D2在木薯不同組織部位中的表達分析

基于前人轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[20]，對MeCYP79D2在木薯葉片、中脈、腋芽、葉柄、莖尖、莖、體胚、脆性愈傷、塊根、須根、根尖等11個組織部位的相對表達情況進行分析，結(jié)果如圖10所示，MeCYP79D2基因在木薯腋芽、葉柄、塊根和須根中的表達量顯著高于其他組織。

2.6""不同木薯種質(zhì)資源塊根中MeCYP79D2表達與氰苷含量關(guān)系分析

為探究MeCYP79D2在與氰苷含量的關(guān)系，取16份氰苷含量的不同的木薯種質(zhì)資源的塊根，檢測其MeCYP79D2基因相對表達量和氰苷含量。結(jié)果表明，MeCYP79D2基因表達量與氰苷含量存在極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.692（圖11）。

2.7""MeCYP79D2基因在MeJA處理下的表達分析

用100"μmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）對SC9

木薯種莖進行水培處理，分別檢測處理0、3、6、9、12、24"h后MeCYP79D2基因在根、莖、葉中的表達情況及處理0、1、2、3"d后的氰苷含量變化。結(jié)果顯示，SC9根中MeCYP79D2基因的表達受MeJA誘導(dǎo)顯著上調(diào)（圖12A），且24"h后SC9根中氰苷含量極顯著升高，而莖和葉中氰苷含量分別于2～3"d后極顯著升高（圖12B），推測MeJA調(diào)控MeCYP79D2基因的表達來促進氰苷的合成。

3""討論

氰苷不僅是評判木薯能否食用的關(guān)鍵性狀，還是其塊根還原氮的重要來源，可影響氨基酸和蛋白質(zhì)合成以及塊根組織損傷后，快速引發(fā)采后生理腐爛過程[16，"21-23]。植物中氰苷的合成、運輸和轉(zhuǎn)運是一個高度整合的過程，涉及不同組織和

器官中多種基因和酶的差異表達。在模式植物髙粱中發(fā)現(xiàn)氰苷的生物合成途徑，具體步驟如下：一是L-酪氨酸經(jīng)CYP79A1催化后氮端羥基化，脫水、脫羧化生成相對應(yīng)的對羥基苯乙醛肟；二是在CYP71E1的催化下，對羥基苯乙醛肟通過脫水和碳端羥基化，轉(zhuǎn)變?yōu)閷αu基苯乙醛腈；三是在糖苷轉(zhuǎn)移酶UGT85B1的作用下，對羥基苯乙醛腈糖基化成為蜀黍苷[24]。不同研究表明，在木薯[25-26]、韭菜[27]、百脈根[28]中均發(fā)現(xiàn)了上述生物合成途徑。在不同種類的植物中，催化氰苷合成的酶不盡相同，但都是由CYP79同源基因編碼，且功能都具有相似性，木薯催化氰苷合成第一步的酶是CYP79D1和CYP79D2[22，"29]，CYP79D1和CYP79D2基因相似性為85%，與高粱CYP79A1序列具有54%的同源性。雖然CYP79D1和CYP79D2的表達相同，并且都可以使用纈氨酸和異亮氨酸作為底物，但纈氨酸的結(jié)合親和力高于異亮氨酸，因此在木薯中，亞麻苦苷是主要的氰苷成分，占95%以上[30]。且CYP79D1和CYP79D2活性被證實高于CYP71E7，在催化氰苷生物合成中具有限速作用[25]。此外參與氰苷運輸和代謝途徑的基因有多藥及毒素外排轉(zhuǎn)運蛋白MATE、硝酸鹽/肽轉(zhuǎn)運蛋白NPF、羥基腈裂解酶HNL等，在利用基因工程改造木薯氰苷含量，增強營養(yǎng)等方面具有重要意義[31]。

