火龍果潰瘍病對(duì)果皮組織微生物群落特征的影響

關(guān)鍵詞：火龍果；潰瘍病；果皮組織；內(nèi)生細(xì)菌；內(nèi)生真菌；群落多樣性

中圖分類號(hào)：S436.67 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

生態(tài)系統(tǒng)中的微生物群落由各種復(fù)雜的分類群組合而成，這些分類群在它們之間以及與它們所占據(jù)的生態(tài)位中的宿主之間存在有益、中性或有害的相互作用[1-4]。在植物系統(tǒng)中，這些微生物群落存在于植物組織和器官的表面或內(nèi)部，它們與宿主相互作用，共同進(jìn)化[5-6]。研究顯示，植物地上部病害與其微生物群落的關(guān)系緊密，因而對(duì)植物地上部分微生物群落尤其是植物葉部病害與相關(guān)葉部微生物群落的研究逐年增多[7]。然而，對(duì)果實(shí)微生物的研究更多集中在采后儲(chǔ)存過(guò)程和加工過(guò)程中[8-9]，對(duì)果實(shí)采收前發(fā)生病害時(shí)相關(guān)微生物群落的研究則鮮有報(bào)道，對(duì)果實(shí)微生物群落特征的認(rèn)識(shí)還非常有限。

火龍果（Hylocereus undatus）因其特別的外觀，且富含膳食纖維、維生素和抗氧化物質(zhì)，具有獨(dú)特的風(fēng)味和口感，以及糖含量低等優(yōu)點(diǎn)備受大眾歡迎，是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶水果。2021 年，中國(guó)的火龍果產(chǎn)量超過(guò)160 萬(wàn)t，超過(guò)越南成為最大的火龍果生產(chǎn)國(guó)[10]。然而，中國(guó)、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、以色列和美國(guó)等世界火龍果主產(chǎn)區(qū)曾先后報(bào)道受到潰瘍病的嚴(yán)重威脅[11-16]?；瘕埞麧儾∈怯山z狀真菌新暗色柱節(jié)孢（Neoscytalidi umdimidiatum）引起的一種極具破壞性的病害，可顯著降低火龍果的產(chǎn)量和質(zhì)量，導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失。該病原菌早期侵染火龍果的嫩莖和幼果，其癥狀包括幼嫩的莖、果皮及其鱗片出現(xiàn)圓形凹陷的褪綠病斑。隨后病斑逐漸轉(zhuǎn)為橘黃色，并且逐漸擴(kuò)大形成褐色突起。如果不加以控制，病斑將迅速蔓延至整個(gè)莖部和果實(shí)，果實(shí)內(nèi)部出現(xiàn)潰爛。在高溫高濕的環(huán)境條件下，潰瘍病發(fā)生更嚴(yán)重，擴(kuò)散更迅速，甚至危害整個(gè)果園[11-16]。研究表明，由于嫩莖的蠟質(zhì)層表面凹凸不平，細(xì)胞排列疏松，褶皺增多，有利于病原菌新暗色柱節(jié)孢的附著與定殖[17-18]。新暗色柱節(jié)孢感染可導(dǎo)致莖組織的多酚含量、丙二醛含量和過(guò)氧化物酶活性均降低[17-18]?？梢?jiàn)，新暗色柱節(jié)孢感染破壞了宿主植株正常的生理生化過(guò)程，從而對(duì)宿主生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍病發(fā)生初期，莖部組織的真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，真菌群落多樣性顯著下降，一些病理營(yíng)養(yǎng)型真菌富集可能促進(jìn)莖潰瘍病的發(fā)生[19]。而有關(guān)果實(shí)潰瘍病早期的果皮組織內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究尚無(wú)報(bào)道。

通?；瘕埞l(fā)生潰瘍病初期正處在青果期，為了分析果實(shí)潰瘍病發(fā)生初期的果皮微生物群落結(jié)構(gòu)特征，本研究采集火龍果青果期的健康果果皮和罹病果皮，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)果皮組織的內(nèi)生細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序分析，旨在通過(guò)分析潰瘍病初期果皮組織相關(guān)內(nèi)生微生物群落種類和多樣性，探討微生物群落在潰瘍病發(fā)生初期的作用，為解析果實(shí)病害的發(fā)生提供新思路，也為有針對(duì)性地預(yù)防和控制火龍果潰瘍病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試火龍果為金都一號(hào)品種，種植于廣西南寧市廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科學(xué)研究基地的火龍果種植園（108°12′56″E， 23°14′44″N）?；瘕埞N植園采用水泥柱式種植模式，行距2.5 m，柱距2.0 m，2個(gè)水泥柱間立4 個(gè)木柱，每個(gè)水泥柱和木柱各種2 株火龍果。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 于2021年10月采集果實(shí)樣品。

