酸堿滴定法優(yōu)化香蕉磷脂酶 A 活性測(cè)定及炭疽病脅迫下其 活性變化研究

摘""要：植物磷脂酶A（phospholipase"A，PLA）是細(xì)胞膜磷脂代謝中的關(guān)鍵酶，可以催化磷脂分子上多個(gè)功能基團(tuán)發(fā)生裂解生成信號(hào)分子，參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及環(huán)境和生物脅迫，具有重要研究?jī)r(jià)值。本研究主要考察底物濃度、反應(yīng)溫度、緩沖溶液pH、緩沖溶液體積、反應(yīng)時(shí)間等多種因素對(duì)香蕉PLA催化卵磷脂水解活性的影響，從而優(yōu)化磷脂酶A活性測(cè)定方法，進(jìn)一步根據(jù)最佳測(cè)定條件研究炭疽病脅迫下香蕉PLA活性的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明，酸堿滴定法測(cè)定香蕉PLA活性的優(yōu)化條件：反應(yīng)體系pH"9，底物濃度為4"g/L，反應(yīng)溫度為55"℃，底物為15"mL，酶粗提液為3"mL，提取緩沖液體積與果皮重量的比值（mL/g）為3，反應(yīng)時(shí)間為7"h。在最優(yōu)條件下對(duì)炭疽病脅迫下的香蕉果皮組織進(jìn)行PLA活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)果皮的病害程度與PLA活力呈正相關(guān)，即隨著病害程度加深，PLA活性增大，且遠(yuǎn)大于對(duì)照組。表明PLA活性大小可能與果實(shí)的抗性有關(guān)，隨著果實(shí)病害程度加深，PLA活性增大，膜磷脂降解，細(xì)胞膜的完整性被破壞，從而導(dǎo)致果實(shí)腐爛。本研究明確了一種方便可行的香蕉PLA活性測(cè)定方法，為深入研究香蕉PLA的催化作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：香蕉；磷脂酶A；酸堿滴定法；酶活性；炭疽病中圖分類號(hào)：S432.1；Q556""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Optimization"on"Activity"Assay"of"Banana"Phospholipase"A"by"Acid-base"Titration"and"Change"of"PLA"Activity"under"Anthracnose"Stress

CHEN"Yuxian1，"LI"Li2，3，"LI"Jing1，"SUN"Jian3，4*，"YI"Ping2*，"HUANG"Fang2，"HUANG"Min2，"GAN"Ting2

1."College"of"Chemistry"and"Bioengineering，"Guilin"University"of"Technology，"Guilin，"Guangxi"541006，"China;"2."Agro-Food"Science"and"Technology"Research"Institute，"Guangxi"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Nanning，nbsp;Guangxi"530007，"China;"3."Guangxi"Key"Laboratory"of"Fruits"and"Vegetables"Storage-Processing"Technology，"Nanning，"Guangxi"530007，"China;"4."Guangxi"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Nanning，"Guangxi"530007，"China

Abstract："Plant"phospholipase"A"（PLA）"is"a"key"enzyme"in"cell"membrane"phospholipid"metabolism."It"can"catalyze"the"cleavage"of"multiple"functional"groups"on"phospholipids"to"generate"signaling"molecules，"which"are"involved"in"regulating"plant"growth"and"development"as"well"as"environmental"and"biological"stresses."PLA"possesses"important"research"value."In"this"study，"the"effects"of"various"factors"such"as"substrate"concentration，"reaction"temperature，"pH"of"buffer"solution，"buffer"solution"volume，"and"reaction"time"on"catalytic"activities"of"banana"PLA"for"phospholipid"hydrolysis"were"investigated，"so"as"to"optimize"PLA"activity"assay"method."According"to"the"optimal"assay"conditions，"the"change"of"banana"PLA"activity"under"anthracnose"stress"was"further"studied."The"results"showed"that"the"optimal"conditions"for"the"determination"of"banana"PLA"activity"by"acid-base"titration"method"were"as"follows："pH"9，"reaction"temperature"55"℃，"substrate"concentration"4"g/L，"15"mL"substrate，"3"mL"crude"enzyme"extract，"the"ratio"of"extraction"buffer"volume"to"peel"weight"（mL/g）"3，"and"reaction"time"7"h."According"to"the"optimal"conditions，"the"PLA"activity"of"banana"peel"tissue"under"anthracnose"stress"was"determined."It"was"found"that"the"degree"of"disease"in"peel"tissue"was"positively"correlated"with"PLA"activity，"indicating"that"PLA"activity"increased"with"the"deepening"of"disease."This"suggested"that"the"level"of"PLA"activity"was"probably"related"to"fruit"resistance."As"disease"degree"deepened，"PLA"activity"increased，"membrane"phospholipids"degraded，"and"cell"membrane"integrity"disrupted，"leading"to"fruit"decay."In"this"article，"a"convenient"and"feasible"method"for"the"determination"of"banana"PLA"activity"was"established，"which"laid"a"foundation"for"further"study"of"the"catalytic"mechanism"of"banana"phospholipase"A.

