木薯MePCS1基因的克隆、表達(dá)分析及功能驗(yàn)證

摘""要：植物絡(luò)合素合酶（PCS）是催化植物絡(luò)合素（PC）合成的關(guān)鍵酶，PC可通過絡(luò)合作用減輕重金屬對(duì)植物的毒害。土壤重金屬污染增加木薯食用安全風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)木薯絡(luò)合素合酶基因MePCS1進(jìn)行功能分析，對(duì)木薯重金屬減控研究具有重要意義。本研究通過PCR技術(shù)克隆了SC8木薯品種的MePCS1基因的編碼區(qū)，全長為1512"bp，共編碼503個(gè)氨基酸。蛋白序列分析表明：MePCS1蛋白為親水性蛋白，含有41個(gè)磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)糖基化位點(diǎn)，不含有信號(hào)肽。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，木薯MePCS1蛋白與橡膠樹的PCS蛋白親緣關(guān)系最近。利用qPCR技術(shù)分析表明，MePCS1基因在莖中表達(dá)量最高；在木薯塊根發(fā)育過程中，MePCS1基因在塊根膨大期的表達(dá)量最高；鉛（Pb）脅迫誘導(dǎo)MePCS1基因表達(dá)。MePCS1基因能提高BY4741酵母對(duì)Pb的耐受能力。本研究結(jié)果為進(jìn)一步解析MePCS1基因功能特性及其對(duì)木薯的Pb減控機(jī)制提供新的信息。

關(guān)鍵詞：植物絡(luò)合素合酶；重金屬Pb脅迫；酵母表達(dá)中圖分類號(hào)：S533""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cloning，"Expression"Analysis，"and"Functional"Verification"of"the"MePCS1"Gene"in"Cassava

LIANG"Baojuan1，2，3，"GE"Yujian1，2，3，"HOU"Jingyi1，2，"ZHANG"Huimin1，2，3，"REN"Zhixin1，2，3，"GENG"Mengting1，"WANG"Yajie2，3，"GUO"Jianchun2，3*，"YAO"Yuan2，3*

1."College"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Institute"for"Tropical"Agricultural"Resources"/"Key"Laboratory"for"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops"of"Hainan"Province，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"National"key"Laboratory"for"Tropical"Crop"Breeding，"Sanya，"Hainan"572000，"China

Abstract："Phytochelatin"synthase"（PCS）"is"a"key"enzyme"that"catalyzes"the"synthesis"of"phytochelatin"（PC）."PC"can"reduce"the"toxicity"of"heavy"metals"to"plants"through"complexation."Heavy"metal"pollution"in"soil"increases"the"risk"of"cassava"food"safety."It"is"of"great"significance"to"study"the"reduction"and"control"of"heavy"metals"in"cassava"by"analyzing"the"function"of"MePCS1"gene."In"this"study，"the"coding"region"of"MePCS1"gene"in"cassava"variety"SC8"was"cloned"by"PCR."The"full"length"was"1512"bp，"encoding"503"amino"acids."Protein"sequence"analysis"showed"that"MePCS1nbsp;protein"was"a"hydrophilic"protein，"containing"41"phosphorylation"sites"and"2"glycosylation"sites，"without"signal"peptide."The"phylogenetic"tree"showed"that"the"cassava"MePCS1"protein"had"the"closest"relationship"with"the"PCS"protein"of"the"rubber"tree."The"qPCR"analysis"showed"that"the"MePCS1"gene"had"the"highest"expression"level"in"the"stem."During"the"development"of"cassava"roots，"the"expression"level"of"MePCS1"gene"was"the"highest"in"the"root"enlargement"period."Lead"（Pb）"stress"induced"MePCS1"gene"expression."MePCS1"gene"can"improve"the"tolerance"of"BY4741"yeast"to"Pb."The"results"of"this"study"provide"new"information"for"further"analysis"of"the"functional"characteristics"of"the"MePCS1"gene"and"its"mechanism"for"reducing"Pb"in"cassava"tuber"roots.