在種植園內(nèi)選擇3 行均處于青果期、果實(shí)大小一致的火龍果作為采樣行。在每一采樣行隨機(jī)選取6 株植株，每株剪下2 個(gè)果皮潰瘍病病斑面積占整個(gè)果實(shí)面積的6%～15%的青皮果，將這12 個(gè)罹病果裝入同一個(gè)無(wú)菌采樣袋，作為1 個(gè)重復(fù)樣品，按照此法分別采集另外2 個(gè)重復(fù)的樣品。在同一行隨機(jī)選取6 株長(zhǎng)勢(shì)良好果實(shí)無(wú)病斑的健康植株，剪下與罹病果實(shí)大小相近的12 個(gè)健康果裝入同一個(gè)無(wú)菌采樣袋，作為1 個(gè)重復(fù)樣品，按照此法分別采集另外2 個(gè)重復(fù)的樣品。將果實(shí)樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，用滅菌水將果皮表面沖洗干凈，在超凈臺(tái)用75%酒精沖洗表面3 次，晾干。剝下果皮，用滅菌剪刀剪下罹病果皮病斑區(qū)域組織，并剪為1 cm×1 cm 的小片，每個(gè)重復(fù)樣品各取2 g，3 個(gè)重復(fù)的樣品依次編號(hào)為Fs₁、Fs₂、Fs₃。用同樣方法，剪下健康果果皮組織，每個(gè)重復(fù)樣品各取2 g，3 個(gè)重復(fù)的樣品依次編號(hào)為Fh₁、Fh₂、Fh₃。樣品保存于?80 ℃，待提取微生物基因組DNA。

1.2.2 樣品DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序采用 E.Z.N.A.?Soil DNA 提取試劑盒（美國(guó)Omega Bio-Tek 公司）提取果皮組織樣品微生物基因組DNA，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 完整度，使用超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000（美國(guó)ThermoFisherScientific 公司）分析DNA 的純度和濃度。使用引物799F（5‘-AACMGGATTAGATACCCKG-3‘）和1392R（5‘-ACGGGCGGTGTGTRC-3‘）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增樣品細(xì)菌16S rDNA 的V5-V7 區(qū)；使用引物ITS1（5‘-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3‘）和ITS2（5‘-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3‘）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增樣品真菌的ITS1 區(qū)。使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（美國(guó)Axygen 公司）純化PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成擴(kuò)增子文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序，構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù)后在Illumina MiSeq PE300平臺(tái)上對(duì)微生物DNA 片段的雙端（paired-end）進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行樣品拆分后，使用fastp 和FLASH 軟件對(duì)雙端讀段（reads）進(jìn)行引物去除、質(zhì)量過(guò)濾、去噪、拼接和嵌合體去除等步驟，使用序列降噪方法（DADA2/Deblur 等）處理數(shù)據(jù)[20-21]，分別獲得細(xì)菌樣品和真菌樣品的擴(kuò)增子序列變體（amplicon sequence variant， ASV）的代表序列和豐度信息。分別按細(xì)菌樣品和真菌樣品的最小序列數(shù)對(duì)各樣品細(xì)菌和真菌序列數(shù)進(jìn)行抽平，抽平后的序列進(jìn)行下一步分析。將來(lái)源于細(xì)菌樣品的ASV 代表序列比對(duì)Silva138/16S 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種分類注釋，從而獲得每個(gè)樣品中細(xì)菌群落在各分類水平的具體組成。將來(lái)源于真菌樣品的ASV 代表序列比對(duì)Unite 數(shù)據(jù)庫(kù)v8.0[22]進(jìn)行物種分類注釋，從而獲得每個(gè)樣品中真菌群落在各分類水平的具體組成。基于ASV 代表序列和豐度信息，進(jìn)行群落多樣性分析（alpha 多樣性和beta 多樣性）、物種差異分析和菌群功能預(yù)測(cè)分析等。用Mothurv1.3 軟件[23]計(jì)算Chao1 指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)及覆蓋率等alpha 多樣性指數(shù)，用Student’sT-test 檢驗(yàn)2 組間指數(shù)差異顯著性；用R 軟件包vegan 完成主坐標(biāo)分析（ principal coordinatesanalysis， PCoA）， 即beta 多樣性分析； 使用FAPROTAX 軟件（1.2.1）[24]和BugBase 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//bugbase.cs.umn.edu/index.html）分別預(yù)測(cè)內(nèi)生細(xì)菌群落的生物化學(xué)循環(huán)功能和表型特征；使用FUNGuild 軟件（v1.0）完成內(nèi)生真菌群落的營(yíng)養(yǎng)型預(yù)測(cè)[25]；用Welch’s T-test 檢驗(yàn)2 組間物種差異顯著性和預(yù)測(cè)功能類群差異顯著性。在美吉生物云交互式分析平臺(tái)（ http：//www.majorbio.com）完成上述測(cè)序數(shù)據(jù)處理及分析。通過(guò)jvenn在線服務(wù)器（ http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）完成韋恩圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康果與罹病果的果皮組織微生物群落多樣性分析