Keywords："banana;"phospholipase"A;"acid-base"titration;"enzyme"activity;"anthracnose

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.014

香蕉為芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）單子葉植物，果實(shí)營養(yǎng)豐富，含有礦物質(zhì)元素、抗性淀粉、膳食纖維、酚類化合物、類胡蘿卜素、植物甾醇、胺類、抗氧化劑等營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分[1-2]，加工潛力巨大[3]。隨著香蕉需求的日益增長(zhǎng)，截至2019年，全球香蕉收獲面積達(dá)到515.86萬hm2，產(chǎn)量達(dá)到1.17億t，同時(shí)我國香蕉產(chǎn)量位居世界第2，凈進(jìn)口量位居世界第3[4-5]。

香蕉炭疽病作為香蕉果實(shí)貯藏和運(yùn)輸過程中的主要病害之一，發(fā)病時(shí)主要表現(xiàn)為果實(shí)表面出現(xiàn)黑褐色圓斑，隨著病斑擴(kuò)大，果實(shí)硬度下降，果皮細(xì)胞膜破損，膜透性增大[6-7]，膜脂過氧化加劇，營養(yǎng)成分流失，2～3"d內(nèi)果肉變黑腐爛[8-9]。目前，香蕉病害的主要防治方法仍為化學(xué)防治，但由于病菌抗性增強(qiáng)以及藥物殘留等問題，化學(xué)防治效果下降。因此，利用生物、化學(xué)等方式誘導(dǎo)香蕉的自身免疫系統(tǒng)獲得抗病性已成為研究熱點(diǎn)之一[10]。

磷脂是構(gòu)成細(xì)胞膜的基本分子，也是細(xì)胞與外界聯(lián)系和反應(yīng)的第一道屏障。細(xì)胞膜作為靈敏的環(huán)境感應(yīng)器官，當(dāng)發(fā)生生物脅迫或非生物脅迫時(shí)，細(xì)胞膜中的分子受體可通過磷脂酶（phospholipase，"PL）產(chǎn)生細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，從而使細(xì)胞對(duì)外界變化給予不同的反應(yīng)[11]。磷脂酶可將磷脂水解為脂肪酸、溶血卵磷脂、二酰甘油、磷酰膽堿等親脂性物質(zhì)。根據(jù)水解磷脂的部位不同又將其分為磷脂酶A（PLA）、磷脂酶C（PLC）和磷脂酶D（PLD）[12]，其中PLA是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，是一類能夠在磷脂甘油部分的Sn-2位點(diǎn)選擇性斷裂酯鍵的酶，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)磷脂類物質(zhì)平衡、促進(jìn)細(xì)胞分化及生長(zhǎng)等能力。研究表明，當(dāng)植物面對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)，PLA活性發(fā)生改變，通過水解細(xì)胞膜上的磷脂，使其產(chǎn)物作用于質(zhì)膜H+轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)改變細(xì)胞膜的離子通透性，使胞內(nèi)Ca2+濃度增加，從而適應(yīng)不斷變化的環(huán)境和發(fā)育條件[13]。在炭疽病脅迫下，PLA活性的改變能夠在一定程度上影響果實(shí)的后熟進(jìn)程。

