甘薯CIN基因家族鑒定及影響塊根膨大關(guān)鍵CIN基因的挖掘

關(guān)鍵詞：甘薯；細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶；蔗糖代謝；基因家族；塊根膨大

中圖分類號(hào)：S531 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]適應(yīng)能力強(qiáng)、產(chǎn)量高且易于管理，在全球廣泛栽培，為世界第七大農(nóng)作物[1]。我國是世界第一大甘薯種植國，面積、產(chǎn)量均居全球首位[2]。2022 年我國甘薯種植面積和產(chǎn)量分別占全球的30%和54%[3]。甘薯塊根富含淀粉、可溶性糖、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，可作為主糧和飼料，也可用于鮮食、食品和淀粉加工[4]。和其他發(fā)展中國家相比，我國甘薯單產(chǎn)相對(duì)較高，但與發(fā)達(dá)國家相比，仍有一定差距。目前我國甘薯平均單產(chǎn)為22.5 t/hm2[5]，而日本和以色列則分別為24.7、33.3 t/hm2[6]，澳大利亞更是高達(dá)39.7 t/hm²[3]。目前我國甘薯單產(chǎn)已處平臺(tái)期，近20 年來一直徘徊在22 t/hm² 左右，沒有進(jìn)一步提升[3]。雖然很多發(fā)展中國家和地區(qū)仍依靠甘薯作為主糧來確保糧食安全[7-8]，但其甘薯單產(chǎn)遠(yuǎn)低于世界平均水平的12 t/hm²，如非洲僅為7t/hm2[3]。如何進(jìn)一步提高甘薯產(chǎn)量，不僅可以保障“一帶一路”沿線發(fā)展中國家和地區(qū)的糧食安全，還可提高我國甘薯種植效益。甘薯產(chǎn)量主要由2 個(gè)因素決定，即塊根數(shù)量和塊根大小。因此，闡明甘薯塊根發(fā)育和膨大的機(jī)理，將有利于進(jìn)一步提高甘薯產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的目標(biāo)。

蔗糖（sucrose， Suc）分解產(chǎn)生的己糖可作為碳骨架、能量或糖信號(hào)在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[9]。轉(zhuǎn)化酶（invertase， INV）和蔗糖合酶（sucrose synthase， Sus）參與植物體內(nèi)Suc 的分解。Sus 將Suc 分解為UDP-葡萄糖（UDP-Glc）和果糖（Fru），該分解過程為可逆過程；INV 則不可逆地將Suc 水解為Glc 和Fru[10]。根據(jù)亞細(xì)胞定位的不同，INVs 可進(jìn)一步分為3 種：細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（cell wall invertase， CWIN）、液泡轉(zhuǎn)化酶（ vacuolar invertase， VIN ） 和細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶（cytoplasmic invertase， CIN）[11]。這4 種蔗糖分解酶在植物發(fā)育、非生物脅迫反應(yīng)和植物-病原菌互作中分別發(fā)揮著重要的作用[9， 11-12]。

迄今為止，有關(guān)蔗糖分解酶對(duì)塊根/塊莖等地下儲(chǔ)藏器官（如胡蘿卜肉質(zhì)根和馬鈴薯塊莖等）生長發(fā)育影響的研究主要集中于Sus、CWIN 和VIN[13-16]，對(duì)CIN 的研究較少。與CWIN、VIN不同，CIN 在植物進(jìn)化過程中更為保守，其基因序列變異程度遠(yuǎn)低于CWIN 和VIN，因此在植物生長發(fā)育中發(fā)揮的作用可能更為重要[17]。研究表明，CIN 分解產(chǎn)生的己糖可參與各種生理生化反應(yīng)，包括呼吸代謝、抗氧化、各種代謝物的生物合成以及基因表達(dá)的調(diào)控等[11， 18]。

越來越多的證據(jù)表明，CIN 在植物根系發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。擬南芥中T-DNA 的插入導(dǎo)致CIN 基因CINV1 缺失突變，造成突變體幼苗根系變短[19] 。擬南芥的雙CIN 基因突變體（cinv1/cinv2）表現(xiàn)為初生根伸展減少30%，同時(shí)葉片數(shù)量也顯著減少[20]。在百脈根（ Lotusjaponicus）中，CIN 基因LjINV1 的突變會(huì)顯著降低CIN 活性，嚴(yán)重抑制根系的生長，且會(huì)導(dǎo)致根系上形成根瘤[21] 。EMS 誘導(dǎo)水稻CIN 基因OsCyt-inv1 突變導(dǎo)致根系發(fā)育受阻，包括根系伸長區(qū)細(xì)胞皺縮和根系變短[22]。此外，擬南芥CIN基因AtCYT-INV1 的突變會(huì)緩解滲透脅迫對(duì)側(cè)根生長的抑制，表明CIN 基因還可調(diào)控脅迫條件下根系的生長發(fā)育[23]。