Keywords："phytochelatin"synthases;"heavy"metal"Pb"stress;"yeast"expression

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.11.001

木薯（Manihot"esculenta"Crantz），又稱樹薯、南洋薯、木番薯，為大戟科多年生作物，是世界上10億人口的主要食物[1]。隨著人類工業(yè)化進(jìn)程的發(fā)展，土壤重金屬污染已經(jīng)成為全球的重大問題，危害著人類的身體健康和作物的糧食安全。木薯作為熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物與糧食作物，具有淀粉含量高、耐貧瘠等特點(diǎn)。塊根為木薯淀粉的主要貯藏器官，木薯受到重金屬污染后，金屬離子容易在木薯塊根中積累，導(dǎo)致木薯生長受限，產(chǎn)量降低。因此解析木薯響應(yīng)重金屬關(guān)鍵的基因，減少重金屬在木薯塊根的積累，對(duì)創(chuàng)制木薯新種質(zhì)、提高木薯食用的安全性具有十分重要的意義。

植物受到金屬脅迫后，植物絡(luò)合素（phytochelatins，"PC）可與金屬結(jié)合形成較穩(wěn)定的復(fù)合物，減輕金屬的毒害。植物絡(luò)合素的結(jié)構(gòu)一般為（γ-Glu-Cys）n-X（n=2～11，X為Gly、Clu、Cln、Ser和β-Ala的形式存在），以（γ-Glu-Cys）n-Gly的結(jié)構(gòu)較為常見，其中半胱氨酸Cys中（-SH）巰基可以與重金屬結(jié)合具有解毒功能。植物絡(luò)合素合酶（phytochelatin"synthases，"PCS）可催化GSH合成PC。目前對(duì)擬南芥[2]、豆類[3]、煙草[4]、水稻[5]的PCS研究較為深入，過表達(dá)PCS基因可增強(qiáng)植物對(duì)重金屬的耐受性。通過分析不同物種中PCS基因的啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)其含有多個(gè)順式作用的元件，說明PCS基因的表達(dá)受多種因素調(diào)控[6]。如轉(zhuǎn)錄因子MYB40可以誘導(dǎo)AtPCS1的表達(dá)，在As2+脅迫條件下擬南芥中AtMYB40被誘導(dǎo)表達(dá)，AtMYB40正調(diào)控AtPCS1表達(dá)[7]；水稻中Hg2+和Pb2+金屬離子可以誘導(dǎo)OsPCS7表達(dá)，Cd2+與Zn2+金屬離子可以誘導(dǎo)OsPCS9表達(dá)[8]；番茄葉片在Pb脅迫下，SlPCS1基因表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平[9]。

為了研究木薯MePCS1基因在金屬脅迫下的功能，本研究克隆了木薯MePCS1基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)的組織特異性分析、不同發(fā)育時(shí)期的塊根表達(dá)模式分析、重金屬Pb脅迫條件下的表達(dá)分析以及在酵母中的功能驗(yàn)證分析。為進(jìn)一步研究MePCS1基因參與金屬Pb脅迫的耐受性，減少重金屬脅迫對(duì)木薯的危害提供新的依據(jù)。

1""材料與方法

1.1""材料

供試材料華南8號(hào)木薯（SC8）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；酵母感受態(tài)BY4741、大腸桿菌感受態(tài)DH5α均購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購自成都福際生物技術(shù)有限公司；MonScript?"RTIII"Super"Mix"with"dsDNase（Two-Step）反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自莫納生物科技有限公司；PrimeSTAR"HS"（Premix）DNA"Polymerase高保真酶購自TaKaRa公司。

1.2""方法

1.2.1""MePCS1基因的克隆""提取SC8木薯總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)木薯MePCS1基因CDS區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以SC8木薯cDNA為模板，利用PrimeSTAR"HS（Premix）DNA"Polymerase高保真酶擴(kuò)增MePCS1基因。反應(yīng)體系為：PrimeSTAR"HS（Premix）DNA"Polymerase"25"μL，MePCS1-F/R引物1"μL，cDNA模板2"μL，ddH2O補(bǔ)充至總體積為50"μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4"℃預(yù)變性4"min；98"℃變性20"s，61"℃退火30"s，72"℃延伸1"min"40"s，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物于4"℃下保存。

