紅花龍膽的組織培養(yǎng)研究

摘 要：為建立紅花龍膽的組培快繁體系，對外植體的選擇、消毒方法、無菌系的建立、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、組培苗的壯苗及移栽等進行研究。結(jié)果顯示：紅花龍膽的組織培養(yǎng)最合適的外植體是莖尖，初代培養(yǎng)選擇75%的酒精和0.1% HgCl2消毒，污染率最低，效果最佳；誘導培養(yǎng)基選擇MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂0.5%；繼代培養(yǎng)基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂0.5%+活性炭0.2%～0.3%；生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L

+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂0.5%+活性炭0.2%～0.3%；珍珠巖∶蛭石∶腐殖土為1∶1∶1作為移栽基質(zhì)，其移栽成活率達90%以上。

關鍵詞：紅花龍膽；組織培養(yǎng)；外植體

中圖分類號：S435.672 文獻標志碼：B 文章編號：2095–3305（2024）10–00-03

紅花龍膽又叫龍膽草、土白蓮、九月花、星秀花、冷風吹和雪里梅，屬于龍膽科[1]。紅花龍膽味苦、性寒，屬于寒性中藥。全草入藥，具有清熱除濕、解毒、止咳的功效，能治濕熱黃疸、肺熱咳嗽、小便不利等癥。

當前關于紅花龍膽的研究很多，在紅花龍膽血清藥物化學、紅花龍膽的栽培、化學成分、資源調(diào)查、顯微鑒別、生藥學鑒定等方面均有研究，在組織培養(yǎng)方面有紅花龍膽愈傷組織誘導研究、紅花龍膽組培快繁體系研究[2-10]。野生紅花龍膽由于受自然環(huán)境和生長條件的限制，產(chǎn)量較低，加之民間人為采挖比較嚴重，導致資源不斷減少[11-16]。對此，為進行種源保護，對紅花龍膽的組織培養(yǎng)進行研究具有重要意義。

1 材料來源

紅花龍膽外植體是從貴州省興義豐都和白碗窯、興仁大山、安龍篤山等地采集。采集點遠離公路和村寨，采集到的外植體受污染程度較小。

2 外植體的采集

2.1 外植體的采集時間

紅花龍膽的外植體在3—8月均可進行采集，最佳采集時間為4—5月。這期間采集的紅花龍膽幼嫩，生理機能旺盛，容易消毒滅菌和培養(yǎng)，分化率高。8月后采集的紅花龍膽，已進入生長末期，對誘導培養(yǎng)的反應遲鈍，誘導時間過長，或者不分化。值得注意的是，采集紅花龍膽的外植體盡量不要在雨天取材，這樣滅菌比較困難，污染率高，采集應在雨后晴天的早晨進行。

2.2 外植體的采集部位

取紅花龍膽帶側(cè)芽的幼嫩莖段、莖尖作外植體，莖尖的生長速度快，培養(yǎng)5～10 d后開始生長，幼嫩莖段的側(cè)芽容易萌發(fā)，且有穩(wěn)定的遺傳性狀。

3 培養(yǎng)基的選擇和培養(yǎng)條件

誘導培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+

30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂；MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂。

繼代培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+

IBA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂+0.2%～0.3%活性炭；

生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L

+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂+0.2%～0.3%活性炭。

誘導、繼代、生根培養(yǎng)都選擇MS培養(yǎng)基，細胞分裂素用6-BA，濃度為1.5 mg/Ｌ，生長素選擇NAA和IBA，蔗糖提供碳源和調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，瓊脂作為支持物，活性炭吸附有毒副作用的物質(zhì)。

配制好的培養(yǎng)基在121 ℃條件下滅菌20～30 min，

接種后置于培養(yǎng)室中，光照強度為1 000～2 000 Ix，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，空氣濕度保持在80%以上進行培養(yǎng)。

4 培養(yǎng)方法

4.1 外植體的消毒滅菌及無菌系的建立

外植體的消毒滅菌主要采用以下兩種方法：一種是將受污染程度較小的紅花龍膽幼嫩莖段、莖尖用礦泉水浸泡30 min～2 h，用70%～75%的酒精消毒15～18 s，

再用無菌水洗滌3～4次，0.1%的氯化汞（HgCl2）消毒15～18 min，繼續(xù)用無菌水洗滌3～5次；另一種是用5%的次氯酸鈉取代0.1% HgCl2消毒滅菌15～20 min，無菌水洗滌3～4次。