如上所述，目前CIN 對(duì)根系發(fā)育影響的研究主要集中在模式植物上，有關(guān)CIN 對(duì)甘薯塊根膨大調(diào)控的研究較少。這很大程度上是由于甘薯是六倍體（2n=6x=90）且染色體高度雜合，基因組測序較晚所導(dǎo)致的[24]。近期公布的甘薯基因組序列可為研究CIN 在甘薯塊根膨大中的潛在作用提供重要幫助[24-25]。本研究對(duì)甘薯基因組中的CIN基因家族成員進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步研究CIN 基因成員在甘薯不同組織部位和不同類型根系表達(dá)水平以及CIN 活性，最后篩選出可能在塊根膨大中起重要調(diào)控作用的關(guān)鍵CIN 基因。本研究將為后續(xù)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究CIN 在甘薯塊根膨大中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年10月20號(hào)至12月20號(hào)在海南大學(xué)露地種植海南甘薯主栽品種高系14，基肥按照450 kg/hm² 的量施史丹利復(fù)合肥（N∶P∶K 為15∶15∶15）和12 t/hm²的量施羊糞有機(jī)肥。取樣部位分別為高系14 甘薯的幼葉、成熟葉、莖、花（僅花瓣）和60 d 塊根，每個(gè)部位取0.3g，4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2023年2月至4月在海南大學(xué)農(nóng)科實(shí)驗(yàn)田基地的溫室大棚盆栽種植高系14 甘薯。定植前將土壤與基質(zhì)（由椰糠、泥炭、稻谷殼、珍珠巖及微生物料配置而成）按體積比3∶1 混勻，再施史丹利復(fù)合肥作為基肥。花盆規(guī)格為外直徑31 cm，高19.4 cm，4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取樣部位為白色纖維根（白色細(xì)纖維狀根）、紅色纖維根（直徑小于0.2 cm 的紅色纖維狀根）、柴根（直徑0.5～2.0 cm的紅色不膨大根）和60 d 塊根。每個(gè)樣品分別稱取0.2、0.3 g 存放在2 mL 試管中，液氮處理后保存于?80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 甘薯CIN 基因家族成員鑒定 采用木薯、水稻、擬南芥等3 個(gè)物種作為種子序列進(jìn)行Blast對(duì)比，具體參照CHEN 等[26]的方法。在甘薯數(shù)據(jù)庫（https：//ipomoea-genome.org/）下載栽培種甘薯Ipomoea batatas 的全基因組數(shù)據(jù)，在UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)查閱中下載擬南芥、水稻、木薯的所需氨基酸序列[10， 27-28]。用TBtools[29]軟件和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行雙向Blast 比對(duì)篩選。

1.2.2 甘薯CIN 基因家族成員理化性質(zhì)分析及染色體定位 使用ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件分析CIN 的理化性質(zhì)。使用TBtools 軟件可視化分析CIN 基因家族成員在染色體上的位置。

1.2.3 甘薯CIN 基因家族成員系統(tǒng)發(fā)育分析 使用MEGA-X（https：//www.megasoftware.net/）在線軟件對(duì)擬南芥、木薯和甘薯的CIN 蛋白氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析，采用鄰接法（neighbor-joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展值為1000。使用Adobe illustrator CC 2019 軟件美化。

1.2.4 甘薯CIN 基因家族成員保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)和基序分析 通過NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb. cgi）數(shù)據(jù)庫確定甘薯CIN 基因的保守結(jié)構(gòu)域。使用TBtools 軟件確定甘薯CIN 家族基因結(jié)構(gòu)（內(nèi)含子-外顯子）。使用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）在線軟件預(yù)測甘薯CIN 家族成員的基序（motif），預(yù)測CIN 蛋白基序的標(biāo)準(zhǔn)為：不同圖案的數(shù)量=10，其他參數(shù)默認(rèn)，得到的結(jié)果使用TBtools 軟件進(jìn)行可視化分析。