酶活性測(cè)定是酶研究、應(yīng)用和生產(chǎn)的基礎(chǔ)，與動(dòng)物PLA的研究相比，雖然已有大量研究表明植物PLA參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答等相關(guān)過程，但是目前有關(guān)植物PLA的酶活測(cè)定、作用機(jī)制等方面的研究仍非常匱乏。前期文獻(xiàn)報(bào)道了PLA催化卵磷脂水解的幾種測(cè)定方法，其中酸堿滴定法是研究PLA活性的一種易于操作的方法，該方法原理：由于磷脂在磷脂酶的作用下水解產(chǎn)生大量的游離脂肪酸，使用NaOH進(jìn)行中和滴定，可通過所消耗的NaOH體積間接推算出即時(shí)反應(yīng)速率等參數(shù)[14]。在實(shí)際應(yīng)用酸堿滴定法對(duì)香蕉PLA活性進(jìn)行測(cè)定的過程中發(fā)現(xiàn)，溫度、pH、底物濃度等多種因素對(duì)不同的研究對(duì)象影響較大。香蕉PLA活性酸堿滴定測(cè)定方法還需進(jìn)一步優(yōu)化，明確該方法的具體條件，從而更加準(zhǔn)確地測(cè)定香蕉PLA的活性。因此，本研究通過探討影響酸堿滴定法測(cè)定香蕉PLA活性的因素，獲得香蕉PLA的最優(yōu)測(cè)定條件，并利用優(yōu)化的測(cè)定方法分析炭疽病脅迫下不同貯藏時(shí)間香蕉PLA活性變化與果實(shí)后熟及腐敗進(jìn)程的關(guān)系，這在科學(xué)研究和實(shí)際生產(chǎn)中具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1""材料與方法

1.1""材料

供試香蕉品種選用廣西主栽的桂蕉1號(hào)，于2022年10月18日摘自廣西美呈農(nóng)業(yè)科技有限公司，采收時(shí)果實(shí)成熟度為7～8成熟，當(dāng)天運(yùn)回廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，挑選成熟度一致、大小均一、無明顯機(jī)械傷、無病害的果實(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

主要試劑：大豆卵磷脂，上海麥克林生化科技有限公司，GR級(jí)；脫氧膽酸鈉、氯化鈣，上海源葉生物科技有限公司，分析純；氯化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；三羥甲基氨基甲烷，北京索萊寶科技有限公司，分析純；鹽酸，成都科隆化學(xué)試劑有限公司，分析純。

主要儀器：水浴恒溫鍋，HH-S4型，金壇市萬華實(shí)驗(yàn)儀器廠；酸度計(jì)，PHS-3C型，上海儀分科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，3-18KS型，Sigma公司。

1.2""方法

1.2.1""炭疽菌孢子懸浮液的制備""香蕉炭疽菌（Colletotrichum"musae）由廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供（菌株編號(hào)17B）[15]。將炭疽菌接種于PDA固體培養(yǎng)基28"℃培養(yǎng)7～14"d，用接種環(huán)輕輕摩擦培養(yǎng)基表面使得孢子更容易脫落，使用移液槍將制得的菌種懸浮液轉(zhuǎn)移至50"mL錐形瓶，用無菌去離子水稀釋并調(diào)節(jié)濃度至1×"104"CFU/mL，備用。

1.2.2""樣品處理""參考李春玲等[16]報(bào)道的處理方法對(duì)采后香蕉果實(shí)進(jìn)行模擬炭疽菌感染處理試驗(yàn)。選用2～20"μL的移液槍在香蕉果實(shí)的腰部均勻地扎3個(gè)直徑為4"mm、深度為2.5"mm的傷口，于香蕉果實(shí)的傷口處注入20"μL炭疽菌孢子懸浮液（1×104"CFU/mL）作為實(shí)驗(yàn)組，于香蕉果實(shí)的傷口處注入20"μL無菌水作為對(duì)照組。每個(gè)處理組50個(gè)果實(shí)，注射完畢后將所有供試香蕉置于開口托盤上貯藏15"d以上，貯藏溫度25"℃，相對(duì)濕度60%，根據(jù)香蕉貯藏時(shí)間間隔進(jìn)行取樣及液氮保存。

1.2.3""PLA活性測(cè)定""酶的粗提液制備：準(zhǔn)確稱取一定量的香蕉果皮組織于研缽中，加入與其體積相應(yīng)倍數(shù)的5"mmol/L、pH"7.6的Tris-HCL緩沖液，冰浴研磨5"min，使用三層尼龍紗布過濾，濾液于4"℃、4000"r/min條件下離心15"min，取其上清液備用。

反應(yīng)底物溶液制備方法：參考雷享亮、張晉陸等[14，"17]報(bào)道的處理方法并加以改進(jìn)。制備含有2～5"g/L卵磷脂、2"mmol/L脫氧膽酸鈉、5"mmol/L"Tris-HCl（pH"7.6）、0.2"mmol/L"CaCl2、0.2"mol/L"NaCl的底物緩沖液，使用0.4"mol/L"NaOH調(diào)節(jié)緩沖液至相應(yīng)的pH。