目前國內(nèi)外尚未培育出葉片或塊根中完全不含氰苷的木薯品種[32]。研究表明，亞麻苦苷在葉片或部分在莖中合成，并通過莖韌皮部運輸?shù)綁K根，一部分儲存在液泡中，另一部分為氨基酸合成提供還原的氮源，塊根則不合成亞麻苦苷。MCMAHON等[31]提出基于庫源關(guān)系改良木薯品種中氰苷含量的分子策略，即通過阻斷亞麻苦苷合成的限速步驟CYP79D1和D2的催化，可將塊根中亞麻苦苷降低到安全水平。GOMEZ等[33]使用基因編輯技術(shù)對CYP79D1和CYP79D2進行敲除，得出CYP79D2的表達在亞麻苦苷合成中作用突出。本研究從食用品種SC9中克隆得到MeCYP79D2基因編碼序列，其cDNA全長1625"bp，編碼528個氨基酸，分子量為61.28"kDa，理論等電點為8.90。周偉堅等[34]克隆MeCYP79D2基因與數(shù)據(jù)庫中在核苷酸序列和氨基酸序列同源性達99%，本研究與數(shù)據(jù)庫比對，核苷酸序列相似性達99.82%，但氨基酸序列差異達38.35%，可能與克隆基因的品種差異有關(guān)。原曉龍等[35]也在蒜頭果中克隆出MoCYP79基因cDNA序列，與木薯中AAF27290.1和AAF27289.1蛋白聚為一類。本研究通過系統(tǒng)進化分析表明，MeCYP79D2與包括蒜頭果在內(nèi)的10個物種距離相近，其中和橡膠和麻風(fēng)樹關(guān)系最近。結(jié)構(gòu)分析表明，MeCYP79D2基因?qū)儆诩?xì)胞色素P450酶超家族和CYP79結(jié)構(gòu)域非特異性位點，含有一個保守的血紅素結(jié)合域，序列為FxxGxRxCxG[36]。生信分析結(jié)果顯示，該蛋白為為不穩(wěn)定的脂溶性親水蛋白，存在一個跨膜結(jié)構(gòu)，不含信號肽，具有38個潛在磷酸化修飾位點，二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主。MeCYP79D2主要在須根、葉柄、腋芽和塊根中表達。通過高氰苷含量與低氰苷含量的木薯種質(zhì)資源中MeCYP79D2基因表達量與氰苷含量的相關(guān)性分析得出二者存在極顯著正相關(guān)，是否可以作為高氰和低氰品種的功能標(biāo)記開發(fā)，有待進一步研究。

此外，氰苷在植物防御反應(yīng)中起著重要作用，同時受外界干旱、低溫等環(huán)境及內(nèi)源性激素變化的影響。茉莉酸及其衍生物茉莉酸甲酯（MeJA）是植物體內(nèi)重要的脂質(zhì)激素，參與調(diào)控生物脅迫和非生物脅迫下植物的生長發(fā)育過程[37]。茉莉酸含量的增加通常伴隨著防御相關(guān)基因的上調(diào)表達，產(chǎn)生具有防御功能的次級代謝產(chǎn)物，如萜類化合物、葡萄糖苷、黃酮類和花青素等[38-39]。昆蟲咬食和茉莉酸及其衍生物均可上調(diào)氰苷合成關(guān)鍵基因的表達[40-42]，表明氰苷的合成可能與茉莉酸密切相關(guān)。在本研究中，MeCYP79D2基因在MeJA作用下，表達量和氰苷含量均呈顯著性變化，說明MeCYP79D2基因參與茉莉酸激素的響應(yīng)影響氰苷合成。以上結(jié)果為后續(xù)相關(guān)基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，同時為深入研究木薯氰苷合成機制提供理論依據(jù)。

參考文獻

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[1]"lt;！--[endif]--gt;AMELEWORKnbsp;A"B，"BAIRU"M"W."Advances"in"genetic"analysis"and"breeding"of"cassava"（Manihot"esculenta"Crantz）："a"review[J]."Plants，"2022，"11（12）："1617.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[2]"lt;！--[endif]--gt;ROCHA"V"P"C，"GON?ALVES-VIDIGAL"M.C，"ORTIZ"A"H"T，"VALENTINI"G，"FERREIRA，"R"C"U，"GON?ALVES，"T"M，"LACANALLO"G"F，"VIDIGAL"FILHO"P"S."Population"structure"and"genetic"diversity"in"sweet"cassava"accessions"in"Paraná"and"Santa"Catarina，"Brazil[J]."Plant"Molecular"Biology"Reporter，"2020，"38："25-38.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[3]"lt;！--[endif]--gt;J?RGENSEN"K，"MORANT"A"V，"MORANT"M，"JENSEN"N"B，"OLSEN"C"E，"KANNANGARA"R，"MOTAWIA"M"S，"M?LLER"B"L，"BAK"S."Biosynthesis"of"the"cyanogenic"glucosides"linamarin"and"lotaustralin"in"cassava："isolation，"biochemical"characterization，"and"expression"pattern"of"CYP71E7，"the"oxime-metabolizing"cytochrome"P450"enzyme[J]."Plant"Physiology，"2011，"155（1）："282-292.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[4]"lt;！--[endif]--gt;鄒良平，"起登鳳，"孫建波，"彭明."木薯生氰糖苷研究進展[J]."熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，"2013，"33（10）："43-46.