1.2.5 甘薯CIN 基因家族成員順式作用元件分析 將甘薯CIN 基因轉(zhuǎn)錄起始上游2000 bp的序列，通過PlantCare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plan tcare/html/）在線軟件對(duì)甘薯CIN 啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件預(yù)測，并使用TBtools 軟件制作熱圖。

1.2.6 甘薯CIN 基因家族共線性分析 用TBtools 軟件的One Step MCscanX 功能分析甘薯CIN 基因的共線性關(guān)系，用TBtools 中的Advanced Circos 功能將甘薯CIN 同源基因的共線性關(guān)系可視化，計(jì)算基因?qū)Φ腒a/Ks（非同義替換率/同義替換率）。

1.2.7 甘薯CIN 基因家族成員表達(dá)分析 采用OmniPlant RNA Kit（DNase I）（CoWin Biotech，北京，中國）試劑盒提取甘薯樣品總RNA。使用HiScript III All-in-one RT SurperMix Perfect forqPCR cDNA 合成試劑盒（Vazyme，南京，中國）對(duì)提取的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA。使用ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京，中國）試劑盒和QuantStudio^TM 1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（applidbiosystems，Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以管家基因IbActin 為內(nèi)參基因，引物見表1。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。使用2^?ΔΔCT 方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.8 甘薯CIN 酶活性測定 參照TOMLINSON等[30]的方法測定甘薯CIN 活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2022軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS 27.0 軟件對(duì)甘薯CIN 基因表達(dá)和CIN酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯CIN 基因家族成員的鑒定

用TBtools 軟件和NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行雙向Blast序列比對(duì)篩選，共鑒定出12 個(gè)CIN 基因家族成員， 按照其在染色體上的先后順序命名為IbCIN1-12（圖1）。甘薯屬于六倍體（6x=90），其IbCINs 分別分布在15 條染色體中的8 條染色體上，在LG11 上有3 個(gè)IbCINs（IbCIN10-12），在LG2 和LG5 上分別有2 個(gè)IbCINs（IbCIN2-3、IbCIN5-6），而在LG1、LG4、LG6、LG7 和LG9上均只有1 個(gè)IbCIN（IbCIN1、IbCIN4、IbCIN7-9）。在其他7 條染色體上均無IbCIN 基因。

IbCIN 蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示（表2），IbCIN 蛋白長度在417～825 aa 之間，等電點(diǎn)在4.83～7.17 之間，分子量在46 595.11～93 753.02 Da之間。除IbCIN10 外，其他IbCIN 蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白，與已有的研究結(jié)果一致，即與CWIN 和VIN 不同，由于CIN 蛋白沒有糖基化，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，非常容易分解[9]。在所有IbCIN 蛋白中，僅IbCIN9 平均疏水性為正值，屬于疏水蛋白，其他IbCIN 蛋白均為負(fù)值，屬于親水蛋白（表2）。

2.2 甘薯CIN 基因家族成員的系統(tǒng)發(fā)育分析

前人研究發(fā)現(xiàn)CIN 蛋白可被分為3 個(gè)亞組，分別為α1、α2 和β 亞組，其中α1 亞組定位于質(zhì)體上（如葉綠體），α2 亞組定位于線粒體上，β亞組則位于細(xì)胞質(zhì)中[31]。用MEGA-X 軟件將鑒定出的12 個(gè)IbCINs 與已鑒定出的9 個(gè)擬南芥和10個(gè)木薯CIN 家族成員共31 個(gè)CIN 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。擬南芥α1 亞組有1 個(gè)成員，α2亞組有3 個(gè)成員，β 亞組有5 個(gè)成員；木薯α1亞組有3 個(gè)成員，α2 亞組有3 個(gè)成員，β 亞組有4個(gè)成員，這和前人的研究結(jié)果一致[31-32]。12 個(gè)IbCINs 也可以分為3 個(gè)亞組，α1 亞組有1 個(gè)成員（IbCIN8）；α2 亞組有3 個(gè)成員（IbCIN7、IbCIN10和IbCIN12），β 亞組有8 個(gè)成員（IbCIN1-6、IbCIN9和IbCIN11）。