1.2.2""木薯MePCS1蛋白理化性質(zhì)分析""對(duì)MePCS1的蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，所用軟件見表2。

1.2.3""MePCS1基因的表達(dá)模式分析""以田間種植6個(gè)月的SC8木薯塊根、須根、莖、葉柄、成熟葉、嫩葉、頂芽、腋芽等8個(gè)組織部位為材料，提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR（qRT-PCR）分析MePCS1基因的表達(dá)模式?；诒緦?shí)驗(yàn)室前期的SC8木薯塊根形成期（種植后的80"d）、塊根膨大期（種植后的130、180"d）、塊根成熟期（種植后的230、280"d）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)MePCS1基因在塊根不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行分析。

利用1.2"mmol/L"Pb（NO3）2處理種植60"d的SC8木薯組培苗移栽幼苗，分別脅迫處理0、3、6、12、24、48"h。提取處理后材料的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR（qRT-PCR）分析MePCS1基因的表達(dá)模式，反應(yīng)體系和程序參照LU等[10]的方法。使用SPSS"26軟件進(jìn)行鄧肯單因素多樣本差異顯著性方差分析。

1.2.4""MePCS1基因功能驗(yàn)證""（1）MePCS1基因酵母表達(dá)載體構(gòu)建。以擴(kuò)增出MePCS1基因PCR產(chǎn)物為模板，根據(jù)pYES2載體多克隆位點(diǎn)與MePCS1基因CDS序列設(shè)計(jì)含有同源重組接頭引物PYES2-MePCS1-F/R（表1），通過PCR將重組接頭引入該基因CDS區(qū)的兩端，純化回收目的片段。利用同源重組方法將純化MePCS1目的片段與線性化的酵母表達(dá)載體pYES2進(jìn)行重組，利用pYES2載體檢測(cè)引物PYES2-檢測(cè)-F/R進(jìn)行菌液PCR鑒定，選取陽性的大腸菌液進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序比對(duì)正確的陽性克隆菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒，新質(zhì)粒命名pYES2-MePCS1。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)BY4741中，PCR鑒定選出陽性菌斑，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5""MePCS1基因在酵母中的功能驗(yàn)證""將含有pYES2-MePCS1酵母菌液與空載pYES2酵母菌液分別在SD-Ura液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后，將初始OD600調(diào)至0.4，并逐級(jí)稀釋5個(gè)濃度梯度（10–1、10–2、10–3、10–4、10–5）；各取4"μL在含有50"mmol/L"Pb2+的SD-Ura（含有2%葡萄糖）固體培養(yǎng)基上進(jìn)行點(diǎn)板，30"℃倒置培養(yǎng)3"d，觀察含pYES2-MePCS1與空載pYES2酵母菌的生長情況。

2""結(jié)果與分析

2.1""木薯MePCS1基因的克隆

通過Blast搜索木薯基因組數(shù)據(jù)庫，獲得木薯MePCS1基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物克隆該基因的編碼區(qū)（CDS）。以SC8木薯組培苗的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得預(yù)期大小目的條帶（圖1）。將目的條帶進(jìn)行Sanger測(cè)序，發(fā)現(xiàn)MePCS1基因的CDS序列全長為1512"bp，共編碼503個(gè)氨基酸。

2.2""MePCS1蛋白的理化性質(zhì)分析

對(duì)木薯MePCS1蛋白的基本理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，其原子組成為C2456H3890N670O730S33，理論等電點(diǎn)為6.04，分子質(zhì)量為（Mw）55.54"kDa。該蛋白含有20種氨基酸殘基，Leu（L）的含量最高（58個(gè)），占11.5%；Trp（W）的含量最低（8個(gè)），占1.6%。在氨基酸正/負(fù)總殘基中，帶負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為61個(gè)，帶正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為53個(gè)。

MePCS1蛋白的總親疏水性平均值為0.136，推測(cè)該蛋白為親水性蛋白。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有41個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中Ser位點(diǎn)含量較高，為27個(gè)。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MePCS1蛋白可能含有2個(gè)糖基化位點(diǎn)。信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)，MePCS1含有信號(hào)肽的可能性為0.0021，因此推測(cè)該蛋白不含有信號(hào)肽。