ZOU"L"P，"QI"D"F，"SUN"J"B."PENG"M."Research"advances"on"cyanogenic"glycoside"in"cassava[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Agriculture，"2013，"33（10）："43-46."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[5]"lt;！--[endif]--gt;吳顯榮，"劉建衛(wèi)."植物體內(nèi)的生氰糖苷[J]."北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，"1984，"10（4）："345-352.

WU"X"R，"LIU"J"W."The"cyanogenic"glycosides"in"higher"plants[J]."Journal"of"China"Agricultural"University，"1984，"10（4）："345-352."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[6]"lt;！--[endif]--gt;沈培峰."木薯生氰葡萄糖苷酶（Linamarase）基因的克隆表達和酶學(xué)特性分析[D]."?？冢?海南大學(xué)，"2012.

SHEN"Pnbsp;F."Expression"and"enzymatic"properties"of"linamarase"in"cassava[D]."Haikou："Hainan"University，"2012."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[7]"lt;！--[endif]--gt;NELSON"D，"WERCK-REICHHART"D."A"P450-centric"view"of"plant"evolution[J]."Plant"Journal，"2011，"66（1）："194-211.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[8]"lt;！--[endif]--gt;高世璽，"戎梅，"彭俊祥，"徐艷紅，"魏建和."細(xì)胞色素P450在植物倍半萜類化合物生物合成中的作用研究進展[J]."藥學(xué)學(xué)報，"2023，"58（10）："1-19.

GAO"S"X，"RONG"M，"PENG"J"X，"XU"Y"H，"WEI"J"H."Research"progress"on"the"role"of"cytochrome"P450"in"plant"sesquiterpene"biosynthesis[J]."Acta"Pharmaceutica"Sinica，"2023，"58（10）："1-19."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[9]"lt;！--[endif]--gt;李永康，"馬雪祺，"馮婧嫻，"陳萬生，"孫連娜，"肖瑩."細(xì)胞色素P450酶在植物次生代謝產(chǎn)物生物合成中的研究進展[J]."分子植物育種，"2024，"22（7）："2179-2183.

LI"Y"K，"MA"X"Q，"FENG"Q"X，"CHEN"W"S，"SUN"L"N，"XIAO"Y."Advances"of"cytochr-ome"P450s"in"the"biosynthesis"of"plant"secondary"metabolites[J].""Molecular"Plant"Breeding，"2024，"22（7）："2179-2183."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[10]"lt;！--[endif]--gt;LAO"S"H，"HUANG"X"H，"HUANG"H"J，"LIU"C"W，"ZHANG"C"X，"BAO"Y"Y."Genomic"and"transcriptomic"insights"into"the"cytochrome"P450"monooxygenase"gene"repertoire"in"the"rice"pest"brown"planthopper[J]."Nilaparvata"Lugens，"Genomics，"2015，"106（5）："301-309.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[11]"lt;！--[endif]--gt;WASEEM"M，"HUANG"F，"WANG"Q，"ASLAM"M"M，"ABBAS"F，"AHMAD"F，"ASHRAF"U，"HASSAN"W，"FIAZ"S，"YE"X，"YU"L，"KE"Y."Identification，"methylation"profiling，"and"expression"analysis"of"stress-responsive"cytochrome"P450"genes"in"rice"under"abiotic"and"phytohormones"stresses[J]."GM"Crops"Food，"2021，"12（1）："551-563.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[12]"lt;！--[endif]--gt;司文潔，"吳林楠，"郭利建，"周夢蝶，"劉香利，"馬猛，"趙惠賢."小麥粒重相關(guān)基因TaCYP78A5功能標(biāo)記開發(fā)及驗證[J]."作物學(xué)報，"2019，"45（12）："1905-1911.