位于細(xì)胞質(zhì)的擬南芥CIN 基因AtCINV1 的缺失可以減少30%的初生根伸長生長[20]。超表達(dá)擬南芥CIN 基因At-A/N-InvA 或At-A/N-InvG（AtCINV1）表明，這2 個(gè)基因都會(huì)顯著降低原生質(zhì)體中POD 的表達(dá)，從而抑制根系過早木質(zhì)化，最終促進(jìn)根系生長發(fā)育[33-34]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹， 發(fā)現(xiàn)甘薯IbCIN7 、IbCIN12 與擬南芥At-A/N-InvA 親緣關(guān)系較近，甘薯IbCIN1 與擬南芥At-A/N-InvG（AtCINV1）親緣關(guān)系較近，初步推測甘薯IbCIN1、IbCIN7、IbCIN12 有降低原生質(zhì)體中POD 表達(dá)的功能，與甘薯根系發(fā)育相關(guān)。木薯中MeNINV1 是塊根淀粉積累的關(guān)鍵基因，可促進(jìn)木薯塊根膨大[27， 35]。擬南芥中A/N-InvH 與根中ROS 合成相關(guān)，與根系生長密切相關(guān)[36]。IbCIN10 與MeNINV1 親緣關(guān)系較近，而IbCIN7、IbCIN12 與At-A/N-InvH 親緣關(guān)系較近，推測這3個(gè)基因可能與甘薯根系發(fā)育相關(guān)。綜上所述，IbCIN1、IbCIN7、IbCIN10、IbCIN12 等4 個(gè)基因可能均和甘薯根系發(fā)育密切相關(guān)。但具體哪個(gè)基因與甘薯塊根膨大相關(guān)還有待進(jìn)一步確定。

2.3 甘薯CIN 基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和基序分析

通過N C B I 蛋白保守域數(shù)據(jù)庫對(duì)甘薯（IbCIN1-12）和木薯（MeNINV1-10）的CIN 進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，與木薯CIN 一樣，12 個(gè)甘薯CIN 均含有CIN 蛋白特有的Glyco_hydro_100 保守結(jié)構(gòu)域（圖3），屬于糖基水解酶基因家族GH 100，與前人研究結(jié)果一致[31]。表明本研究鑒定出的12 個(gè)IbCINs 屬于CIN 基因家族。此外，保守基序分析顯示（圖4），IbCINs 有10個(gè)保守基序（motif），α1 和α2 亞組的4 個(gè)IbCINs包含10 個(gè)motif，在β 亞組中只有IbCIN11 基因包含10 個(gè)motif，IbCIN1-2 包含5 個(gè)motif，IbCIN3包含6 個(gè)motif，IbCIN4-5 包含8 個(gè)motif，IbCIN6、IbCIN9 包含9 個(gè)motif，只有motif1 存在于所有IbCINs。

為進(jìn)一步了解甘薯CIN 基因家族的進(jìn)化，對(duì)甘薯CIN 基因家族成員的外顯子-內(nèi)含子分布進(jìn)行分析。α1 亞組的唯一一個(gè)CIN 基因IbCIN8 有7 個(gè)外顯子；α2 亞組中除IbCIN10 具有8 個(gè)外顯子外，其他2 個(gè)IbCINs 也均有7 個(gè)外顯子；β 亞組中IbCIN4、IbCIN6 和IbCIN11 有4 個(gè)外顯子，IbCIN5 有5 個(gè)外顯子，IbCIN1 有6 個(gè)外顯子，IbCIN3 有8 個(gè)外顯子，IbCIN2 有9 個(gè)外顯子，IbCIN9 有11 個(gè)外顯子（圖4）。

α1、α2 亞組成員之間在保守基序和基因結(jié)構(gòu)上差異較小、相對(duì)保守，而β 亞組成員之間則差異較大，表明β 亞組CIN 基因在甘薯栽培種的進(jìn)化過程中經(jīng)歷了結(jié)構(gòu)缺失和變異，這可能導(dǎo)致其在功能上的多樣化，從而可以參與更多的生物過程[37]。在保守基序方面，α1、α2 亞組的4 個(gè)IbCINs都包含有10 個(gè)保守基序，而8 個(gè)β 亞組成員中僅IbCIN11 含有10 個(gè)保守基序，其余7 個(gè)IbCINs（IbCIN1-6 和IbCIN9）的保守基序介于5～9 個(gè)之間。同樣，在基因結(jié)構(gòu)方面，α1 和α2 亞組4 個(gè)基因中除IbCIN10 具有8 個(gè)外顯子外，其他3 個(gè)IbCINs 具有7 個(gè)外顯子，而β 亞組成員包含的外顯子數(shù)量則波動(dòng)較大，介于4～11 個(gè)之間。不同亞組CIN 之間在保守基序和基因結(jié)構(gòu)上的差異可能是影響其亞細(xì)胞定位和功能的重要原因。