將消毒滅菌后的莖切成0.5～1 cm的小段，每段至少有1個側(cè)芽，莖尖切成0.5 cm的小段接種到誘導培養(yǎng)基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂上進行培養(yǎng)，使用MS+6-BA 1.5 mg/L+

NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂作為誘導培養(yǎng)基，莖尖作為外植體，5～10 d后側(cè)芽和頂芽開始生長。待35 d后長出1～4個側(cè)芽，莖長為3～5 cm，2個月后轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)。使用MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂作為誘導培養(yǎng)基，莖尖作為外植體，15 d后側(cè)芽和頂芽開始生長。待45 d后長出1～2個側(cè)芽，莖長長至2～4 cm，2個半月后轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)。

4.1.1 初代培養(yǎng)的污染率

兩種方式處理不同外植體的污染率的具體情況見表1、表2。

初代培養(yǎng)的消毒滅菌處理分析：由表1和表2中的數(shù)據(jù)可以看出，采用0.1% HgCl2處理不同外植體接種的污染率明顯低于采用5% 次氯酸鈉處理不同外植體接種的污染率，因此采用0.1% HgCl2處理的效果較好。但其缺點是汞離子不易去除，必須多次用無菌水沖洗，并且劇毒的HgCl2在自然中和在人體內(nèi)都不會降解，使用時要小心謹慎，使用后的消毒劑廢液及洗滌外植體的廢水要做回收處理，避免對環(huán)境造成污染[17]。

表1" 采用0.1% HgCl2處理不同外植體接種的污染率

外植體 接種數(shù)/株 污染數(shù)/株 污染率/%

帶側(cè)芽莖段 40 18 45.00

莖尖 28 5 17.86

表2" 采用5% 次氯酸鈉處理不同外植體接種的污染率

外植體 接種數(shù)/株 污染數(shù)/株 污染率/%

帶側(cè)芽莖段 21 18 85.71

莖尖 10 3 30.00

4.1.2 初代培養(yǎng)的分化率

在采用0.1% HgCl2處理情況下，兩種培養(yǎng)基接種外植體分化率的具體情況見表3、4。

由表3和表4可以看出，采用莖尖作為外植體時，

在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+

0.5%瓊脂中的分化率為71.43%，在培養(yǎng)基MS+6-BA

2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂中的分化率為60.00%，使用MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+

30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂作為初代培養(yǎng)基效果較好。采用

帶側(cè)芽莖段作為外植體時，在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.5 mg/L+

NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂中的分化率為5.00%，

在培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+

0.5%瓊脂中的分化率為14.29%，使用MS+6-BA 2.0 mg/L+

NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂作為初代培養(yǎng)基效果較好。此外，無論是采用MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA

0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂培養(yǎng)基，還是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂培養(yǎng)基，莖尖的分化率都比帶側(cè)芽莖段的分化率高，因此在紅花龍膽的組織培養(yǎng)中，莖尖是最佳的外植體。

表3" 培養(yǎng)基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+

30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂的分化率

外植體 接種數(shù)/株 分化數(shù)/株 分化率/%

帶側(cè)芽莖段 40 2 5.00

莖尖 28 20 71.43

表4" 培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+

30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂的分化率

外植體 接種數(shù)/株 分化數(shù)/株 分化率/%

帶側(cè)芽莖段 21 3 14.29

莖尖 10 6 60.00

4.1.3 初代培養(yǎng)消毒滅菌處理時間的控制

根據(jù)表5和表6中的數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，應嚴格控制對紅花龍膽外植體的消毒滅菌時間。消毒時間過短，初代培養(yǎng)容易造成污染，污染率高；消毒時間過長，消毒劑容易使紅花龍膽的組織造成損傷，甚至死亡，死亡率高。從表5和表6中可知，75% 酒精對紅花龍膽消毒的最佳時間為15～18 s，0.1% HgCl2對紅花龍膽消毒的最佳時間為15～18 min。

表5" 采用75% 酒精和0.1% HgCl2處理莖尖，不同消毒滅菌時間的死亡率

75%酒精消毒時間/s 0.1% HgCl2消毒時/min 接種數(shù)/株 死亡數(shù)/株 死亡率/%

10～12 12 37 0 0.00

15～18 15 28 3 10.71

15～18 18 32 4 12.50

20 20 60 20 33.33

表6" 采用75% 酒精和0.1% HgCl2處理莖尖，不同消毒滅菌時間的污染率

75%酒精消毒時間/s 0.1% HgCl2消毒時間/min 接種數(shù)/株 污染數(shù)/株 污染率/%

10～12 12 37 23 63.16

15～18 15 28 5 17.86

15～18 18 32 3 9.38

20 20 60 2 3.33

4.2 繼代培養(yǎng)