2.3""系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了分析MePCS1蛋白與不同物種的PCS蛋白的親緣關(guān)系，使用DNAMAN軟件分析MePCS1與橡膠樹（Hevea"brasiliensis，"XP_021678313.2）、麻瘋樹（Jatropha"curcas，"XP_012085275.1）、蓖麻（Ricinus"communis，"XP_015581239.2）、烏桕（Triadica"sebifera，nbsp;ARV78463.1）、南歐大戟（Euphorbia"peplus，"WCJ38289.1）、楊柳（Salix"brachista，"kAB5527907.1）、毛楊果（Populus"trichocarpak，"AI5566116.1）、毛白楊（Populus"tomentosa，"kAG6750280.1）、大棗（Ziziphus"jujuba，"XP_015891301.1）、苦楝（Melia"azedarach，"kAJ4726927.1）、柑橘（Citrus"sinensisk，"DO60421.1）、芒果（Mangifera"indica，"XP_044491381.1）、長葉黃麻（Corchorus"olitorius，"OMP11136.1）、傘花草（Herrania"umbratica，"XP_021281249.1）、木槿（Hibiscus"syriacus，"XP_039005780.1）、棉花（Gossypium"barbadense，"kAB2057009.1）等其他16個(gè)物種的PCS蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，其氨基酸序列一致性為90.1%～"78.9%，其中N端區(qū)域高度保守（圖2）。MePCS1蛋白與橡膠樹PCS蛋白的同源性最高，達(dá)到90.1%。使用MEGE軟件進(jìn)行1000次的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，木薯MePCS1蛋白與橡膠樹的PCS蛋白親緣關(guān)系較近，其次為麻瘋樹、蓖麻、烏桕等植物，同棉花、木槿等植物的PCS蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。2.4""MePCS1基因在SC8木薯中的表達(dá)模式分析

2.4.1""MePCS1基因在不同組織器官的表達(dá)模式分析""采用熒光定量PCR技術(shù)分析MePCS1基因在木薯不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，木薯MePCS1基因在莖中的表達(dá)量最高，在塊根、須根、葉柄、成熟葉、嫩葉、頂芽、腋芽中的表達(dá)量無顯著差異（圖4）。

2.4.2""MePCS1基因塊根發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)模式分析""基于實(shí)驗(yàn)室前期的塊根發(fā)育不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析MePCS1基因在塊根中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，MePCS1基因主要在塊根膨大期（種植后的130、180"d）的表達(dá)量最高，在成熟塊根期（種植后的230、280"d）的表達(dá)量最低（圖5）。

2.5""MePCS1基因在Pb脅迫條件下表達(dá)水平分析

為了探究MePCS1基因表達(dá)對(duì)Pb脅迫的響應(yīng)，本研究采用1.2"mmol/L"Pb（NO3）2"脅迫處理木薯SC8幼苗，并通過熒光定量PCR分析根系中MePCS1基因在處理0、3、6、12、24、48"h時(shí)的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MePCS1基因快速響應(yīng)在Pb2+脅迫，3"h的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，且在6和12"h的表達(dá)量逐步提高，然后24"h和48"h的表達(dá)量顯著降低（圖6）。此結(jié)果表明MePCS1基因參與木薯對(duì)Pb2+脅迫的響應(yīng)。

2.6""MePCS1基因功能驗(yàn)證

2.6.1""MePCS1基因的酵母表達(dá)載體構(gòu)建""為了驗(yàn)證MePCS1基因的功能，本研究通過PCR將重組接頭引入該基因編碼區(qū)的兩端（圖7A），并通過同源重組將MePCS1與線性化的酵母表達(dá)載體pYES2連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸，菌液PCR篩選

陽性克隆，獲得正確的pYES2-MePCS1質(zhì)粒（圖7B）。將pYES2-MePCS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BY4741酵母，在SD-Ura固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得單菌落后進(jìn)行酵母菌斑PCR鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增獲得與預(yù)期片段大小相同的條帶（約1500"bp），表明pYES2-"MePCS1質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到BY4741酵母中（圖7C）。