2.4 甘薯CIN基因家族成員的順式作用元件分析

啟動(dòng)子順式元件與基因功能密切相關(guān)，利用甘薯CIN 基因家族的2000 bp 啟動(dòng)子區(qū)域分析其順式作用元件。IbCINs 的啟動(dòng)子順式作用元件有16 種，可分為4大類，根據(jù)每大類中順式元件數(shù)量從多到少依次為光響應(yīng)元件（AAAC-motif、ACA-motif、ACE、AE-box、ATCT-motif、Box 4、Box II、chs-CMA1a、chs-CMA2a、G-box、GAmotif、GATA-motif、GT1-motif、I-box、LAMPelement、L-box、MRE、Sp1、TCCC-motif、TCTmotif）、激素響應(yīng)元件（生長素AuxRR-core 和TGA-element；脫落酸ABRE、赤霉素GAREmotif、P-box、TATC-box；水楊酸TCA-element；茉莉酸甲酯CGTCA-motif 和TGACG-motif）、逆境脅迫響應(yīng)元件（低溫LTR、干旱MBS、缺氧ARE 和GC-motif、防御TC-rich repeats）和生長發(fā)育響應(yīng)元件（胚乳表達(dá)GCN4_motif、分生組織表達(dá)CAT-box；晝夜節(jié)律調(diào)控circadian、種子特異性元件RY-element、玉米醇溶蛋白代謝元件O2-site、細(xì)胞循環(huán)MSA-like）（圖5）。由于光響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件在CIN 基因中數(shù)量最多，推測光和激素是影響IbCIN 基因表達(dá)的主要因素。在光周期響應(yīng)方面，甘薯屬于短日照植物，短日照會(huì)促進(jìn)其開花。IbCIN1、IbCIN5、IbCIN6、IbCIN10、IbCIN11 具有最多的光響應(yīng)元件，推測這5 個(gè)基因可能和甘薯開花密切相關(guān)，而其他7個(gè)成員的光響應(yīng)元件相對(duì)較少。研究表明，對(duì)于塊根/塊莖作物，開花會(huì)抑制塊根/塊莖的膨大[38]，推測IbCIN1、IbCIN5、IbCIN6、IbCIN10、IbCIN11可能會(huì)抑制塊根膨大， 而其他7 個(gè)IbCINs（IbCIN2-4、IbCIN7-9、IbCIN12）則可能在甘薯塊根膨大中發(fā)揮重要作用。在激素響應(yīng)方面，脫落酸促進(jìn)甘薯塊根的形成[39]和膨大[40]。與其他家族成員相比，IbCIN1、IbCIN5-7 和IbCIN9-10 都包含相對(duì)較多的ABA 響應(yīng)元件，推測IbCIN1、IbCIN5-7 和IbCIN9-10 可能通過響應(yīng)ABA 來促進(jìn)甘薯塊根膨大。研究表明，赤霉素促進(jìn)木質(zhì)化從而抑制甘薯塊根生長[41]，而IbCIN4-9 和IbCIN12均不包含赤霉素響應(yīng)元件，因此推測IbCIN4-9 和IbCIN12 可能會(huì)促進(jìn)甘薯塊根膨大。

2.5 甘薯CIN 基因家族成員共線性分析和壓力選擇分析

使用TBtools 軟件的MCScanX 功能在IbCINs中共鑒定出2 個(gè)重復(fù)基因?qū)Γ渲蠭bCIN9-IbCIN11分布于不同的染色體上，而IbCIN2-IbCIN3位于同一染色體（圖6）。這2 個(gè)重復(fù)基因?qū)鶠槠螐?fù)制，沒有發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)，說明片段復(fù)制是IbCIN 基因進(jìn)化的主要?jiǎng)恿?，從而?dǎo)致功能冗余和亞/新功能化[42]。通過計(jì)算基因?qū)Φ腒a/Ks 值，發(fā)現(xiàn)這2 個(gè)重復(fù)基因?qū)Φ腒a/Ks＜1，說明IbCIN受純化選擇，IbCIN 在進(jìn)化過程的非同義突變是有害的，因而在甘薯進(jìn)化過程中處于劣勢而被淘汰。這表明CIN 在甘薯生長發(fā)育中發(fā)揮著重要且不可替代的作用，從而在甘薯進(jìn)化中具有很強(qiáng)的保守性。