反應(yīng)體系：將酶的粗提液和反應(yīng)底物溶液置于相應(yīng)溫度下保溫5"min，取3"mL粗提液和15"mL底物溶液迅速混勻，將混合液置于相應(yīng)溫度下反應(yīng)4～10"h。

自由脂肪酸（FFA）生成量測(cè)定：取2"mL不同時(shí)間段的反應(yīng)體系中的待測(cè)液，用蒸餾水稀釋25倍，從稀釋液中量取5"mL于50"mL錐形瓶中，在冰浴中用2"mmol/L"NaOH滴定至初始pH，記錄所消耗的NaOH體積數(shù)V（mL），推算出每克香蕉PLA水解卵磷脂釋放出的FFA生成量（μmol/g）。以單位時(shí)間內(nèi)每克香蕉果皮中PLA水解磷脂產(chǎn)生的游離脂肪酸量，即μmol/（g·h）表示PLA活性。具體計(jì)算公式如下：

1.2.4""炭疽病脅迫對(duì)香蕉PLA水解卵磷脂活性的影響""稱取一定量的實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M香蕉果皮組織于研缽中，其中實(shí)驗(yàn)組為炭疽病脅迫下的香蕉果皮組織，對(duì)照組為無菌水處理下的香蕉果皮組織。根據(jù)果皮質(zhì)量加入3倍的5"mmol/L（pH"7.6）Tris-HCL緩沖液，冰浴上研磨5"min，使用三層尼龍紗布過濾，濾液于4"℃、4000"r/min條件下離心15"min，取其上清液備用。選用篩選出的最佳底物濃度、溫度、反應(yīng)體系pH以及反應(yīng)時(shí)間等反應(yīng)條件進(jìn)行后續(xù)香蕉PLA水解卵磷脂的活性測(cè)定試驗(yàn)。

1.3""數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，采用SPSS"22軟件（IBM，芝加哥，美國）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Duncan檢驗(yàn)分析法進(jìn)行因素水平間的顯著性方差分析（Plt;0.05），用Origin"2021軟件（OriginLab，北安普敦，馬薩諸塞州，美國）制圖。

2""結(jié)果與分析

2.1""影響PLA水解卵磷脂活性的因素分析

2.1.1""底物濃度對(duì)PLA水解卵磷脂活性的影響""參考雷享亮、張晉陸等[14，"17]的方法設(shè)定初始參數(shù)：反應(yīng)體系pH"7.6，溫度40"℃，緩沖液體積/樣品質(zhì)量（mL/g）為5。由于卵磷脂在水中的溶解度有限，因此測(cè)定卵磷脂濃度為2、3、4、5"g/L時(shí)的底物溶液濃度對(duì)香蕉PLA水解卵磷脂活性的影響，記錄FFA生成量隨著時(shí)間的變化動(dòng)態(tài)。由圖1可知，在其他條件恒定的條件下，底物濃度對(duì)于酶促反應(yīng)的速度有很大影響，隨著底物濃度增加，酶促反應(yīng)速度加快，到達(dá)一定程度后，反應(yīng)速度趨于穩(wěn)定。香蕉磷脂酶水解卵磷脂產(chǎn)生的FFA含量隨著反應(yīng)時(shí)間的增加逐漸增大，其中底物卵磷脂濃度為4"g/L及5"g/L時(shí)，F(xiàn)FA生成量顯著大于2"g/L和3"g/L（Plt;0.05），且4"g/L及5"g/L間FFA生成量相差不大，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇的最佳濃度為4"g/L。

2.1.2""溫度對(duì)PLA水解卵磷脂活性的影響""設(shè)定底物卵磷脂濃度為4"g/L，反應(yīng)體系pH"7.6，緩沖液體積/樣品質(zhì)量（mL/g）為5，測(cè)定反應(yīng)溫度為40、45、50、55、60"℃時(shí)對(duì)香蕉PLA水解卵磷脂活性的影響，記錄FFA生成量隨著時(shí)間的變化動(dòng)態(tài)。由圖2可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為60"℃時(shí)，F(xiàn)FA生成量明顯降低。在溫度低于60"℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的增高，F(xiàn)FA生成量增加，各溫度下FFA生成量差異顯著（Plt;0.05）。其中55"℃下FFA的生成量平穩(wěn)增長(zhǎng)，且最多。溫度對(duì)于酶促反應(yīng)的影響有雙重作用，一方面，在一定范圍內(nèi)隨著溫度升高，可以加快酶促反應(yīng)，磷脂酶A活性增大；另一方面，當(dāng)溫度過高時(shí)，導(dǎo)致酶變性，酶活性下降，因此香蕉PLA活力的適宜溫度為55"℃。