2.6.2""MePCS1基因在酵母中的功能驗(yàn)證""將含有pYES2-MePCS1、pYES2質(zhì)粒的酵母菌液，梯度稀釋后點(diǎn)在含有Pb2+的SD-Ura（含有2%半乳糖）固體培養(yǎng)基上，分析酵母的生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不含有Pb2+的培養(yǎng)基上，2種酵母菌的長勢(shì)一致，而在含有50"mmol/L"Pb2+的培養(yǎng)基上，含有pYES2-MePCS1的酵母菌株長勢(shì)優(yōu)于空載pYES2酵母菌株（圖8）。結(jié)果表明MePCS1基因可提高酵母對(duì)Pb2+的抗性。

3""討論

Pb是一種重金屬污染物，對(duì)植物和人體均有嚴(yán)重危害。在植物體內(nèi)，Pb可以抑制多種酶的活性，干擾光合作用和水分吸收，導(dǎo)致生長受阻和生理功能紊亂[11]。此外，Pb還可以通過干擾礦質(zhì)營養(yǎng)吸收，影響植物的營養(yǎng)平衡[12]。對(duì)人體而言，Pb主要通過食物鏈累積，長期攝入會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性，特別是對(duì)兒童可能導(dǎo)致學(xué)習(xí)障礙和身心活動(dòng)受限等問題[13]。Pb還可以損害腎臟功能，增加心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[14]。PCS1基因是植物體內(nèi)合成植物螯合素的關(guān)鍵酶，在減輕Pb的毒性效應(yīng)方面具有重要作用[15]。本研究克隆了木薯MePCS1基因，基因編碼區(qū)為1512"bp，共編碼503個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，MePCS1蛋白為親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)且不含有信號(hào)肽。木薯MePCS1蛋白與橡膠樹、麻風(fēng)樹PCS蛋白的親緣關(guān)系較近，以上3個(gè)物種均為大戟科植物。MePCS1基因主要在木薯莖中表達(dá)，以及在塊根形成期和塊根膨大期表達(dá)。植物受到Pb、Cd等重金屬脅迫時(shí)，PCS1基因的表達(dá)通常會(huì)上調(diào)，以增強(qiáng)植物對(duì)重金屬的耐受性。Cd脅迫可誘導(dǎo)雀稗PvPCS1和PvPCS2[16]、大麻BnPCS1基因表達(dá)上升[17]。藍(lán)藻CaPCS基因被AS脅迫誘導(dǎo)[18]；馬鈴薯StPCS受重金屬Pb、Cd、Cu、Zn誘導(dǎo)表達(dá)[19]；Pb脅迫木薯幼苗發(fā)現(xiàn)，脅迫6、12"h后MePCS1基因的表達(dá)量顯著上升，24"h后表達(dá)量降低，表明該基因的表達(dá)受Pb脅迫的誘導(dǎo)，參與木薯對(duì)Pb脅迫的響應(yīng)。

在酵母細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)是驗(yàn)證植物重金屬脅迫響應(yīng)相關(guān)基因功能的有效手段。水稻金屬伴侶OsHIPP17、OsHIPP19可增強(qiáng)酵母對(duì)Cd的耐受性[20]；苦蕎麥FtPCS、FtMTPC2、FtPCSL、FtVCE1a、FtNramp3可增強(qiáng)酵母對(duì)Pb的耐受性[21]。本研究將MePCS1基因克隆到pYES2酵母表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到酵母菌株BY4741，分析轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)Pb脅迫（50"mmol/L）的耐受性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MePCS1基因可提高酵母對(duì)金屬Pb的耐受能力，因此推測(cè)MePCS1基因可提高木薯對(duì)Pb脅迫的抗性。在未來的研究工作中，將利用過量表達(dá)和基因編輯技術(shù)，進(jìn)一步鑒定MePCS1基因功能特性，并篩選低Pb積累的木薯新種質(zhì)，以提高木薯食用的安全性。

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