樹木伯克霍爾德氏菌DHR18誘導(dǎo)橡膠樹抗病性相關(guān)防御酶分析

關(guān)鍵詞：伯克霍爾德氏菌；橡膠樹；膠孢炭疽菌；誘導(dǎo)抗病性；防御酶

中圖分類號(hào)：S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

天然橡膠是一個(gè)國(guó)家至關(guān)重要的戰(zhàn)略資源以及不可替代的工業(yè)原料，而全世界98%的天然橡膠是由橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）生產(chǎn)[1]。橡膠樹種植受到獨(dú)特的地域和氣候限制，其中影響橡膠產(chǎn)量的重要因素之一是生物脅迫[2]。炭疽病是橡膠樹生產(chǎn)中的重要病害，膠孢炭疽菌復(fù)合群中的Colletotrichum siamense 是我國(guó)植膠區(qū)的田間優(yōu)勢(shì)致病種，通過(guò)侵染橡膠樹的枝條、花、葉等組織，造成葉片枯萎和落葉，最終導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)[3]。目前，主要防治方法是使用化學(xué)藥劑，由于橡膠樹屬高大喬木，在防治過(guò)程中使用藥劑比較單一、藥量大、易發(fā)生漂移，且化學(xué)藥劑在防治時(shí)存在抗藥性、防治成本高和環(huán)境污染等問(wèn)題[4-5]。因此，急需一種綠色環(huán)保、經(jīng)濟(jì)安全的手段來(lái)防治橡膠樹炭疽病。

生物防治是通過(guò)利用有益微生物或其代謝物來(lái)防治植物病害，已經(jīng)成為病害防控中一種可持續(xù)和有效的方法[6-7]。生物防治劑不僅可以直接抑制植物病原體的生長(zhǎng)來(lái)減少對(duì)植物的侵染，還能誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗性，引發(fā)植物廣泛的防御反應(yīng)，對(duì)多種病原體有著長(zhǎng)期的防治效果[8]。眾多研究表明，生防菌可以通過(guò)誘導(dǎo)植物相關(guān)防御酶的升高，從而增強(qiáng)植物的抗性[9]。內(nèi)生耐鹽芽孢桿菌Cal.l.30 和Cal.f.4 可以誘導(dǎo)番茄對(duì)灰葡萄孢的系統(tǒng)抗性，從而有效防治番茄灰霉病[10]。羅氏假單胞菌GC-7 處理的植物根系中過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanin ammonialyase，PAL）等防御相關(guān)酶的活性顯著增加，從而增強(qiáng)植物抗性[11]。

伯克霍爾德氏菌（Burkholderia sp.）是一種能有效防治多種植物病害的生防菌，與植物有著密切的共生關(guān)系，而且伯克霍爾德氏菌產(chǎn)生的一些次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)大部分植物病原真菌有明顯抑制作用。此外，可以通過(guò)誘導(dǎo)植物防御相關(guān)酶活性的升高來(lái)增強(qiáng)對(duì)植物病原菌的抗性[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)，越南伯克霍爾德氏菌C12 通過(guò)誘導(dǎo)水稻防御相關(guān)酶活性（CAT、PAL、SOD、PPO 和POD）的升高，從而增強(qiáng)水稻的抗病性[13]；吡咯伯克霍爾德氏菌S17-377 可誘導(dǎo)水稻防御相關(guān)酶活性變化，有3 種防御相關(guān)酶的活性增強(qiáng)，說(shuō)明伯克霍爾德氏菌可以增強(qiáng)水稻對(duì)水稻紋枯病的抗性[14]。本實(shí)驗(yàn)室前期分離得到1 株對(duì)橡膠樹膠孢炭疽菌有較強(qiáng)拮抗作用的樹木伯克霍爾德氏菌（B. arboris），本研究系統(tǒng)測(cè)定了不同濃度樹木伯克霍爾德氏菌DHR18 發(fā)酵液以及DHR18 與膠孢炭疽菌協(xié)同處理下橡膠樹葉片中CAT、POD、PAL、SOD 和PPO 活性變化，初步探索樹木伯克霍爾德氏菌誘導(dǎo)橡膠樹對(duì)膠孢炭疽菌的抗性機(jī)理，以期為橡膠樹炭疽病的綠色防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樹木伯克霍爾德氏菌株 DHR18 及橡膠樹膠孢炭疽菌CH-1 均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定及保存，其中樹木伯克霍爾德氏菌DHR18 分離自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)（海南儋州）橡膠樹根病區(qū)；橡膠樹膠孢炭疽菌CH-1 分離自國(guó)家橡膠種質(zhì)資源圃（儋州）。