2.1.3""反應(yīng)體系pH對(duì)PLA水解卵磷脂活性的影響""設(shè)定底物卵磷脂濃度為4"g/L，溫度為55"℃，緩沖液體積/樣品質(zhì)量（mL/g）為5，測(cè)定反應(yīng)體系pH為6、7、8、9時(shí)對(duì)香蕉PLA水解卵磷脂活性的影響，記錄FFA生成量隨著時(shí)間的變化動(dòng)態(tài)。由圖3可知，反應(yīng)體系的pH對(duì)酶催化活力的影響極為顯著，這可能是因?yàn)閜H改變了酶活性部位有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)[18]，使其適于或不適于與底物結(jié)合，從而影響酶促反應(yīng)結(jié)果。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)體系pH增大，F(xiàn)FA生成量增多，不同pH條件下FFA的生成量差異顯著（Plt;"0.05）。反應(yīng)體系pH為6和7時(shí)，F(xiàn)FA生成量少，且隨著時(shí)間的變化不大。反應(yīng)體系pH為8時(shí)，F(xiàn)FA生成量較前二者多，且隨著時(shí)間的變化緩慢增加。反應(yīng)體系pH為9時(shí)，F(xiàn)FA生成量最大。

2.1.4""緩沖液體積對(duì)PLA水解卵磷脂活性的影響""設(shè)定底物卵磷脂濃度為4"g/L，溫度為55"℃，反應(yīng)體系pH"9，測(cè)定緩沖液體積/樣品質(zhì)量（mL/g）為2、3、4、5時(shí)對(duì)香蕉PLA水解卵磷脂活性的影響，記錄FFA生成量隨著時(shí)間的變化動(dòng)態(tài)（圖4）。研究表明，不同緩沖液體積下香蕉磷脂酶水解卵磷脂存在明顯差異。在反應(yīng)進(jìn)行初期，2倍的反應(yīng)體系中FFA的生成量較大，但隨著反應(yīng)進(jìn)行到3倍時(shí)，反應(yīng)體系中FFA的生成量逐漸增大。在反應(yīng)后期，緩沖液為3倍時(shí)反應(yīng)體系中FFA生成量最大，且與其他倍數(shù)相比差異顯著（Plt;0.05），因此在香蕉PLA水解卵磷脂活性測(cè)定試驗(yàn)中緩沖液體積（mL）與樣品質(zhì)量（g）的最佳比值為3。

Fig."4""Effect"of"extraction"buffer"volume"on"lecithin"hydrolysis"of"banana"phospholipase"A

2.1.5""反應(yīng)時(shí)間的確定""設(shè)定底物卵磷脂濃度為4"g/L，溫度為55"℃，反應(yīng)體系pH"9，測(cè)定緩沖液體積/樣品質(zhì)量（mL/g）為3時(shí)對(duì)香蕉PLA水解卵磷脂活性的影響，記錄FFA生成量隨著時(shí)間的變化動(dòng)態(tài)。由圖5可知，反應(yīng)前7"h，隨著反應(yīng)進(jìn)行，反應(yīng)體系中FFA的含量逐漸增大，8"h時(shí)反應(yīng)速率減緩，此時(shí)FFA含量為（155.667±0.167）μmol/g。與其他時(shí)間段對(duì)比可知，7"h時(shí)反應(yīng)速度最快，可見反應(yīng)時(shí)間以7"h為宜。

