木薯MeYippee1基因的克隆、表達及互作蛋白研究

關鍵詞：MeYippee1；表達模式；酵母雙雜交

中圖分類號：S533 文獻標志碼：A

木薯是世界上最重要的主食作物之一，尤其在全球范圍內(nèi)的貧困地區(qū)，木薯淀粉是人們獲取熱量的主要來源[1]。解析木薯淀粉合成和產(chǎn)量形成的分子機理對木薯高產(chǎn)、高淀粉育種具有重要意義。淀粉主要由葡萄糖分子通過糖基轉(zhuǎn)移酶的作用聚合而成，主要在葉綠體和淀粉體內(nèi)合成，涉及ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）、去支鏈酶（DBE）等[2]。植物激素在調(diào)節(jié)淀粉合成中扮演著重要角色，盡管它們并不直接參與淀粉的生物合成途徑。植物激素，如生長素（auxin）、赤霉素（gibberellins）、細胞分裂素（cytokinins）和脫落酸（abscisic acid）等通過影響植物的生長發(fā)育和淀粉合成途徑來間接調(diào)控淀粉的合成。脫落酸（ABA）和吲哚-3-乙酸（IAA）與玉米胚乳發(fā)育早期和中期淀粉合成相關基因的表達顯著相關[3]。ABA 誘導了荷花轉(zhuǎn)錄因子基因NnABI4 表達上調(diào)，而NnABI4 可結合淀粉合成酶基因NnSS1 的啟動子促進其表達，從而增強荷花根莖中的淀粉積累[4]。IAA、GA₃（赤霉素）和ZR（玉米素）作為生長促進劑，能夠刺激木薯營養(yǎng)器官的生長，進而增加光合產(chǎn)物的生成；而ABA 作為生長抑制劑，可以減緩營養(yǎng)器官的發(fā)育，限制塊根的縱向生長，同時促進塊根的橫向擴張和體積增大[5]。植物激素調(diào)控木薯塊根形成和淀粉積累的機理有待進一步解析。

SAUR（small auxin up RNA）是一類與生長素信號傳導相關的基因家族。在植物中，SAUR基因家族編碼的蛋白質(zhì)通常參與調(diào)節(jié)生長素的響應，在調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育和適應環(huán)境變化中起著重要作用。實驗室前期研究證明， 木薯MeSAUR1 結合AGPase 的小亞基編碼基因MeAGPS1a 的啟動子正調(diào)控該基因的表達，表明MeSAUR1 間接參與了木薯淀粉的合成。酵母雙雜交試驗篩選出1 個Yippee 蛋白成員MeYippee1是MeSAUR1 的候選互作蛋白。Yippee 蛋白是一種高度保守的鋅指結合蛋白，其同源基因廣泛存在于真菌、植物、動物等多種真核生物中。鋅指蛋白在生物體中扮演著多種重要角色，尤其是在基因表達調(diào)控、細胞分化、胚胎發(fā)育等生命過程中，能夠與DNA、RNA、蛋白質(zhì)或其他小分子特異性結合，從而參與轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的基因表達調(diào)控。Yippee 蛋白在植物中的生物學功能解析較少。過表達水稻OsYIPL1 基因可以提升水稻的萌發(fā)率[6]。另外，Yippee 蛋白基因家族還能調(diào)控植物細胞的增殖分化，有研究表明其家族成員與MAPK 信號通路相互作用，從而影響細胞的生長；Yippee 蛋白可能還與免疫反應有關，有研究證明它可以調(diào)節(jié)植物抵抗病原體的侵染[7]。上述研究進展為解析Yippee 基因在植物生理過程中的作用提供了寶貴的信息。

木薯MeYippee1 基因的具體功能尚不清楚。本研究克隆MeYippee1 的編碼區(qū)，開展序列分析及基因在不同組織中的表達模式研究，通過酵母雙雜交技術驗證MeYippee1 與MeSAUR1 之間的相互作用，研究結果為進一步研究MeYippee1 在木薯淀粉積累過程中的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