供試橡膠種苗品種為GT1，挑選葉部生長(zhǎng)健康、苗長(zhǎng)35 cm，胸徑和株高等長(zhǎng)勢(shì)均一的具1 篷葉淡綠期葉片的種子苗，設(shè)置DHR18 發(fā)酵液噴施3個(gè)濃度處理，以及病原菌與生防菌協(xié)同噴施3 個(gè)處理，每個(gè)處理使用種子苗20 株，每個(gè)處理重復(fù)5次，所有種子苗均由國(guó)家橡膠種質(zhì)資源圃提供。

1.2方法

1.2.1 DHR18發(fā)酵液及膠孢炭疽菌CH-1孢子懸浮液制備挑取 DHR18單菌落于100 mL LB 培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床（180 r/min，28 ℃）中培養(yǎng)24 h，將DHR18 發(fā)酵液濃度調(diào)節(jié)至1×10⁸ CFU/mL作為原液，用無(wú)菌水稀釋得到1×10⁷ CFU/mL 和1×10⁶ CFU/mL 濃度的稀釋液。膠孢炭疽菌CH-1接種在PDB 培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床（180 r/min，28 ℃）中培養(yǎng)3d待用。炭疽菌接種：參考蔡志英等[15]的方法，用孢子懸浮液（1×10⁶ 個(gè)/mL）接種，預(yù)先用無(wú)菌昆蟲針刺傷橡膠葉片，孢子懸浮液用噴霧器均勻噴施，直到橡膠葉片掛滿水滴為止，每個(gè)處理重復(fù)3 次；空白對(duì)照噴施適量無(wú)菌水，套袋保濕。

1.2.2 不同濃度的DHR18 發(fā)酵液處理橡膠樹參考唐文等[16]的方法，共設(shè)置3 個(gè)濃度的DHR18發(fā)酵液誘導(dǎo)處理（表1），包括1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶ CFU/mL 處理，以LB 培養(yǎng)基為對(duì)照，取10 mL不同濃度的DHR18 發(fā)酵液和對(duì)照噴灑植株葉面，每個(gè)處理重復(fù)5 次。分別于處理后的24、48、72、96、120 h，取位置相同的橡膠樹葉片，用于防御酶的活性測(cè)定。

1.2.3 DHR18 與CH-1 協(xié)同處理橡膠樹共設(shè)置4個(gè)處理，處理方式如表2所示。樣品采集和處理與1.2.2 相同。養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床（180 r/min，28 ℃）中培養(yǎng)24 h，將DHR18 發(fā)酵液濃度調(diào)節(jié)至1×10⁸ CFU/mL作為原液，用無(wú)菌水稀釋得到1×10⁷CFU/mL 和1×10⁶ CFU/mL 濃度的稀釋液。膠孢炭疽菌CH-1接種在PDB 培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床（180 r/min，28 ℃）中培養(yǎng)3d待用。炭疽菌接種：參考蔡志英等[15]的方法，用孢子懸浮液（1×10⁶ 個(gè)/mL）接種，預(yù)先用無(wú)菌昆蟲針刺傷橡膠葉片，孢子懸浮液用噴霧器均勻噴施，直到橡膠葉片掛滿水滴為止，每個(gè)處理重復(fù)3 次；空白對(duì)照噴施適量無(wú)菌水，套袋保濕。

1.2.2 不同濃度的DHR18 發(fā)酵液處理橡膠樹參考唐文等[16]的方法，共設(shè)置3 個(gè)濃度的DHR18發(fā)酵液誘導(dǎo)處理（表1），包括1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶ CFU/mL 處理，以LB培養(yǎng)基為對(duì)照，取10 mL不同濃度的DHR18 發(fā)酵液和對(duì)照噴灑植株葉面，每個(gè)處理重復(fù)5 次。分別于處理后的24、48、72、96、120 h，取位置相同的橡膠樹葉片，用于防御酶的活性測(cè)定。

