塔里木馬鹿CP2U1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其生物信息學(xué)分析

摘 要：為了分析塔里木馬鹿（Cervus elaphus yarkandensis）細(xì)胞色素P450 2U1（CP2U1）基因的結(jié)構(gòu)和相關(guān)功能，利用RT-PCR方法獲取塔里木馬鹿CP2U1基因288 bp的CDS序列，并構(gòu)建其真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-CeyCP2U1。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：該基因能編碼95個(gè)氨基酸，氨基酸組分中沒有天冬酰胺；其蛋白為疏水性、不穩(wěn)定蛋白，沒有跨膜區(qū)、信號(hào)肽、N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)，但具有8個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)；塔里木馬鹿CP2U1與東歐馬鹿和白尾鹿的相似性最高，而與褐家鼠的同源性最低.；CP2U1蛋白在適應(yīng)極端干旱環(huán)境中發(fā)揮潛在的作用。

關(guān)鍵詞：塔里木馬鹿；CP2U1基因；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：2095–3305（2024）09–00-03

CP2U1（Cytochrome P450 2U1）基因?qū)儆诩?xì)胞色素

P450超家族的一員，其唯一的酶活性是不飽和脂肪酸的氧化，可能在調(diào)節(jié)腦血流和免疫功能方面發(fā)揮重要作用。CP2U1基因還可以作用于二十二碳六烯酸（DHA）或二十碳五烯酸（EPA）等脂肪酸，這些脂肪酸與降低甘油三酯水平和降低患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[1]。

塔里木馬鹿（Cervus elaphus yarkandensis）是新疆維吾爾族自治區(qū)塔里木盆地特有的耐旱鹿科動(dòng)物。該物種對(duì)塔里木盆地的極端干旱環(huán)境表現(xiàn)出高度的適應(yīng)性，能夠耐受高礦化度的鹽堿水和鹽堿度較高的飼料[2-3]。在前期研究中，利用FST-θπ和XP-EHH選擇消除對(duì)塔里木馬鹿極端干旱環(huán)境適應(yīng)性機(jī)制進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，塔里木馬鹿CP2U1（CeyCP2U1）基因具有較強(qiáng)的選擇性信號(hào)，并在功能上參與花生四烯酸代謝途徑[4]。該基因產(chǎn)物將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為19（S）-HETE（羥基二十碳四烯酸）或20-HETE，在極端干旱環(huán)境中的CP2U1基因受到強(qiáng)烈的選擇作用并富集到花生四烯酸代謝通路，參與水的重吸收[5-6]。因此，推測CeyCP2U1基因與塔里木馬鹿適應(yīng)干旱、沙漠環(huán)境間存在一定的聯(lián)系。然而，有關(guān)塔里木馬鹿CP2U1基因還未有研究報(bào)道。

基于此，對(duì)CeyCP2U1進(jìn)行基因擴(kuò)增、克隆及測序，利用在線軟件對(duì)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為后續(xù)深入研究塔里木馬鹿乃至其他藥用動(dòng)物CP2U1基因的作用機(jī)制提供理論依據(jù)和初步實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑

實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑有：塔里木馬鹿皮膚組織、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、pcDNA3.1（+）質(zhì)粒載體、First Strand cDNA Synthesis Kit、限制性核酸內(nèi)切酶、Trizol、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、Tris等。

1.2 塔里木馬鹿CP2U1基因CDS序列的RT-PCR擴(kuò)增

從塔里木馬鹿轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中選擇CeyCP2U1基因CDS序列，設(shè)計(jì)帶有BamH I和EcoR I核酸酶切位點(diǎn)相互補(bǔ)配對(duì)的引物序列，并進(jìn)行人工合成，引物序列信息F（BamHI）：ttaagcttggtaccgagctcGGATCCATGGGGAAGCAGAGGATACGGAT，R（EcoRI）：cactgtgctggatatctgcaGAATTCTCAATCCATGGGTCTGGAAGATCCC。其中，引物序列中的小寫字母和下劃線部分分別表示同源臂序列和酶切位點(diǎn)序列，擴(kuò)增序列長度為288 bp。取塔里木馬鹿皮膚組織，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并對(duì)目的基因條帶進(jìn)行純化回收。