2.6 IbCINs 在不同組織部位中的表達(dá)分析

為鑒定出與甘薯塊根膨大密切相關(guān)的IbCIN基因，本研究對(duì)12 個(gè)IbCIN 基因在甘薯幼葉、成熟葉、莖、花、60d 塊根等不同組織部位中的表達(dá)進(jìn)行分析（圖7）。IbCIN2-4、IbCIN7、IbCIN9-12等8個(gè)基因在5種組織部位中均有表達(dá)，其中IbCIN2-6 與IbCIN8-11 在塊根中的表達(dá)量最高，IbCIN7在花中的表達(dá)量最高，IbCIN12 在莖中的表達(dá)量最高。此外，IbCIN1 僅在成熟葉和幼葉中表達(dá)，且在幼葉中的表達(dá)量高于成熟葉。IbCIN5僅在莖和塊根中表達(dá)，且在塊根中的表達(dá)量最高。IbCIN6 和IbCIN8 僅在莖、花和塊根中表達(dá)，且在塊根中的表達(dá)量最高。IbCIN 基因的表達(dá)模式具有明顯的組織特異性，12 個(gè)IbCINs 中有9 個(gè)（IbCIN2-6 和IbCIN8-11）在塊根中的表達(dá)量最高，而其他3 個(gè)IbCINs 分別在幼葉（IbCIN1）、花（IbCIN7）和莖（IbCIN12）中的表達(dá)量最高。

2.7 IbCIN 基因在不同類型根系中的表達(dá)分析

為進(jìn)一步縮小影響甘薯塊根膨大的候選IbCIN 基因的范圍，對(duì)白色纖維根、紅色纖維根、柴根和60 d 塊根等4 種根系進(jìn)行取樣，測定其IbCIN 基因的表達(dá)水平（圖8）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IbCIN1在甘薯不同類型根系中均不表達(dá)，此結(jié)果和圖7的測定結(jié)果相吻合。IbCIN5 僅在紅色纖維根和塊根中表達(dá)，且在紅色纖維根中的表達(dá)量最高。其余10 個(gè)IbCINs 在所有類型根系中均有表達(dá)，其中IbCIN4、IbCIN8、IbCIN11、IbCIN12 等4個(gè)基因在塊根中的表達(dá)量最高，顯著高于在其他類型根系中的表達(dá)。IbCIN2、IbCIN3 和IbCIN9等3個(gè)基因在塊根、白色和紅色纖維根中的表達(dá)量較高，且差異不顯著。IbCIN7 和IbCIN10等2個(gè)基因在白色和紅色纖維根中的表達(dá)量較高，而IbCIN6 在柴根和紅色纖維根中的表達(dá)量較高。

由于在12 個(gè)IbCINs 中，只有IbCIN4、IbCIN8、IbCIN11 和IbCIN12 等4 個(gè)基因的表達(dá)水平在塊根中顯著高于其他3 種類型根系，因此推測IbCIN4、IbCIN8、IbCIN11 和IbCIN12 這4 個(gè)基因可能在甘薯塊根膨大中發(fā)揮著重要作用。IbCIN基因在不同組織部位（幼葉、成熟葉、莖、花、60 d 塊根）中的表達(dá)分析結(jié)果也顯示，IbCIN4、IbCIN8、IbCIN11 在塊根中的表達(dá)量最高。因此，推測IbCIN4、IbCIN8 和IbCIN11 等3 個(gè)基因可能是影響甘薯塊根膨大關(guān)鍵CIN 基因。

2.8 甘薯不同類型根系CIN 活性分析

甘薯不同類型根系的CIN 活性測定結(jié)果顯示，塊根中的CIN 活性顯著高于白色纖維根、紅色纖維根、柴根，且在這3 種根系中的CIN 活性差異不顯著（圖9）。表明CIN 在塊根膨大中發(fā)揮著重要的作用。不同類型根系IbCIN 基因的表達(dá)分析表明，塊根中只有4 個(gè)IbCINs（IbCIN4、IbCIN8 和IbCIN11-12）的表達(dá)水平顯著高于其他類型根系。推測IbCIN4、IbCIN8和IbCIN11 是決定塊根CIN 活性的關(guān)鍵基因，也是影響甘薯塊根膨大關(guān)鍵CIN 基因。