1.2.3 DHR18與CH-1協(xié)同處理橡膠樹共設(shè)置4個(gè)處理，處理方式如表2所示。樣品采集和處理與1.2.2相同。

1.2.4 橡膠樹防御酶活性測(cè)定將 1.2.2 和1.2.3中采集的橡膠樹葉片，使用酶活試劑盒（索萊寶科技有限公司）測(cè)定POD、SOD、CAT、PAL 和PPO 活性。按照試劑盒說(shuō)明書中步驟加入試劑，在相應(yīng)的波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，并按照試劑盒的公式計(jì)算其酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、整理，采用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度DHR18發(fā)酵液處理對(duì)橡膠樹防御酶活性的影響

2.1.1 過(guò)氧化氫酶活性變化 經(jīng)不同濃度 DHR18發(fā)酵液處理后，橡膠樹葉片中CAT 活性均高于CK。其中，T₂、T₃處理的CAT 活性呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)，且在48h 時(shí)達(dá)到峰值，其活性分別為1009.14 U/g 和858.79 U/g，為CK 的2.68倍和2.29倍，均極顯著高于CK（Plt;0.01）；而T₁的CAT 活性在48 h 后下降并趨于穩(wěn)定，但在同時(shí)間的酶活性均高于CK（圖1）。

2.1.2 過(guò)氧化物酶活性變化 如圖2所示，經(jīng)不同濃度DHR18 發(fā)酵液噴施葉片處理后，處理組葉片 POD 活性均呈先升高后降低的趨勢(shì)，并且活性在相同時(shí)間均高于CK。在72h時(shí)，每個(gè)處理組葉片POD活性達(dá)到峰值，此時(shí)T2和T3處理的POD酶活性達(dá)到29 138.67、27 276.67 U/g，分別是CK的3.35倍和3.13倍，均極顯著高于CK（Plt;0.01）。

2.1.3 苯丙氨酸解氨酶活性變化 如圖3所示，T₂處理的PAL 活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，在96 h時(shí)，其PAL 活性達(dá)到峰值110.24 U/g，是CK 的1.88倍，顯著高于CK（Plt;0.05）。T₁ 處理的PAL 活性呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)。在48 h 和96 h 時(shí)出現(xiàn)峰值，葉片PAL 活性分別為92.72 U/g 和93.43 U/g，均高于CK。T₂ 處理效果最明顯，在相同時(shí)間，其處理的葉片PAL 活性均高于其他濃度。

2.1.4 超氧化物歧化酶活性變化 如圖4所示，經(jīng)不同濃度DHR18 發(fā)酵液噴施葉片處理后，處理組葉片SOD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，且其活性在相同時(shí)間均高于CK。T₂ 處理的SOD 活性在48h 達(dá)到峰值1164.89 U/g，是CK 的3.83倍，極顯著高于CK（Plt;0.01）。T₁ 和T₃ 處理的SOD活性在72 h 達(dá)到峰值，分別為774.93U/g 和848.18 U/g，是CK 的3.41 倍和3.73倍，顯著（Plt;0.05）和極顯著高于CK（Plt;0.01）。

2.1.5 多酚氧化酶的活性變化 由圖 5 可知，T₁、T₂ 和T₃處理的PPO活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，其活性在相同時(shí)間均高于CK。T₂、T₃處理的PPO 活性在72 h 時(shí)分別達(dá)到峰值148.00 U/g和142.80 U/g，是CK 的4.51 倍和4.35 倍。T1 處理的PPO 活性在96 h 時(shí)達(dá)到峰值（111.60 U/g）。經(jīng)不同濃度DHR18 發(fā)酵液處理的葉片PPO 活性在峰值時(shí)均極顯著高于CK（Plt;0.01）。

2.2 菌株DHR18對(duì)膠孢炭疽病的防治效果

如圖6所示，菌株DHR18在平板上對(duì)橡膠樹膠孢炭疽菌CH-1 表現(xiàn)出明顯的抑制效果，抑制率為 71.56%。按照表2，使用DHR18 與CH-1 協(xié)同處理橡膠樹幼苗，72 h 后，CK 的葉片未發(fā)病，T₅處理（先接生防菌）的防治效果為81.79%，T₄處理（先接病原菌）的防治效果為44.35%，均顯著高于T₆處理（只接病原菌）（Plt;0.0001）。