對(duì)健康果及罹病果果皮組織樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、質(zhì)控、優(yōu)化和去噪后，2 組6 個(gè)樣品共得到191 991 條細(xì)菌代表性序列及357 656 條真菌代表性序列，每個(gè)樣品細(xì)菌平均序列數(shù)為31 999 條，真菌平均序列數(shù)為59 609 條。將各樣品的細(xì)菌和真菌序列數(shù)分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后， 再聚類生成擴(kuò)增子序列變體（amplicon sequence variant， ASV）。以序列之間相似性為100%定義為1 個(gè)ASV，此次序列聚類共得到1751 個(gè)細(xì)菌ASVs 和475 個(gè)真菌ASVs，所有樣品覆蓋率都在99.9%以上（表1，表2），說(shuō)明這些數(shù)據(jù)可以真實(shí)反映樣品內(nèi)微生物群落的多樣性。

通過(guò)計(jì)算2組樣品的多樣性指數(shù)，結(jié)果表明，2組果皮組織樣品中內(nèi)生細(xì)菌與真菌群落的alpha多樣性指數(shù)均無(wú)顯著差異：健康果的細(xì)菌與真菌豐富度指數(shù)（Chao1 指數(shù)）均低于罹病果，多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)）略高于罹病果，優(yōu)勢(shì)菌群指數(shù)（辛普森指數(shù)）略低于罹病果（表2）。表明果實(shí)潰瘍病發(fā)病初期微生物菌群多樣性雖然有變化，但差異不顯著。

基于ASV 繪制的韋恩圖顯示，健康果及罹病果2組果皮組織樣品共檢測(cè)到1751個(gè)細(xì)菌ASV，共有ASV 數(shù)為276個(gè)，共有ASV在健康果及罹病果的相對(duì)豐度之和分別為54.24%和55.49%。健康果的特有細(xì)菌ASV 數(shù)為693個(gè)，比罹病果少89個(gè)（圖1A）。健康果及罹病果果皮共檢測(cè)到475個(gè)真菌ASV，2組共有ASV 數(shù)為109個(gè)，共有ASV 在健康果及罹病果的相對(duì)豐度之和分別為90.29%和91.14%。健康果的特有真菌ASV數(shù)為145個(gè)，比罹病果的特有真菌ASV 少76個(gè)（圖1B）。以上結(jié)果表明，罹病果比健康果具有更多的細(xì)菌與真菌ASV數(shù)，2組間細(xì)菌ASV數(shù)量差異較大，真菌ASV數(shù)量差距較小，但2 組之間ASV的比例差距都不大。

本研究基于ASV 水平，通過(guò)主坐標(biāo)分析（PCoA）來(lái)比較2 組果皮樣品中內(nèi)生細(xì)菌群落和真菌群落的beta 多樣性差異。結(jié)果顯示，雖然健康果和罹病果的內(nèi)生細(xì)菌群落構(gòu)成產(chǎn)生分離，但是差異不顯著。與細(xì)菌群落構(gòu)成相比，健康果和罹病果的內(nèi)生真菌群落構(gòu)成產(chǎn)生的分離更明顯，但也未達(dá)到顯著水平；與健康果樣品之間離散距離相比，罹病果樣品之間的離散距離較小（圖2）?？梢?jiàn)，與健康果果皮組織內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)相比，罹病果的果皮組織內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)有發(fā)生改變的趨勢(shì)，且罹病果樣品之間的內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)差異性小于健康果。