待初代培養(yǎng)中側(cè)芽和頂芽長至3～5 cm時，轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂+0.2%～0.3%活性炭上，進行繼代培養(yǎng)，45 d為一個周期轉(zhuǎn)接一次。

在紅花龍膽的繼代培養(yǎng)過程中，會出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。而莖尖和幼嫩莖段褐變程度較低，因此在繼代培養(yǎng)中應選擇莖尖和幼嫩莖段繼續(xù)培養(yǎng)。此外，在培養(yǎng)基中添加0.2%～0.3%的活性炭可以有效避免酚類物質(zhì)被氧化產(chǎn)生醌類物質(zhì)的毒害作用，防止褐化。

在紅花龍膽的繼代培養(yǎng)中，仍然會出現(xiàn)乳白色的細菌污染，菌斑呈黏液狀，接種2～3 d開始出現(xiàn)，因此要進行防治。對培養(yǎng)基要進行徹底滅菌，先排凈高壓鍋里面的冷空氣，然后升溫至121 ℃，滅菌20～30 min；接種操作器械也要進行徹底滅菌，鑷子、接種環(huán)等接種工具每使用一次都要在酒精燈上進行灼燒滅菌；操作人員在接種過程中禁止講話、打噴嚏，要注意呼吸，操作要規(guī)范熟練；培養(yǎng)瓶和蓋要定期檢查，瓶和蓋有損壞要立即更換；被細菌污染的培養(yǎng)基，對培養(yǎng)基進行高壓滅菌后再進行清洗，防止交叉污染。

4.3 生根培養(yǎng)

待繼代培養(yǎng)中苗長到5～8 cm時，將生長健壯的苗從繼代培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂+0.2%～0.3%活性炭中進行生根，生長不健壯的苗繼續(xù)轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，生根培養(yǎng)的溫度為25～27 ℃，

光照強度為1 000 lx，光照時間8～10 h/d，培養(yǎng)15 d后，

待根長為1～2 cm時，取出莖苗，洗凈基部的培養(yǎng)基，進行移栽。

5 煉苗移栽和田間管理

生根培養(yǎng)15～30 d后，組培苗根長到1～2 cm時，打開瓶蓋，在培養(yǎng)基上加薄層水，移至大棚中培養(yǎng)5～7 d，取出組培苗移栽到珍珠巖∶蛭石∶腐殖土為1∶1∶1的基質(zhì)中，在基質(zhì)中可以適當加入一些農(nóng)家肥。取苗時要用鑷子小心操作，切勿將根系損壞，清洗黏附在根系上的瓊脂，動作要輕，減少或避免傷根傷苗。移栽時用小鏟或粗的竹簽在基質(zhì)中開穴，然后再種植紅花龍膽組培苗，使根舒展開。移栽后3～5 d澆1次水，移栽初期保持空氣濕度為90%以上，溫度保持20～25 ℃。移栽后要注意防治紅花龍膽的根腐病，在移栽前使用甲霜惡霉靈稀釋成1 500～2 000倍液浸泡或者移栽后使用甲霜惡霉靈稀釋成1 500～2 000倍液噴施葉面可以進行有效防治。

6 結(jié)論

在紅花龍膽的組織培養(yǎng)中，初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+

0.5%瓊脂效果較好，外植體采用莖尖，外植體的消毒滅菌采用的方法是用礦泉水浸泡30 min～2 h，70%～75%的酒

精消毒15～18 s，再用無菌水洗滌3～4次，0.1% HgCl2消毒15～18 min，繼續(xù)用無菌水洗滌3～5次，污染率最低。

繼代培養(yǎng)選擇培養(yǎng)基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%瓊脂+0.2%～

0.3%活性炭，繼代效果較好。

生根培養(yǎng)選擇培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5mg/L+

IBA 0.2 mg/L+30g/L蔗糖+0.5%瓊脂+0.2%～0.3%活性炭，生根效果較好。

移栽后的田間管理要防止紅花龍膽的根腐病，移栽前可使用甲霜惡霉靈稀釋成1 500～2 000倍液浸泡根部，以防治根腐病。

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收稿日期：2024-08-15

基金項目：黔西南州科技計劃項目“民族藥倒提壺總生物堿提取工藝優(yōu)化及安全性評價”（2023－1－18）。

作者簡介：曾鎮(zhèn)廣（1971—），男，貴州興義人，副教授，研究方向為分析化學、藥物分析、藥用植物組織培養(yǎng)。