2.3 DHR18 與CH-1 協(xié)同處理對(duì)橡膠樹相關(guān)防御酶活性的影響

2.3.1 氧化氫酶活性變化 生防菌DHR18 和CH-1 共同處理后橡膠樹的相關(guān)防御酶CAT 活性有顯著變化，3種不同處理組CAT 活性在同時(shí)間均高于CK。其中，T5 處理的CAT 活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，在48 h 時(shí)達(dá)到峰值（1230.85 U/g），極顯著高于其他處理（Plt;0.01），是CK 的4.56倍；T₄ 處理的CAT 活性呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)，在48 h 極顯著高于CK（Plt;0.01）（圖7）。

2.3.2 過(guò)氧化物酶活性變化" DHR18 與CH-1 協(xié)同處理下，3種處理組的POD活性均高于CK，在同時(shí)間均達(dá)顯著水平（Plt;0.05），其中，T₅ 的POD 活性在48 h 時(shí)達(dá)到峰值（45 504.67 U/g），是CK 的3.10 倍；T₄ 和T₆ 處理的POD 活性在72h 時(shí)達(dá)到峰值（30 249.33、33875.33 U/g），分別為CK 的2.14倍和2.40倍。3種不同處理在POD活性峰值時(shí)均極顯著高于CK（Plt;0.01）（圖8）。

2.3.3 苯丙氨酸解氨酶活性變化 由圖9可知，T₅處理的PAL 活性總體呈先升高后降低的趨勢(shì)，在同時(shí)間均高于CK，72 h 時(shí)與CK 差異顯著（Plt;0.05），在48 h 時(shí)達(dá)到峰值（117.53 U/g），是 CK 的2.04 倍，極顯著高于CK（Plt;0.01）；T₄ 和T₆ 處理的PAL 活性變化不明顯，活性保持在85.00 U/g 左右，在72 h 顯著高于CK（Plt;0.05）。

2.3.4 超氧化物歧化酶活性變化 由圖 10 可知，T5 處理的SOD 活性在72 h 極顯著高于CK（Plt;0.01），SOD 活性達(dá)1342.17 U/g，是CK 的3.30 倍；T₄ 的SOD 活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，在48 h 達(dá)到峰值，活性為924.49 U/g，是CK 的2.47 倍，顯著高于CK（Plt;0.05）；T₆ 的SOD 活性在24 h 時(shí)低于CK，與CK 無(wú)顯著差異。

2.3.5 多酚氧化酶活性變化 由圖 11 可知，T5的PPO 活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，在同時(shí)間均高于 CK，且在48 h 時(shí)達(dá)到峰值，為134.40 U/g，是CK 的5.6 倍；T₄ 的PPO 活性在48 h 時(shí)達(dá)到峰值，為134.40 U/g，是CK 的5.51 倍，均極顯著高于對(duì)照CK（Plt;0.01）；T₆ 的PPO 活性變化不明顯，未出現(xiàn)明顯的峰值，活性略高于CK。

3 討論

過(guò)氧化氫酶（CAT）[17]、過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）是植物主要的活性氧清除酶，可消除因病害侵染或逆境脅迫產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，從而避免對(duì)自身造成損傷[18]；苯丙氨酸解氨酶（PAL）可催化苯丙氨酸合成酚類化合物，而酚類化合物是植物多種次生代謝產(chǎn)物的中間產(chǎn)物，對(duì)植物抗病蟲害有重要作用[19]；多酚氧化酶（PPO）是一類金屬蛋白酶，可以催化多種生化反應(yīng)，調(diào)節(jié)生理功能，與植物抗逆抗病等息息相關(guān)[20]。這些防御相關(guān)酶活性對(duì)于植物的抗病性具有重要決定作用，也是評(píng)價(jià)植物抗性水平的重要參考標(biāo)準(zhǔn)[21-22]。