2.2 健康果與罹病果果皮的微生物群落組成

由表1 可知，健康果及罹病果兩組果皮組織樣品共鑒定到內(nèi)生細(xì)菌29 門73 綱155 目285 科551屬719 種 1751 個(gè)ASVs，共鑒定到內(nèi)生真菌6 門21 綱53 目121 科200 屬268 種475 個(gè)ASVs。結(jié)果顯示，健康果果皮組織的內(nèi)生細(xì)菌及內(nèi)生真菌種類數(shù)量均低于罹病果果皮組織，2 組間的內(nèi)生細(xì)菌種類數(shù)量差距較大。

2.2.1 門水平 在細(xì)菌門水平上，健康果有7 個(gè)相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，相對(duì)豐度由高到低依次為：變形菌門（Proteobacteria， 48.53%）、放線菌門（Actinobacteriota， 14.70% ）、厚壁菌門（Firmicutes， 13.77%）、擬桿菌門（Bacteroidota，7.15%）、異球菌門（Deinococcota， 4.39%）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota， 2.49%）和綠彎菌門（Chloroflexi， 1.15%），這些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門的相對(duì)豐度總和為92.18%；罹病果有6 個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，相對(duì)豐度由高到低依次為：變形菌門（26.96%）、厚壁菌門（25.20%）、脫硫桿菌門（13.54%）、擬桿菌門（13.13%）、放線菌門（5.56%）和異球菌門（1.28%），這些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門的相對(duì)豐度總和為85.67%。其中，罹病果的變形菌門、放線菌門和異球菌門的相對(duì)豐度顯著低于健康果，脫硫桿菌門的相對(duì)豐度顯著高于健康果（表3）。在真菌門水平上，健康果有4 個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌門，相對(duì)豐度由高到低依次為：子囊菌門（Ascomycota， 63.23%）、真菌未鑒定門（unclassified_k__Fungi， 27.30%）、擔(dān)子菌門（ Basidiomycota， 7.75%） 和毛霉門（Mucoromycota， 1.70%），這些優(yōu)勢(shì)真菌門的相對(duì)豐度總和為99.98%；罹病果優(yōu)勢(shì)真菌門數(shù)量比健康火龍果少1 個(gè)，且均與健康果共有，相對(duì)豐度由高到低依次為：真菌未鑒定門（56.06%）、子囊菌門（40.67%）和擔(dān)子菌門（2.68%），這些優(yōu)勢(shì)真菌門的相對(duì)豐度總和為99.41%。其中，罹病果的真菌未鑒定門的相對(duì)豐度顯著高于健康果，子囊菌門相對(duì)豐度顯著低于健康果（表3）。

2.2.2 屬水平 在細(xì)菌屬水平，健康果與罹病果共注釋到551個(gè)細(xì)菌屬，共有細(xì)菌屬225 個(gè)，罹病果特有細(xì)菌屬188個(gè)，比健康果多50 個(gè)。健康果的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有17個(gè)， 相對(duì)豐度總和為61.96%，罹病果的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有14個(gè)，相對(duì)豐度總和為36.85%；與罹病果相比，健康果的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬更具有有代表性。健康果和罹病果共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬8 個(gè)，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬及其相對(duì)豐度分別為：甲基桿菌屬群（Methylobacterium-Methylorubrum）5.20%和2.33%、芽孢桿菌屬（Bacillus）4.71%和3.55%、地桿菌屬（Geobacter）2.31%和4.37%、絨毛桿菌科未分類屬（norank_f__Muribaculaceae）2.12%和2.73%、馬賽菌屬（Massilia）1.94%和2.98%、叢毛單胞菌科未知屬（unclassified_f__Comamonadaceae ） 1.66% 和2.45%、擬桿菌屬（ Bacteroides ） 1.53%和1.27%以及乳桿菌屬（Lactobacillus）1.27%和1.07%。在健康果的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中，相對(duì)豐度顯著高于罹病果的有鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、異球菌屬（Deinococcus）、微桿菌屬（Microbacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、草酸桿菌科未知屬（unclassified_f__Oxalobacteraceae）、短小桿菌屬（Curtobacterium）、動(dòng)球菌屬（Kineococcus）和金色單胞菌屬（Aureimonas）；在罹病果的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中，相對(duì)豐度顯著高于健康果的有布赫納氏菌屬（Buchnera）和互營(yíng)桿菌屬（Syntrophobacter）（圖3A）。表明火龍果在感染潰瘍病初期，隨著屬水平細(xì)菌豐富度的增加，屬水平細(xì)菌的占比逐漸下降。