SI"W"J，"WU"Lnbsp;N，"GUO"L"J，"ZHOU"M"D，"LIU"X"L，"MA"M，"ZHAO"H"X."Development"and"validation"of"the"functional"marker"of"grain"weight-related"gene"TACYP78A5"in"wheat"（Triticum"aestivum"L.）[J]."Acta"Agronomica"Sinica，"2019，"45（12）："1905-1911."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[13]"lt;！--[endif]--gt;CHAKRABARTI"M，"ZHANG"N，"SAUVAGE"C，"MU?OS"S，"BLANCA"J，"CA?IZARES"J，"DIEZ"M"J，"SCHNEIDER"R，"MAZOUREK"M，"MCCLEAD"J，"CAUSSE"M，"VAN"DER"KNAAP"E."A"cytochrome"P450"regulates"a"domestication"trait"in"cultivated"tomato[J]."Proceedings"of"the"National"Academy"of"Sciences，"2013，"110（42）："17125-17130.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[14]"lt;！--[endif]--gt;何薈如，"林杰，"吳葉蝶，"潘泓靜，"彭志松，"蘇祝成."茶樹CsCYP79A1基因克隆及表達分析[J]."南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，"2021，"52（3）："641-650.

HE"H"R，"LIN"J，"WU"Y"D，"PAN"H"J，"PENG"Z"S，"SU"Z"C."Cloning"and"expression"analysis"of"CsCYP79A1"gene"in"tea"plant[J]."Journal"of"Southern"Agriculture，"2021，"52（3）："641-"650."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[15]"lt;！--[endif]--gt;劉易."中成藥中氰苷類有毒成分的篩查、定量測定和體外轉(zhuǎn)化研究[D]."北京："中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，"2016.

LIU"Y."Screening，"quantitative"determination"and"in"vitro"transformation"of"cyanide"glycosides"in"Chinese"patent"medicine[D]."Beijing："Academy"of"Military"Medical"Sciences，"2016."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[16]"lt;！--[endif]--gt;J?RGENSEN"K，"BAK"S，"BUSK"P"K，"S?RENSEN"C，"OLSEN"C"E，"PUONTI-KAERLAS"J，"M?LLER"B"L."Cassava"plants"with"a"depleted"cyanogenic"glucoside"content"in"leaves"and"tubers."distribution"of"cyanogenic"glucosides，"their"site"of"synthesis"and"transport，"and"blockage"of"the"biosynthesis"by"RNA"interference"technology[J]."Plant"Physiology，"2005，"139（1）："363-74.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[17]"lt;！--[endif]--gt;王琴飛，"林立銘，"張振文，"余厚美，"徐緩，"羊賢月."食用木薯塊根及其制品中生氰糖苷檢測方法的建立與應(yīng)用[J]."食品工業(yè)科技，"2022，"43（2）："271-278.