1.3 塔里木馬鹿CP2U1基因表達(dá)載體的構(gòu)建

從含載體質(zhì)粒的菌液中提取質(zhì)粒。用BamH I和EcoR I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行膠回收。將pcDNA3.1（+）載體與CP2U1基因的CDS片段進(jìn)行重組。用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α對(duì)重組子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并對(duì)陽性克隆進(jìn)行鑒定。同時(shí)，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定并送至測序鑒定。將測序成功的序列進(jìn)行比對(duì)，重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1（+）-CeyCP2U1表達(dá)載體。

1.4 塔里木馬鹿CP2U1基因的生物信息學(xué)分析

擬用DNAStar軟件中的MegAlign程序?qū)y序得到的塔里木馬鹿CP2U1基因序列與從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的東歐馬鹿（Cervus elaphus）、牛（Bos taurus）、綿羊（Ovis aries）、野駱駝（Camelus ferus）、貓（Felis catus）等16種哺乳動(dòng)物和人（Homo sapiens）CP2U1基因的CDS序列進(jìn)行同源性比對(duì)。利用MEGA 11.0中的最大似然樹（Maximum Likelihood，ML）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并利用多種在線軟件，如ProtParam、ProtScale、NetNG-lyc-1.0、NetOGlyc-4.0、NetPhos-3.1、SignalP-5.0、TMHMM-2.0、PSORT II、SOPMA、SWISS-MODEL和STRING 11.5，對(duì)氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行初步預(yù)測和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 塔里木馬鹿CP2U1基因的RT-PCR擴(kuò)增

利用RT-PCR方法，CeyCP2U1基因CDS序列特異引物來擴(kuò)增基因片段后進(jìn)行的15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示，在250 bp上方處出現(xiàn)特異條帶。此條帶大小與預(yù)期的該基因CDS序列的大小相一致（288 bp），表明獲得了CeyCP2U1基因CDS序列。

2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-CeyCP2U1的構(gòu)建

將pcDNA3.1（+）載體與CeyCP2U1基因的CDS片段進(jìn)行重組并轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆進(jìn)行測序獲得清晰、單一的測序峰，如圖2所示，重組子的酶切結(jié)果出現(xiàn)的條帶大小與CeyCP2U1擴(kuò)增得到的基因產(chǎn)物大小相符。經(jīng)過比對(duì)，重組子的堿基序列與CeyCP2U1基因預(yù)期序列一致。以上結(jié)果表明，確認(rèn)該基因表達(dá)載體成功構(gòu)建并命名為pcDNA3.1（+）-CeyCP2U1。

2.3 塔里木馬鹿CP2U1基因的生物信息學(xué)分析

利用MEGA 11.0軟件，將塔里木馬鹿測序獲得的CP2U1基因序列與從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載東歐馬鹿、牛、綿羊、野駱駝、貓等16種哺乳動(dòng)物和人CP2U1基因的CDS序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，塔里木馬鹿CP2U1基因與本研究所使用的其他哺乳動(dòng)物之間的相似性為57.3%～100%，其中，塔里木馬鹿與東歐馬鹿的相似性最高（100%），其次是與白尾鹿的相似性（92.2%），而與褐家鼠的同源性（57.3%）最低。

以褐家鼠為外群，對(duì)以上物種CP2U1構(gòu)建ML系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖4所示，塔里木馬鹿與鹿科動(dòng)物的親緣關(guān)系最近，其次與?？苿?dòng)物和麝科動(dòng)物的親緣關(guān)系較近，而與嚙齒類動(dòng)物的親緣性較遠(yuǎn)，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與同源性比對(duì)結(jié)果相一致。