在真菌屬水平，健康果與罹病果共注釋到200個(gè)真菌屬，兩組共有真菌屬90 個(gè)，罹病果特有真菌屬68 個(gè)，比健康果多26 個(gè)。健康果的優(yōu)勢(shì)真菌屬有14 個(gè)，相對(duì)豐度總和為92.75%，罹病果的優(yōu)勢(shì)真菌屬有9 個(gè)，相對(duì)豐度總和為87.02%；健康果和罹病果的優(yōu)勢(shì)真菌屬種類和比例可以反映各組真菌群落的組成和多樣性。健康果和罹病果共有優(yōu)勢(shì)真菌屬7 個(gè)，優(yōu)勢(shì)真菌屬及其相對(duì)豐度分別為：真菌界未知屬（unclassified_k__Fungi）27.30%和56.06%、叢赤殼科未知屬（unclassified_f__Nectriaceae）13.83%和1.64%、枝孢屬（Cladosporium）13.51%和15.18%、鏈格孢屬（Alternaria）6.50%和3.09%、輪枝菌屬（Gibellulopsis）6.16%和2.83%、亞隔孢殼科未知屬（unclassified_f__Didymellaceae）2.95%和3.97%以及球腔菌科未知屬（unclassified_f__Phaeosphaeriaceae）1.43%和1.01%。在健康果的優(yōu)勢(shì)真菌屬中，相對(duì)豐度顯著高于罹病果的有叢赤殼科未知屬和刺盤孢屬（Colletotrichum），而在罹病果未鑒定到健康果優(yōu)勢(shì)菌屬阿澤拉霉屬（Arxiella）的序列。在罹病果的優(yōu)勢(shì)真菌屬中，只有真菌界未知屬的相對(duì)豐度顯著高于健康果（圖3B）。另外，在罹病果鑒定到新暗色柱節(jié)孢歸屬的柱節(jié)孢屬（Neoscytalidium）的比例不高，平均相對(duì)豐度僅為0.36%，但在健康果未鑒定到柱節(jié)孢屬的序列（圖3B）。

2.2.3 微生物群落的LEfSe 分析 利用線性判別分析（ linear discriminant analysis effect size，LEfSe）方法獲得指示健康果和罹病果2 組樣品中差異的微生物類群。結(jié)果顯示，LDA評(píng)分大于4時(shí)，健康果的內(nèi)生細(xì)菌指示類群豐富，不同分類水平共4 個(gè)分支的細(xì)菌類群顯著富集在健康果上，分別是放線菌門2 個(gè)分支（從放線菌門到微桿菌科短小桿菌屬和微桿菌屬；從放線菌門到動(dòng)球桿菌科動(dòng)球桿菌屬）、變形菌門1個(gè)分支（從變形菌門到γ 變形菌綱假單胞菌屬）和鞘氨醇單胞菌屬；而罹病果內(nèi)生細(xì)菌只有1個(gè)指示類群，即擬桿菌目（圖4A）。

與內(nèi)生細(xì)菌分析結(jié)果相似，LDA 評(píng)分大于4時(shí)，健康果的內(nèi)生真菌指示類群更豐富一些，不同分類水平共4 個(gè)分支的真菌類群富集在健康果上，分別是子囊菌門2 個(gè)分支[從子囊菌門到肉座菌目（Hypocreales）叢赤殼科未知屬和球孢霉目（Glomerellales）刺盤孢屬]、擔(dān)子菌門2個(gè)分支[從擔(dān)子菌門到漢納酵母屬（Hannaella）和彎孢霉屬（Curvularia）]；而罹病果富集了3個(gè)分支，分別是真菌未鑒定門（從真菌未鑒定門到真菌未鑒定屬）、畸球腔菌科（Teratosphaeriaceae）（從畸球腔菌科到Pseudoteratosphaeria 屬）以及葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）。由于火龍果潰瘍病菌隸屬于葡萄座腔菌科柱節(jié)孢屬，進(jìn)一步降低LDA 評(píng)分查找，發(fā)現(xiàn)柱節(jié)孢屬的LDA 評(píng)分為3.60，且葡萄座腔菌科只有從葡萄座腔菌科到柱節(jié)孢屬1個(gè)分支的LDA評(píng)分大于2（圖4B）。