WANG"Q"F，"LIN"L"M，"ZHANG"Z"W，"YU"H"M，"XU"H，"YANG"X"Y."Establishment"and"application"of"a"method"for"detecting"the"cyanogenic"glycoside"in"sweet"cassava"root"and"its"products[J]."Science"and"Technology"of"Food"Industry，"2022，"43（2）："271-278."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[18]"lt;！--[endif]--gt;KUMAR"S，"STECHER"G，"AND"TAMURA"K."MEGA7："m ole cular"evolutionary"genetics"analysis"version"7.0"for"bigger"datasets[J]."Molecular"Biology"and"Evolution，"2016，"33："1870-1874.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[19]"lt;！--[endif]--gt;SAITOU"N，"AND"NEI"M."The"neighbor-joining"method："a"new"method"for"reconstructing"phylogenetic"trees[J]."Molecular"Biology"and"Evolution，"1987，"4："406-425.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[20]"lt;！--[endif]--gt;WILSON"M"C，"MUTKA"A"M，"HUMMEL"A"W，"BERRY"J，"CHAUHAN"R"D，"VIJAYARAGHAVAN"A，"TAYLOR"N"J，"VOYTAS"D"F，"CHITWOOD"D"H，"BART"R"S."Gene"expression"atlas"for"the"food"security"crop"cassava[J]."Wiley，"2017，"213："1632-1641.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[21]"lt;！--[endif]--gt;Narayanan"NN，"Ihemere"U，"Ellery"C，"Sayre"RT."Overexpression"of"hydroxynitrile"lyase"in"cassava"roots"elevates"protein"and"free"amino"acids"while"reducing"residual"cyanogen"levels[J]."PLoS"One，"2011，"6："e21996.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[22]"lt;！--[endif]--gt;Zidenga"T，"Leyva-Guerrero"E，"Moon"H，"Siri tu n ga"D，"Sayre"R"T."Extending"cassava"root"shelf"life"via"reduction"of"reactive"oxygen"species"production[J]."Plant"Physiology，"2012，"159："1396-1407.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[23]"lt;！--[endif]--gt;Zidenga"T，"Siritunga"D，"Sayre"R"T."Cyanogen"metabolism"in"cassava"roots："impact"on"protein"synthesis"and"root"development[J]."Frontiers"in"Plant"Science，"2017，"8："220.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[24]"lt;！--[endif]--gt;ABROL"Y"P，"CONN"E"E."Studies"on"cyanide"metabolism"in"Lotus"arabicus"L."and"Lotus"tenuis"L.[J]."Pergamon，"1966，"5（2）："535-538.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[25]"lt;！--[endif]--gt;ANDERSEN"M"D，"BUSK"P"K，"SVENDSEN"I，"M?LLER"B"L."Cytochromes"P450"from"cassava"（Manihot"esculenta"Crantz）"catalyzing"the"first"steps"in"the"biosynthesis"of"the"cyanogenic"glucosides"linamarin"and"lotaustralin："cloning，"functional"expression"in"Pichia"pastoris，"and"substrate"specificity"of"the"isolated"recombinant"enzymes[J]."The"Journal"of"Biological"Chemistry，"2000，"275（3）："1966-1975.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[26]"lt;！--[endif]--gt;DIMUTH"S，"RICHARD"S."Engineering"cyanogen"synthesis"and"turnover"in"cassava"（Manihot"esculenta）[J]."Plant"Molecular"Biology，"2004，"56（4）："661-669.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[27]"lt;！--[endif]--gt;TEICHER"V"B，"KUCHARSKI"N，"MARTIN"H"D，"VAN"DER"SAAG"P，"SIES"H，"STAHL"W."Biological"activities"of"apo-canthaxanthinoic"acids"related"to"gap"junctional"communication[J]."Archives"of"Biochemistry"and"Biophysics，"1999，"365（1）："150-155.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[28]"lt;！--[endif]--gt;FORSLUND"K，"MORANT"M，"J?RGENSEN"B，"OLSEN"C"E，"ASAMIZU"E，"SATO"S，"TABATA"S，"BAK"S."Biosynthesis"of"the"nitrile"glucosides"rhodiocyanoside"A"and"D"and"the"cyanogenic"glucosides"lotaustralin"and"linamarin"in"Lotus"japonicus[J]."Plant"Physiology，"2004，"135（1）："71-84.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[29]"lt;！--[endif]--gt;WITTSTOCK"U，"HALKIER"B"A."Glucosinolate"research"in"the"Arabidopsis"era[J]."Trends"in"Plant"Science，"2002，"7："263-270.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[30]"lt;！--[endif]--gt;McMahon"J，"White"W"L"B，"Sayre"R"T."Cyanogenesis"in"cassava"（Manihot"esculenta"Crantz）[J]."Journal"of"Experimental"Botany，"1995，"46："731-741.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[31]"lt;！--[endif]--gt;McMahon"J，"Sayre"R，"Zidenga"T."Cyanogenesis"in"ca s sa va"and"its"molecular"manipulation"for"crop"improveme nt[J]."Journal"of"Experimental"Botany，"2022，"73（7）："1853-1867.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[32]"lt;！--[endif]--gt;Sayre"R，"Beeching"J"R，"Cahoon"E"B，"Egesi"C，"Fau q uet"C，"Fellman"J，"Fregene"M，"Gruissem"W，"M a l lowa"S，"Manary"M，"Maziya-Dixon"B，"Mba n aso"A，"Schachtman"D"P，"Siritunga"D，"Taylor"N，"Vanderschuren"H，"Zhang"P."The"BioCassava"plus"pr og ram："biofortification"of"cassava"for"sub-Saharan"Africa[J]."Annual"Review"of"Plant"Biology，"2011，"62："251-"272.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[33]"lt;！--[endif]--gt;Gomez"M"A，"Berkoff"K"C，"Gill"B"K，"Iavarone"AT，"Lieberman"S"E，"Ma"J"M，"Schultink"A，"Karavolias"N"G，"Wyman"S"K，"Chauhan"R"D，"Taylor"N"J，"Staskawicz"B"J，"Cho"M"J，"Rokhsar"D"S，"Lyons"J"B."CRISPR-Cas9-mediated"knockout"of"CYP79D1"and"CYP79D2"in"cassava"attenuates"toxic"cyanogen"production[J]."Frontiers"in"Plant"Science，"2023，"17，"13："1079254.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[34]"lt;！--[endif]--gt;周偉堅，"陳忠正，"容顯初，"李潔宇."木薯氰化物合成限速酶CYP79D2基因克隆與序列分析[J]."中國農(nóng)學(xué)通報，"2008，"24（8）："121-125.