華南8 號（SC8）木薯采自國家木薯種質(zhì)資源圃；RNA 提取試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶購自莫納生物科技有限公司；qRT-PCR 酶購自諾瓦生物公司；克隆基因聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Omega Bio-Tek 公司；缺陷培養(yǎng)基（SD）購自北京酷來搏科技有限公司；大腸桿菌DH5α、酵母菌AH109 購自上海唯地生物技術有限公司；酵母雙雜交載體質(zhì)粒pGBKT7-p53、pGADT7-T、pGBKT7-lam、pGBKT7、pGADT7 由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 MeYippee1 基因的克隆參照 RNA 提取試劑盒Plant Total RNA Isolation Kit Plus 的說明書提取RNA。并用MonScript^TM RTIII All-in-OneMix with dsDNase 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫提供的MeYippee1 的CDS 序列信息，利用Primer Premier 5.0 軟件設計MeYippee1 的上、下游引物，并命名為MeYippee1-BD-F/R（表1），在北京擎科生物科技股份有限公司合成。以cDNA 為模板，MeYippee1-BD-F/R 為引物擴增MeYippee1。反應體系（50 μL）：2×PCRSolution Prime STAR HS （Premix） 25 μL ，MeYippee1-BD-F 1 μL；MeYippee1-BD-R 1 μL，ddH2O 22 μL，cDNA 模板1 μL。擴增程序：94 ℃5 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。16 ℃保存產(chǎn)物。

1.2.2 MeYippee1 的生物信息學分析通 過GSDS（https：//gsds.gao-lab.org/）在線軟件預測木薯MeYippee1 基因的結構； 通過ProParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件預測木薯MeYippee1 的理化性質(zhì)；通過TMHMM（TMHMM 2.0-DTU Health Tech-BioinformaticServices）在線軟件預測MeYippee1 蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域；通過SignalP-6.0（SignalP 6.0-DTU HealthTech-Bioinformatic Services ） 在線軟件預測MeYippee1 蛋白質(zhì)的信號肽區(qū)域；通過NetPhos（NetNGlyc 1.0-DTU Health Tech-BioinformaticServices）在線軟件預測該蛋白的磷酸化位點；通過Wolf PSORT[WoLF PSORT： Protein SubcellularLocalization Prediction （hgc.jp）] 在線網(wǎng)站對MeYippee1 蛋白質(zhì)的亞細胞定位進行預測；使用MEGA7.1 軟件的Neighbor-Joining 法構建MeYippee1 系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 MeYippee1 的表達模式分析 設計MeYippee1基因的qPCR 引物并命名為MeYippee1-real-F/R（表1），以木薯Tublin 基因作為內(nèi)參基因，設計其qPCR 引物并命名為Tublin-F/R（表1），進行熒光定量分析。反應體系（10 μL）：MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 5 μL ， MeYippee1-real-F0.2 μL ， MeYippee1-real-R 0.2 μL ； 的ddH2O2.6 μL，模板2 μL。反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，41 個循環(huán)。

1.2.4 MeYippee1 蛋白的毒性和自激活檢測 將pGBKT7 和pGBKT7-MeYippee1 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至AH109 酵母，并在色氨酸缺陷型培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察酵母的生長情況，檢測MeYippee1 蛋白是否對酵母生長有影響。將pGADT7 和pGBKT7- MeYippee1共同轉(zhuǎn)化到AH109 酵母，在色氨酸、亮氨酸缺陷型培養(yǎng)基（SD/T），色氨酸、亮氨酸、組氨酸、腺嘌呤缺陷型培養(yǎng)基（SD/TLHA）和含有X-α-Gal的色氨酸、亮氨酸、組氨酸、腺嘌呤缺陷型培養(yǎng)基（SD/TLHA+X-α-Gal）上分別培養(yǎng)，觀察酵母的生長情況，檢測MeYippee1 蛋白是否自激活。

1.2.5 MeYippee1 與MeSAUR1 酵母雙雜交點對點驗證 將pGBKT7-MeYippee1 和pGADT7-MeSAUR1共轉(zhuǎn)化至AH109 酵母，篩選出陽性克隆。將陽性菌株及對照菌株點種在不同培養(yǎng)基上，檢查生長情況和顏色變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用鄧肯法進行單因素多樣本差異顯著性方差分析。

2 結果與分析

2.1 MeYippee1 基因的克隆與生物信息學分析

2.1.1 MeYippee1 基因的克隆 本研究以SC8 木薯品種的cDNA 為模板，設計特異性引物進行RT-PCR，獲得目的條帶（圖1）?；驕y序發(fā)現(xiàn)，MeYippee1 基因的CDS 區(qū)長度為321 bp，編碼106個氨基酸。與phytozome（http：//phytozome-next.jgi.doe.gov/ ） 數(shù)據(jù)庫中AM560 木薯品種的MeYippee1 基因序列對比發(fā)現(xiàn)，有1 個堿基有差別，SC8 木薯的MeYippee1 基因第256 個堿基為“C”，而AM560木薯的MeYippee1 基因在該位置的堿基為“T”（圖2）。核苷酸的差異導致了氨基酸序列的改變，SC8 木薯MeYippee1 蛋白的第86 個氨基酸為“P”，而AM560 木薯MeYippee1蛋白在該位置的氨基酸則為“S”（圖3）。