2.3 健康果與罹病果果皮微生物功能預(yù)測(cè)

基于FAPROTAX預(yù)測(cè)表明，健康果和罹病果果皮組織的內(nèi)生細(xì)菌類群功能分別有42 種和46種。在健康果樣品中基因表達(dá)量前10 的細(xì)菌類群功能有：化學(xué)異養(yǎng)（chemoheterotrophy）、需氧化學(xué)異養(yǎng)（aerobic chemoheterotrophy）、鐵呼吸（ironrespiration）、尿素分解（ureolysis）、發(fā)酵（fermentation）、甲基營(yíng)養(yǎng)（methylotrophy）、甲醇氧化（methanol oxidation）、動(dòng)物寄生物或共生物（animalparasites or symbionts）、硝酸鹽還原（nitratereduction）以及人類病原體（human pathogensall）。在罹病果樣品中基因表達(dá)量前10的細(xì)菌類群功能為：化學(xué)異養(yǎng)、鐵呼吸、需氧化學(xué)異養(yǎng)、發(fā)酵、尿素分解、硫化物呼吸（respiration of" sulfurcompounds）、硫呼吸（sulfate respiration）、硝酸鹽還原、動(dòng)物寄生物或共生物以及芳香化合物降解（aromatic compound degradation）（圖5）。其中，健康果的化學(xué)異養(yǎng)、需氧化學(xué)異養(yǎng)、甲基營(yíng)養(yǎng)以及甲醇氧化功能的基因表達(dá)量顯著高于罹病果，發(fā)酵、硫化物呼吸、硫呼吸以及芳香化合物降解功能的基因表達(dá)量顯著低于罹病果。

基于BugBase 預(yù)測(cè)表明，健康果和罹病果的內(nèi)生細(xì)菌類群有9 種微生物表型，包括好氧（ aerobic）、厭氧（anaerobic ）、兼性厭氧（ facultatively anaerobic ）、革蘭氏陽(yáng)性（grampositive）、革蘭氏陰性（gram negative）、生物膜形成（forms biofilms）、潛在致病性（potentiallypathogenic）、可移動(dòng)元件（contains mobile elements）及脅迫耐受（stress tolerant）。與健康果相比，罹病果內(nèi)生細(xì)菌群落的革蘭氏陰性和潛在致病性類群的平均相對(duì)豐度較高，而革蘭氏陽(yáng)性和好氧類群的平均相對(duì)豐度較低（圖6）。

通過(guò)比對(duì)FUNGuild 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)健康果和罹病果內(nèi)生真菌類群的營(yíng)養(yǎng)型進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，健康果的優(yōu)勢(shì)營(yíng)養(yǎng)型比例由高到低依次為病理-腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型（ pathotroph-saprotroph-symbiotroph，25.87%）、腐生營(yíng)養(yǎng)型（saprotroph， 18.16%）、病理營(yíng)養(yǎng)型（pathotroph， 14.36%）、病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型（pathotroph-saprotroph， 7.29%）和病理-共生營(yíng)養(yǎng)型（pathotroph-symbiotroph， 5.41%）。罹病果的優(yōu)勢(shì)營(yíng)養(yǎng)型比例由高到低依次為病理-腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型（20.74%）、腐生營(yíng)養(yǎng)型（6.80%）、病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型（6.43%）和病理營(yíng)養(yǎng)型（5.45%）。健康果的腐生營(yíng)養(yǎng)型、病理營(yíng)養(yǎng)型和病理-共生營(yíng)養(yǎng)型的平均相對(duì)豐度均高于罹病果（圖7）