ZHOU"W"J，"CHEN"Z"Z，"RONG"X"C，"LI"J"Y."Cloning"and"alignment"of"the"CYP79D2"gene"encoding"the"committed"enzyme"in"the"synthesis"of"cyanogenic"glucoside"in"cassava"（Manihot"esculenta"Crantz）[J]."Chinese"Agricultural"Science"Bulletin，"2008，"24（8）："121-125."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[35]"lt;！--[endif]--gt;原曉龍，"陳中華，"李云琴，"王毅."一個與氰苷生物合成相關(guān)的植物CYP基因的克隆與表達分析[J]."分子植物育種，"2020，"18（7）："2182-2187.

YUAN"X"L，"CHEN"Z"H，"LI"Y"Q，nbsp;WANG"Y."Cloning"and"expression"analysis"of"a"plant"cytochrome"P450"gene"involved"in"the"biosynthesis"of"cyanogenic"glycoside[J]."Molecular"Plant"Breeding，"2020，"18（7）："2182-2187."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[36]"lt;！--[endif]--gt;楊杰."白樺CYP450的5個家族基因在三萜合成中的功能研究[D]."哈爾濱："東北林業(yè)大學(xué)，"2019.

YANG"J."Functional"analysis"in"triterpenoid"synthesis"of"five"CYP450"family"genes"in"Betula"platyphylla"Suk[D]."Harbin："Northeast"Forestry"University，"2019."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[37]"lt;！--[endif]--gt;黎家，"李傳友."新中國成立70年來植物激素研究進展[J]."中國科學(xué)："生命科學(xué)，"2019，"49（10）："1227-1281.

LI"J，"LI"C"Y."Seventy-year"major"research"progress"in"plant"hormones"by"Chinese"scholars[J]."Scientia"Sinica"（Vitae），"2019，"49（10）："1227-1281."（in"Chinese）

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[38]"lt;！--[endif]--gt;Geyter"ND，"Gholami"A，"Goormachtig"S，"Goos se ns"A."Transcriptional"machineries"in"jasmonate-elicited"plant"secondary"metabolism[J]."Trends"in"Plant"Science，"2012，"17："349-359.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[39]"lt;！--[endif]--gt;Falk"K"L，"K?stner"J，"Bodenhausen"N，"Schramm"K，"Meldau"S."The"role"of"lucosinolates"and"the"jasmonic"acid"pathway"in"resistance"of"Arabidopsis"thaliana"against"molluscan"herbivores[J]."Molecular"Ecology，"2014，nbsp;23："1188-1203.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[40]"lt;！--[endif]--gt;Salzman"R"A，"Brady"J"A，"Finlayson"S"A，"Buch an an"CD，"Summer"E"J，"Feng"S，"Klein"P"E，"Klein"R"R，"Pratt"L"H，"Marie-Michèle"C"P."Transcriptional"profiling"of"sorghum"induced"by"methyl"jasmonate，"salicylic"acid，"and"aminocyclopropane"carboxylic"acid"reveals"cooperative"regulation"and"novel"gene"responses[J]."Plant"Physiology，"2005，"138："352-368.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[41]"lt;！--[endif]--gt;Zhu-Salzman"K，"Salzman"R"A，"Ahn"J"E，"Koiwa"H."Transcriptional"regulation"of"sorghum"defense"determinants"against"a"phloem-feeding"aphid[J]."Plant"Physiology，"2004，"134："420-431.

lt;！--[if ！supportLists]--gt;[42]"lt;！--[endif]--gt;Chen"C，"Liu"F，"Zhang"K"X，"Niu"X"L，"Zhao"H，"Liui"Q"X，"Georgiev"M"I，"Xu"X"H，"Zhang"X"Q，"Zhou"M"L."Meja-responsive"bhlh"transcription"factor"ljbhlh7"regulates"cyanogenic"glucoside"biosynthesis"in"lotus"japonicus[J]."Journal"of"Experimental"Botany，"2022，"73："2650-2665.