2.1.2 MeYippee1 基因的生物信息學分析 通過ProParam 在線預測木薯MeYippee1 蛋白分子式為C548H851N155O154S6，分子質(zhì)量（Mw）約為12.27 kDa，理論等電點（pI）為8.69，不穩(wěn)定系數(shù)為14.55，為穩(wěn)定蛋白，總平均親水系數(shù)為–0.377，表明該蛋白屬于親水蛋白。該蛋白含有20 種氨基酸殘基，其中Ala（A）含量與Lys（K）最高，均占8.50%，Pro（P）的含量最低，占0.90%（表2）。

MeYippee1 蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域預測結果表明MeYippee1 蛋白沒有跨膜區(qū)域。通過SignalP-6.0軟件預測MeYippee1 蛋白質(zhì)的信號肽區(qū)域發(fā)現(xiàn)，MeYippee1 蛋白質(zhì)無Sec/SPI 信號肽，不屬于分泌蛋白和跨膜蛋白，符合TMHMM 軟件的預測結果。通過NetPhos 軟件預測該蛋白的磷酸化位點發(fā)現(xiàn)MeYippee1 蛋白可能含有4 個磷酸化位點。MeYippee1 蛋白質(zhì)的亞細胞定位預測結果顯示，該蛋白最有可能定位于細胞質(zhì)中，其次是在線粒體中。

2.1.3 MeYippee1 系統(tǒng)進化樹分析 將MeYippee1序列選取與相似程度比較高的19 種其他物種的Yippee 序列[ 紫樹（ Nyssa sinensis，KAA8533573.1）、巴西橡膠（Hevea brasiliensis，XP_021661656.1 ） 、云南金錢槭（ Dipteroniadyeriana，KAK2658520.1 ） 、文冠果（ Xanthocerassorbifolium，KAH7543806.1）、茶樹（Camelliasinensis、XP_028081361.1）、狹葉羽扇豆（Lupinusangustifolius， XP_019415243.1）、木豆（Cajanuscajan， XP_020226898.1）、白羽扇豆（Lupinus albus，KAF1893681.1）、決明（Senna tora， KAF7830747. 1）、薯蕷（Diospyros lotus， XP_052183539.1）、酸棗（Ziziphus jujuba var. Spinosa， XP_015886610.1）、蓮藕（Nelumbo nucifera、XP_010267494.1）、東方銀耳（Trema orientale， PON81226.1）、栓皮櫟（ Quercus suber 、XP_023912069.1） 、麻瘋樹（Jatropha curcas， XP_012084536.1）、白花羊蹄甲（Bauhinia variegata， KAI4338001.1）、牧豆樹（Prosopis cineraria， XP_054799767.1）、大葉櫟（ Quercus lobata， XP_030934691.1） 、土瓶草（ Cephalotus follicularis， GAV82826.1 ） ] 構建MeYippee1 系統(tǒng)進化樹，結果顯示，與MeYippee1親緣關系最近的是巴西橡膠樹（圖4）。

2.2 MeYippee1 的表達模式分析

采用qRT-PCR 技術分析MeYippee1 在SC8木薯的嫩葉、成熟葉、葉柄、塊根、須根、腋芽、頂芽、莖等8 個不同組織部位的表達模式。結果發(fā)現(xiàn)，MeYippee1 在腋芽的表達量最高，其次為須根、塊根和成熟葉，在莖和葉柄的表達量較低，在頂芽和嫩葉表達量最低（圖5A）。利用本實驗室前期獲得SC8 木薯形成期塊根（種植后80 d）、膨大期塊根（種植后130 d 和180 d）和成熟期塊根（種植后230 d 和280 d）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析木薯SC8 塊根不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組的表達情況，發(fā)現(xiàn)MeYippee1 主要在塊根形成期表達，且與其他時期的表達差異顯著（圖5B）。

2.3 MeYippee1 蛋白的毒性和自激活檢測

2.3.1 MeYippee1 蛋白毒性檢測 在酵母雙雜交實驗前，需確保外源蛋白不抑制酵母生長。將BD-MeYippee1 與BD 載體分別轉(zhuǎn)化至AH109 酵母，通過比較生長情況來評估目標酵母生長是否受抑制。結果顯示，2種酵母菌斑生長相似（圖6），表明MeYippee1 蛋白無細胞毒性，適合進行后續(xù)的蛋白互作研究。