3 討論

潰瘍病對(duì)火龍果的生產(chǎn)破壞性很大。在潰瘍病發(fā)生早期，病原菌新暗色柱節(jié)孢在嫩莖和幼果中定殖，然后逐漸擴(kuò)散到整個(gè)莖部和果實(shí)內(nèi)部，果實(shí)在成熟前潰爛開裂，嚴(yán)重影響火龍果的產(chǎn)量和品質(zhì)，也影響火龍果的采后儲(chǔ)運(yùn)[26]。對(duì)果實(shí)進(jìn)行微生物組高通量測(cè)序，可獲得大量微生物群落結(jié)構(gòu)信息，為系統(tǒng)研究病原菌的侵染、病害發(fā)生和防控提供依據(jù)[27]。本研究結(jié)果顯示，在潰瘍病發(fā)生早期，罹病果果皮組織的內(nèi)生細(xì)菌類群種類比健康果多，而多樣性略低于健康果，但均未達(dá)到顯著差異。健康果果皮中最豐富的內(nèi)生細(xì)菌門是變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、異球菌門和脫硫桿菌門，在潰瘍病發(fā)生初期，變形菌門、放線菌門和異球菌門的豐度顯著下降，而脫硫桿菌門的豐度顯著上升。變形菌門能有效利用植物分泌物，在提高自身類群相對(duì)比例的同時(shí)，也提高宿主的營(yíng)養(yǎng)吸收和抗性[28]。而放線菌門是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，如抗生素和拮抗物質(zhì)，其功效已在不同的土壤和海洋來(lái)源菌株中得到證明[29]。異球菌門對(duì)高溫有較強(qiáng)的耐受力，如環(huán)礁湖珊瑚具有較強(qiáng)的熱適應(yīng)性，是因?yàn)轶w內(nèi)存在較多的耐熱異球菌門細(xì)菌，這些耐熱細(xì)菌有助于環(huán)礁湖珊瑚適應(yīng)炎熱的環(huán)境[30]?；瘕埞菬釒哂幸欢ǖ哪蜔崮芰Γ赡芘c異球菌門是其優(yōu)勢(shì)內(nèi)生類群有關(guān)。發(fā)生潰瘍病后，這些細(xì)菌的豐度下降，是否會(huì)導(dǎo)致宿主的抗病性和耐熱能力下降，有待進(jìn)一步研究。值得注意的是，脫硫桿菌門富含硫酸鹽還原菌，溫度升高促進(jìn)其增殖，有可能促進(jìn)宿主植物對(duì)硫營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[31]。但是，這些脫硫桿菌門細(xì)菌是否也提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)一些條件致病菌的生長(zhǎng)，使罹病果皮上的潛在致病性菌群比例增加，從而提高罹病果皮發(fā)生復(fù)雜病害的風(fēng)險(xiǎn)，這有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果表明，子囊菌門和真菌未鑒定門的真菌是火龍果果皮的主導(dǎo)內(nèi)生真菌。子囊菌門真菌在很多常見(jiàn)水果果皮中占主導(dǎo)地位，它們生長(zhǎng)迅速，能夠在低營(yíng)養(yǎng)水平的惡劣條件下生存[32]。它們可在具有挑戰(zhàn)性的環(huán)境中適應(yīng)紫外線和高溫等的脅迫[33]。真菌未鑒定門具體包含哪些類群還不能確定。據(jù)研究報(bào)道，當(dāng)真菌未鑒定門占主導(dǎo)地位時(shí)，往往會(huì)影響所在生態(tài)位真菌群落的主要功能，包括對(duì)生態(tài)位營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及宿主分泌物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和利用，可能促進(jìn)或抑制病原菌的生長(zhǎng)，影響宿主的抗病性，甚至影響宿主的口感和風(fēng)味等[34-35]。由此推測(cè)，在罹病果皮中豐度顯著上升的真菌未鑒定門的真菌類群，可能使病原菌更好地適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)導(dǎo)致果皮微生物群落失衡，促進(jìn)潰瘍病的發(fā)生和發(fā)展[7]。而且在屬水平上，真菌界未知屬在罹病果中的相對(duì)豐度也顯著高于健康果。雖然在罹病果中鑒定到新暗色柱節(jié)孢歸屬的柱節(jié)孢屬（Neoscytalidium）的比例不高，平均相對(duì)豐度僅為0.36%，但是健康果中未鑒定到柱節(jié)孢屬的序列，柱節(jié)孢屬真菌的存在與否可能是導(dǎo)致潰瘍病發(fā)生的關(guān)鍵。當(dāng)然，由于MiSeq 高通量測(cè)序長(zhǎng)度約為400 bp，加上分類參考數(shù)據(jù)庫(kù)序列有限，導(dǎo)致比對(duì)出來(lái)的序列包含一定比例的未培養(yǎng)或未分類的真菌，需要進(jìn)一步明確其分類地位和作用。但即使在健康果皮組織，真菌未鑒定門的平均相對(duì)豐度也高達(dá)27.30%，這暗示著火龍果果皮組織可能存在一些未知的利用火龍果果皮特有物質(zhì)生長(zhǎng)的真菌，在進(jìn)一步的研究中可以通過(guò)培養(yǎng)方法對(duì)這些真菌進(jìn)行分離、純培養(yǎng)和鑒定。