2.4 塔里木馬鹿CP2U1基因的生物信息學(xué)分析

塔里木馬鹿CP2U1基因CDS序列編碼95個(gè)氨基酸。利用在線軟件ProtParam對(duì)該基因氨基酸序列進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，CP2U1氨基酸相對(duì)分子質(zhì)量為10 717.75，分子式為C470H759N135O127S12，理論等電點(diǎn)pI值是8.92；氨基酸組分中亮氨酸和絲氨酸含量最高，占11.6%，沒有天冬酰胺；正電荷殘基數(shù)和負(fù)電荷殘基數(shù)的比例為6∶10；半衰期為30 h；脂肪系數(shù)為91.26，不穩(wěn)定系數(shù)為59.73，推測為不穩(wěn)定蛋白。通過在線分析工具Protscale對(duì)蛋白親疏水性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)總平均親水性值為0.088，疏水氨基酸（正值）稍多于親水性氨基酸（負(fù)值），91位的絲氨酸分值最低（-1.667），親水性最強(qiáng)；82位的纈氨酸分值最高（1.889），疏水性最強(qiáng)。從整體來看，可以推測塔里木馬鹿CP2U1蛋白為疏水性蛋白。

從信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果可以看出，塔里木馬鹿CP2U1蛋白沒有信號(hào)肽也不存在跨膜區(qū)（圖5）。

亞細(xì)胞定位結(jié)果表明：該蛋白分別定位在線粒體（43.5%）、細(xì)胞核（39.1%）、細(xì)胞外，包括細(xì)胞壁（13.0%）和細(xì)胞骨架（4.3%）等部位。塔里木馬鹿CP2U1蛋白共有8個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括7個(gè)絲氨酸（第23、27、29、64、87、90和91位點(diǎn)）和1個(gè)蘇氨酸（第30位點(diǎn)），而沒有酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。其中，第23位的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)可能與DNA損傷修復(fù)過程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶相結(jié)合，第27、29的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)和第30位的蘇氨酸點(diǎn)酸磷酸化位點(diǎn)可能與蛋白激酶C相結(jié)合，第64位的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)可能與細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5相結(jié)合，第87、90和91位的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)可能與非特異性預(yù)測的活性激酶相結(jié)合。由于塔里木馬鹿CP2U1蛋白沒有天冬酰胺氨基酸成分，因此，沒有N-糖基化位點(diǎn)，也沒有O-糖基化位點(diǎn)。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果表明：無規(guī)則卷曲是構(gòu)成該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最多的組分（44.21%），β-轉(zhuǎn)角的含量最少（5.26%）。該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相一致。

互作蛋白預(yù)測結(jié)果顯示：塔里木馬鹿CP2U1蛋白可能與屬于細(xì)胞色素P450家族的CYP2J2、CYP4F2、CYP2E1、CYP4A22、CYP4A11、CYP4F2-2、未鑒定的蛋白質(zhì)LOC100295883、LOC534967、LOC509506和LOC784417等蛋白之間存在潛在的相互作用。

3 結(jié)論

CP2U1在腺、腦、胸腎、肺或心臟等組織的血流調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，在線粒體功能調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮著潛在的作用[6]。

從同源性比對(duì)結(jié)果可以看出，塔里木馬鹿CP2U1與東歐馬鹿和白尾鹿的相似性最高，而與褐家鼠的同源性最低，系統(tǒng)進(jìn)化樹也證實(shí)了此結(jié)果，符合該物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

利用在線軟件對(duì)CP2U1基因的核苷酸及其編碼氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行初步預(yù)測和分析，該基因能編碼95個(gè)氨基酸，氨基酸組分中沒有天冬酰胺，因此其蛋白沒有N-糖基化位點(diǎn)，也沒有O-糖基化位點(diǎn)。推測塔里木馬鹿CP2U1為疏水性、不穩(wěn)定蛋白。

根據(jù)研究中互作蛋白預(yù)測結(jié)果，可以推測出塔里木馬鹿CP2U1蛋白可能通過細(xì)胞色素P450家族蛋白質(zhì)之間的相互作用發(fā)揮單加氧酶活性、氧化還原酶活性等多種生物學(xué)功能，并參與脂肪酸ω-羥化酶活性、脂肪酸和花生四烯酸代謝等代謝途徑，從而使得該物種在極端干旱環(huán)境適應(yīng)性中發(fā)揮潛在的作用。

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收稿日期：2024-07-15

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校校級(jí)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2020XK01）。

作者簡介：布威海麗且姆·阿巴拜科日（1988—），女，新疆和田人，副教授，研究方向?yàn)橐吧溉閯?dòng)物保護(hù)遺傳學(xué)與利用和適應(yīng)性進(jìn)化。#通信作者：克熱木江·阿布都熱合曼，E-mail：431772718@qq.com。