3討論

CIN 在植物中廣泛存在，可通過不同途徑調(diào)控植物根系的生長發(fā)育。首先，CIN 可通過促進(jìn)根系中蔗糖的分解降低其濃度，最終促進(jìn)蔗糖由葉片向根系的轉(zhuǎn)運(yùn)，為根系生長提供碳骨架和能量，如EMS 誘導(dǎo)水稻CIN 基因OsCyt-inv1 突變導(dǎo)致根系己糖含量下降，同時(shí)根系伸長區(qū)細(xì)胞皺縮和根系變短，而外源供應(yīng)3%葡萄糖可以恢復(fù)根系生長，表明蔗糖向根系的轉(zhuǎn)運(yùn)和分解受阻可能是根系生長受阻的重要原因[22]。其次，過氧化物酶（peroxidase， POD）是木質(zhì)素合成過程中的關(guān)鍵酶[43-44]，而CIN 可抑制POD 的表達(dá)[34]，因此推測CIN 可通過抑制POD 來減緩植物根系木質(zhì)化進(jìn)程，從而促進(jìn)根系的生長發(fā)育。此外，CIN 還可通過糖信號(hào)途徑對(duì)植物根系發(fā)育進(jìn)程進(jìn)行調(diào)控[19]，如，CIN 可通過調(diào)控葡萄糖含量來影響擬南芥根系發(fā)育關(guān)鍵激素ABA 的合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]。本課題組前期對(duì)不同發(fā)育時(shí)期塊根中的4 種蔗糖分解酶活性測定和相關(guān)性分析也表明，CIN 是調(diào)控甘薯塊根膨大的關(guān)鍵蔗糖分解酶之一[45]。

近年來，多種植物的CIN 基因家族已經(jīng)被鑒定出來并進(jìn)行相應(yīng)的功能研究。本研究首次在甘薯基因組中鑒定出12 個(gè)CIN 基因家族成員，并依據(jù)其在染色體上的先后順序命名為IbCIN1-12。這和其他植物物種中鑒定出的CIN 家族成員的數(shù)量基本相當(dāng)，如擬南芥為9 個(gè)[10]，水稻為8 個(gè)（OsNINV1-8）[10]，木薯為10 個(gè)（MeNINV1-10）[27]，楊樹為16 個(gè)（PtrNINV1-16）[26]。對(duì)甘薯CIN 家族蛋白理化性質(zhì)分析表明， IbCIN 蛋白中除IbCIN10 外不穩(wěn)定指數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白，這與前人的研究結(jié)果一致，即與CWIN 和VIN 不同，由于CIN 蛋白沒有糖基化，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，非常容易分解[9]。此外，12 個(gè)IbCIN 蛋白均含有CIN 蛋白特有的Glyco_hydro_100 保守結(jié)構(gòu)域，上述結(jié)果表明，這12 個(gè)IbCINs 確實(shí)屬于CIN基因家族。

通過測定IbCIN 在不同組織中以及不同類型根系中的表達(dá)水平， 推測在塊根中高表達(dá)的IbCIN4、IbCIN8 和IbCIN11 基因可能為調(diào)控甘薯塊根膨大的關(guān)鍵CIN 基因。對(duì)不同類型根系中CIN 活性的測定表明，上述3 個(gè)基因在塊根中同時(shí)也表現(xiàn)出更高的CIN 活性，進(jìn)一步證明IbCIN4、IbCIN8 和IbCIN11 等3 個(gè)基因可能是調(diào)控甘薯塊根膨大的關(guān)鍵CIN 基因。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)IbCIN1、IbCIN7、IbCIN10和IbCIN12 等4 個(gè)基因與擬南芥和木薯根系發(fā)育相關(guān)CIN 基因的親緣關(guān)系較近，推測這4 個(gè)基因可能也和甘薯根系發(fā)育密切相關(guān)。然而，和其他組織部位（葉片、花和莖）、其他類型根系相比，這4 個(gè)基因在塊根中的表達(dá)水平并不是最高，可能不是調(diào)控甘薯塊根膨大的關(guān)鍵基因。推測這4個(gè)基因可能與非塊根類型根系的發(fā)育密切相關(guān)，例如IbCIN7、IbCIN10 在白色和紅色纖維根中表達(dá)水平較高，而IbCIN12 在柴根中表達(dá)較高。生物信息學(xué)分析結(jié)果也從不同角度揭示IbCIN4、IbCIN8、IbCIN11 基因可能通過不同機(jī)制調(diào)控甘薯塊根的發(fā)育。