高爽[36]在研究發(fā)生潰瘍病的冰糖橙葉表細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)病葉表中含量最高的是泛菌屬，相對(duì)豐度達(dá)到25.20%，而主要病原菌黃單胞菌屬的相對(duì)豐度為7.42%，是未發(fā)病葉表豐度（3.54%）的兩倍多。當(dāng)黃單胞菌屬的相對(duì)豐度超過(guò)8.00%時(shí)，冰糖橙葉片才表現(xiàn)出明顯的潰瘍病癥狀。GINNAN 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，柑橘黃龍病菌亞洲種會(huì)隨著柑橘黃龍病病情指數(shù)的上升，在葉部和莖部組織中的相對(duì)豐度越來(lái)越高，然而，在病情指數(shù)最低的1 級(jí)，柑橘黃龍病菌亞洲種在葉部和莖部組織中的相對(duì)豐度不到1%?？梢?jiàn)，雖然主要病原菌在主要生態(tài)位的相對(duì)豐度越高，其引起的病害嚴(yán)重程度越大，但病害發(fā)生初期其比例尚未達(dá)到優(yōu)勢(shì)比例，甚至可能比例很低?；瘕埞麧儾〉陌Y狀表現(xiàn)與柱節(jié)孢屬的相對(duì)豐度的關(guān)系有待進(jìn)一步分析，探尋病原菌是如何達(dá)到優(yōu)勢(shì)比例并導(dǎo)致病害發(fā)生。

細(xì)菌群落的變化往往會(huì)導(dǎo)致菌群功能改變，了解菌群功能有助于了解群落變化對(duì)宿主的影響。基于FAPROTAX 預(yù)測(cè)細(xì)菌群落功能結(jié)果顯示，健康果果皮內(nèi)生細(xì)菌群落的化學(xué)異養(yǎng)、需氧化學(xué)異養(yǎng)、甲基營(yíng)養(yǎng)和甲醇氧化的表達(dá)量均高于罹病果。一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需要通過(guò)內(nèi)生細(xì)菌的化學(xué)異養(yǎng)、需氧化學(xué)異養(yǎng)功能進(jìn)行轉(zhuǎn)換后才能被宿主植物吸收利用，甲基營(yíng)養(yǎng)和甲醇氧化功能可提高宿主植物對(duì)有機(jī)碳源的利用率，這些都會(huì)促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)，從而提高宿主植物的抗病性[38-39]。

在本研究中，利用BugBase 預(yù)測(cè)細(xì)菌表型特征和利用FUNGuild 預(yù)測(cè)真菌營(yíng)養(yǎng)型的結(jié)果均顯示，一些潛在病原細(xì)菌和真菌的相對(duì)豐度在罹病果皮組織上較高，甚至高于潰瘍病主要病原菌柱節(jié)孢屬。這些病原菌可能是以共生的營(yíng)養(yǎng)方式存在果皮內(nèi)，但是隨著這些菌群的豐度升高，會(huì)提高一些植物病害發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，從而增加潰瘍病發(fā)生的復(fù)雜性和防治難度。在復(fù)雜的田間環(huán)境中，植物病害也可能是由不同病原微生物對(duì)單一寄主植物的協(xié)同作用引起的，從而導(dǎo)致病害嚴(yán)重程度的加劇[40]。因此，需警惕此情況發(fā)生。在今后的研究中，我們應(yīng)關(guān)注潰瘍病發(fā)生指數(shù)上升時(shí)果皮組織內(nèi)細(xì)菌和真菌群落的動(dòng)態(tài)變化，并特別重視與潰瘍病發(fā)生緊密相關(guān)的潛在病原微生物或有益微生物。

4 結(jié)論

本研究利用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)揭示了火龍果潰瘍病相關(guān)果皮微生物群落種類和多樣性。結(jié)果表明，在青皮果期，潰瘍病發(fā)生初期，內(nèi)生細(xì)菌和真菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性雖然有發(fā)生變化的趨勢(shì)，但尚未達(dá)到顯著水平。內(nèi)生細(xì)菌和真菌的一些優(yōu)勢(shì)類群的比例發(fā)生了顯著改變，從而可能會(huì)導(dǎo)致其功能發(fā)生變化，這些變化可能會(huì)促進(jìn)潰瘍病的發(fā)展，因此在潰瘍病發(fā)生早期及時(shí)和有針對(duì)性地用藥非常重要。