研究表明，生防菌通過(guò)誘導(dǎo)和增強(qiáng)一系列防御相關(guān)酶活性，從而提高植物的系統(tǒng)抗病能力，是其重要的抗病機(jī)制之一[23-24]。CHEN 等[25]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CM-3 可以通過(guò)增加葡萄POD、PPO、CAT 和PAL 的活性來(lái)增強(qiáng)葡萄的抗病能力。鄒強(qiáng)等[26]用生防貝萊斯芽孢桿菌TP-1 處理后葡萄的APX、PPO 和PAL 活性提高，增強(qiáng)了對(duì)灰霉菌的抗性。本研究中，生防菌DHR18 顯著提高橡膠樹中CAT、POD、SOD、PAL 和PPO 五種防御酶活性，增強(qiáng)了橡膠樹的抗性，其中多酚氧化酶的變化最為明顯，最高可以達(dá)到對(duì)照的4.51倍。陳秀香等[27]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)枯草芽孢桿菌FC21的10倍稀釋液處理后的植株葉片中CAT、POD、SOD活性最高，生防菌誘導(dǎo)的防御相關(guān)酶活性與菌液濃度不呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)10⁷ CFU/mL 濃度的DHR18 發(fā)酵液對(duì)橡膠樹防御誘導(dǎo)效果最好，可作為伯克霍爾德氏菌DHR18 防治炭疽病的濃度參考。因此，本研究結(jié)果表明，樹木伯克霍爾德氏菌DHR18 能誘導(dǎo)橡膠樹體內(nèi)CAT、POD和SOD酶活增強(qiáng)來(lái)清除過(guò)量活性氧；能誘導(dǎo)PAL 和PPO酶活性促使橡膠樹產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等，從而提高橡膠樹系統(tǒng)抗性。

植物在受到病原物侵染后，活性氧作為植物抵御和延緩病原物侵染的第一道物理屏障，在第一時(shí)間反應(yīng)并影響活性氧消除酶的合成酶基因的表達(dá)，從而增加CAT、POD 和SOD 等的活性繼而實(shí)現(xiàn)解毒作用，更好地應(yīng)對(duì)各種脅迫，其體內(nèi)防御酶活性也會(huì)上升[28]。感染病原物后，活性氧消除酶普遍呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。耿莉娜等[29]的研究發(fā)現(xiàn)煙草的抗病品種Beinhart1000-1在接種赤星病菌后，POD、PAL、SOD 活性明顯高于對(duì)照，呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。本研究中，在接種炭疽病CH-1后，橡膠樹的SOD和PAL活性無(wú)明顯變化，可能與植株品種抗病性有關(guān)。羅富方等[30]研究發(fā)現(xiàn)在青枯病脅迫下，烤煙再接種印度梨形孢，其4 種防御酶（PAL、PPO、POD和SOD）活性增加均高于對(duì)照，且呈先升高后降低的趨勢(shì)。本研究中DHR18和CH-1協(xié)同處理下，處理組的防御酶（CAT、POD、SOD、PAL 和PPO）活性均有提高，主要呈先上升后下降的趨勢(shì)；協(xié)同處理的CAT、SOD 和PPO酶活性在24、48、72 h 顯著高于其只接病原菌的酶活，表明伯克霍爾德氏菌DHR18 在橡膠樹受到炭疽病菌侵染過(guò)程中會(huì)增強(qiáng)其活性氧清除系統(tǒng)，并促進(jìn)合成抗病物質(zhì)，從而增強(qiáng)植株的抗病能力。唐文等[16]先噴施枯草芽孢桿菌Czk1 后接種病原菌處理的5 種防御相關(guān)酶（CAT、POD、PAL、SOD 和PPO）活性升高，顯著高于其他處理。本研究橡膠樹受到炭疽病侵染前噴施DHR18發(fā)酵液，對(duì)防御酶活性影響最大，5 種防御酶活性高于其他處理組，更有利于誘導(dǎo)抗病性。本研究發(fā)現(xiàn)，先噴施生防菌伯克霍爾德氏菌DHR18 再接種病原菌處理組的POD活性比只接病原菌和先接病原菌處理組的更快達(dá)到峰值，在48 h 時(shí)顯著高于其他處理組，能更快引起植物的防御反應(yīng)；周東興等[31]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌DX-25與番茄枯萎病互作的情況下可以更快地引起植株番茄的抗性反應(yīng)，與本研究結(jié)果相似。

在本研究中，生防菌DHR18 發(fā)酵液可促使葉片中CAT、POD、PAL、SOD 和PPO 酶活性上升，誘導(dǎo)橡膠樹產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，1×10⁷ CFU/mL 濃度對(duì)橡膠樹的誘導(dǎo)效果最好。研究結(jié)果初步明確了樹木伯克霍爾德氏菌具有誘導(dǎo)抗病性，為探索伯克霍爾德氏菌誘導(dǎo)抗病性提供了部分理論依據(jù)。