首先，在這3 個(gè)基因中，IbCIN8 屬于α1 亞組，位于質(zhì)體中，而IbCIN4 和IbCIN11 屬于β 亞組，位于細(xì)胞質(zhì)中。質(zhì)體作為儲(chǔ)藏淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等生物大分子的細(xì)胞器，在甘薯中主要用來儲(chǔ)藏淀粉。上述證據(jù)表明，位于質(zhì)體中的α1亞組IbCIN8 可通過分解蔗糖為質(zhì)體自身的發(fā)育提供能量和物質(zhì)供應(yīng)，從而為淀粉的儲(chǔ)藏提供場所和空間，而位于細(xì)胞質(zhì)中的β 亞組IbCIN4 和IbCIN11 可通過分解蔗糖降低塊根中蔗糖的濃度，從而促進(jìn)蔗糖由葉片向塊根轉(zhuǎn)運(yùn)，為塊根的膨大和淀粉的合成提供能量和碳骨架。因此，這3 個(gè)IbCIN 基因可能協(xié)同合作，共同通過促進(jìn)蔗糖向塊根的轉(zhuǎn)運(yùn)以及分解代謝來促進(jìn)塊根的生長發(fā)育。

其次，這3 個(gè)基因中IbCIN4 和IbCIN11 均屬于β 亞組。保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析表明，α1、α2亞組成員之間在保守基序和基因結(jié)構(gòu)上差異較小、相對(duì)保守，而β 亞組成員之間則差異較大，表明β 亞組CIN 基因在甘薯栽培種的進(jìn)化過程中經(jīng)歷了結(jié)構(gòu)缺失和變異，這可能導(dǎo)致其在功能上的多樣化，從而可以參與更多的生物過程[37]，包括塊根的生長發(fā)育。本課題組前期的研究也表明，甘薯2個(gè)近緣野生種I. trifida 和I. triloba 均具有10個(gè)CIN基因成員，且這20 個(gè)CIN 基因的保守基序和基因結(jié)構(gòu)與甘薯栽培種的α1、α2亞組更相似，而與甘薯栽培種的β亞組差異較大（結(jié)果未列出）。由于2個(gè)近緣野生種根系基本不發(fā)生膨大，從而推測β 亞組的IbCIN4 和IbCIN11 可能與甘薯塊根的膨大密切相關(guān)。

最后，研究表明對(duì)于塊根/塊莖作物，開花會(huì)抑制塊根/塊莖的膨大[38]。在光周期響應(yīng)方面，甘薯屬于短日照植物，短日照會(huì)促進(jìn)其開花，但會(huì)抑制塊根膨大。通過分析甘薯CIN 基因的啟動(dòng)子順式作用元件，發(fā)現(xiàn)在12 個(gè)IbCIN 基因中，IbCIN8具有最少的光響應(yīng)元件，推測其不受光周期影響，從而可以抑制開花并促進(jìn)塊根膨大。此外，研究表明赤霉素促進(jìn)木質(zhì)化從而抑制甘薯塊根的形成和生長[41]，而IbCIN4 和IbCIN8 都不包含赤霉素響應(yīng)元件，因此推測IbCIN4 和IbCIN8 可能通過減弱赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來促進(jìn)塊根膨大。

通過對(duì)甘薯CIN 基因家族進(jìn)行鑒定，本研究共獲得12個(gè)甘薯CIN 基因家族成員。通過對(duì)甘薯CIN基因在不同組織部位和不同類型根系中表達(dá)的特異性分析，初步鑒定出IbCIN4、IbCIN8和IbCIN11在塊根中的表達(dá)高于其他組織部位和其他類型的根系，與這3 個(gè)CIN 基因在塊根中的高表達(dá)相對(duì)應(yīng)，塊根中的CIN活性也顯著高于其他類型根系，因此IbCIN4、IbCIN8和IbCIN11可能是調(diào)控甘薯塊根膨大的關(guān)鍵CIN基因。此外，通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析、保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析、基因啟動(dòng)子順式作用元件分析，進(jìn)一步證明這3個(gè)基因可能通過調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、光周期反應(yīng)和赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑和機(jī)制來共同促進(jìn)甘薯塊根的發(fā)育。本研究可為后續(xù)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)等手段深入研究甘薯CIN 基因的功能奠定基礎(chǔ)。