2.3.2 自激活檢驗 將BD-MeYippee1 與AD 載體共同轉(zhuǎn)入AH109 酵母菌株進行自激活檢驗。共轉(zhuǎn)化BD-MeYippee1 和AD 載體的酵母菌、陽性對照（AD-Large T+BD-p53）和陰性對照（ADLargeT+BD-laminc）的酵母菌在SD/TL 的培養(yǎng)基上均能生長。只有陽性對照在SD/TLHA 和SD/TLHA+X- α -Gal 培養(yǎng)基上生長， 且其菌斑在SD/TLHA+X-α-Gal 培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍色（圖7），表明MeYippee1 蛋白不具備自激活特性。

2.4 MeYippee1 與MeSAUR1 酵母雙雜交點對點驗證

本研究采用酵母雙雜交技術來探究MeSAUR1 與MeYippee1 之間的相互作用。將含有AD-MeSAUR1 和BD-MeYippee1 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母菌中，并在不同的選擇性培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。在SD/TL、SD/TLHA 以及SD/TLHA+X-α-Gal 培養(yǎng)基上， 轉(zhuǎn)基因酵母菌均能正常生長， 而在SD/TLHA+X- α-Gal 培養(yǎng)基上，酵母菌落呈現(xiàn)藍色（藍色是β-半乳糖苷酶活性的指示），表明在SD/TLHA 培養(yǎng)基中，MeSAUR1 與MeYippee1 之間發(fā)生了相互作用（圖8）。

3 討論

木薯淀粉的合成涉及多種酶，包括ADPG 焦磷酸化酶、顆粒結合淀粉合酶、淀粉合酶、淀粉分支酶（SBE）、脫支酶[8-12]等，這些酶在淀粉生物合成過程中起著關鍵作用。研究人員已通過轉(zhuǎn)基因、基因編輯等方式驗證了MeGBSSI、MeSBE2.1、MeSBE2.2 等基因參與淀粉合成[13]。IHEMERE 等[14]通過在木薯中表達改良的細菌glgC 基因，成功地增加了AGPase 活性，導致轉(zhuǎn)基因木薯的淀粉產(chǎn)量顯著增加。還有報道指出通過RNA 干擾技術降低木薯中2 個淀粉分支酶基因（BE1 和BE2）的表達，成功培育出了含有高比例直鏈淀粉的木薯品種[15]。然而，木薯淀粉合成相關基因的表達調(diào)控研究較少，調(diào)控網(wǎng)絡有待解析，Yippee 基因家族成員已被證實參與調(diào)控細胞分裂和器官發(fā)育[16]，但是尚未有該基因家族參與淀粉合成相關基因表達調(diào)控的報道。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)ADPG 焦磷酸化酶小亞基基因MeAGPS1a 受MeSAUR1 正調(diào)控，本研究通過酵母雙雜交實驗進一步證明MeSAUR1 與MeYippee1 存在互作關系。

生長素參與植物庫器官的發(fā)育及淀粉的合成調(diào)控。生長素在水稻淀粉合成中起正調(diào)控作用，水稻籽粒發(fā)育過程中生長素和淀粉濃度同時增加。施用IAA 可增加籽粒的淀粉含量，降低水稻生長素響應因子基因OsARF18 表達，導致生長素信號傳導改變，影響水稻生長、發(fā)育及淀粉合成[17]。豌豆的生長素生物合成基因PsTAR2 突變體的IAA 含量顯著降低，這一結果導致AGPase 大亞基的編碼基因PsAGPL1 表達量顯著降低，使得AGPase 活性降低3 倍，突變體的豌豆種子變小，淀粉含量顯著減少[18]。木薯塊根發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，生長素信號的增強與淀粉儲存代謝的激活密切相關。在木薯塊根形成期，須根發(fā)育膨大形成塊根[19]，塊根內(nèi)源生長素IAA 含量顯著提高[5]。在木薯塊根形成的過程中，生長素相關基因（ARF、SAUR、AUX1 等）的表達水平提高，促進塊根的次生生長和淀粉合成。本研究發(fā)現(xiàn)MeYippee1 基因主要在木薯塊根形成期表達，因此推測MeYippee1和生長素信號傳導相關蛋白MeSAUR1 互作，協(xié)同響應生長素對木薯塊根發(fā)育和淀粉積累的調(diào)控。后續(xù)研究中，將進一步分析MeSAUR1 和MeYippee1 互作對MeAGPS1a 表達的影響，通過轉(zhuǎn)基因驗證MeYippee1 在木薯塊根形成和淀粉積累過程中的功能。