2.2""炭疽病脅迫對(duì)香蕉PLA活性的影響

由圖6可知，隨著貯藏時(shí)間增加，香蕉果實(shí)果皮褐變程度加深，果實(shí)逐漸腐敗。在炭疽病脅迫下，實(shí)驗(yàn)組的香蕉果實(shí)病斑直徑逐漸增大，果實(shí)腐敗速度加快，而對(duì)照組的果實(shí)病斑直徑變化不大，果實(shí)腐敗速率較緩。在香蕉PLA最適活性測(cè)定條件下，即底物卵磷脂濃度為4"g/L，溫度為55"℃，反應(yīng)體系pH"9，測(cè)定緩沖液體積/樣品質(zhì)量（mL/g）為3，反應(yīng)時(shí)間為7"h，測(cè)定炭疽病脅迫對(duì)香蕉PLA活性的影響。結(jié)果如圖7所示，隨著貯藏時(shí)間增加，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的PLA活性均明顯上升，且接種炭疽菌的香蕉果實(shí)PLA活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于未接種的PLA活性。由此可知，PLA活性變化與香蕉后熟過程有關(guān)，隨著貯藏時(shí)間增加，PLA活性增大。同時(shí)，炭疽病脅迫會(huì)對(duì)香蕉果實(shí)中PLA活性有所影響，PLA活性顯著增加。

3""討論

PLA是一類廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞中的重要的水解酶，能夠參與調(diào)控細(xì)胞膜代謝和信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過程。目前，已有一些研究通過不同方法測(cè)定生物中PLA活性。FENG等[19]發(fā)現(xiàn)熒光基團(tuán)標(biāo)記的磷脂酶類物質(zhì)可以被PLA2催化并產(chǎn)生熒光信號(hào)，因此利用實(shí)時(shí)熒光測(cè)定方法，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)PLA2的活性變化，并可以在細(xì)胞水平上測(cè)定其活性。李宏麗等[20]使用模型膽汁和合成的熒光標(biāo)記底物測(cè)定豬胰臟PLA2的活性，為臨床治療膽結(jié)石提供了重要信息。MIRSKY等[21]基于磷脂酰乙醇胺與磷脂酰膽堿之間的酯鍵水解反應(yīng)，通過測(cè)定膜邊界電勢(shì)的變化來間接測(cè)定PLA的活性。JIMENEZ等[22]通過直接監(jiān)測(cè)酶催化反應(yīng)中產(chǎn)生的吸收或發(fā)射光信號(hào)，采用連續(xù)分光光度法實(shí)現(xiàn)了對(duì)PLA2活性的實(shí)時(shí)監(jiān)控，能夠有效地研究PLA2在豬胰臟內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化及其與相關(guān)生理過程之間的聯(lián)系。樂貞等[23]選用瓊脂糖平板法研究PLA活性大小，根據(jù)透明圈和孔的直徑測(cè)出蛇毒sPLA2的酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線。綜上可知，目前關(guān)于測(cè)定PLA活性的方法仍然存在一些限制，并且大部分研究都集中在動(dòng)物領(lǐng)域，對(duì)于植物領(lǐng)域中的PLA活性測(cè)定方法尚顯不足。由于植物和動(dòng)物細(xì)胞之間存在一些差異，首先，植物體內(nèi)PLA活性水平相對(duì)較低，需要更加敏感和準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)來進(jìn)行測(cè)定。其次，由于植物組織復(fù)雜多樣，存在著許多干擾因素，如其他酶的存在和反應(yīng)條件的調(diào)控等，使得PLA活性的準(zhǔn)確測(cè)定變得更加復(fù)雜，因此不能將動(dòng)物領(lǐng)域中的測(cè)定方法直接用于植物。然而，在植物細(xì)胞中，PLA活性與其生物學(xué)功能和代謝過程密切相關(guān)。因此，準(zhǔn)確測(cè)定植物中PLA活性并了解植物中PLA活性的變化原因，揭示其在信號(hào)傳導(dǎo)、逆境應(yīng)答、生長(zhǎng)發(fā)育等方面的作用機(jī)制，對(duì)深入研究植物生物學(xué)過程具有重要意義。

盡管PLA活性測(cè)定方法有多種選擇，但目前大多數(shù)研究仍然采用傳統(tǒng)的酸堿滴定法[14，"18，"24-26]。酸堿滴定法作為一種經(jīng)典的測(cè)定方法，相對(duì)于其他復(fù)雜的技術(shù)方法而言，具有適用范圍廣，可靠性強(qiáng)以及相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。然而，傳統(tǒng)的酸堿滴定法也存在一些不足之處，例如存在樣品處理過程中可能會(huì)受到其他物質(zhì)的干擾以及準(zhǔn)確度低等特點(diǎn)。因此，對(duì)現(xiàn)有的酸堿滴定法的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化仍然非常重要，這將有助于提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)效率，并推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用發(fā)展。為了更好地優(yōu)化酸堿滴定法的反應(yīng)條件，并使其在檢測(cè)植物PLA活性方面更具有適用性，本研究旨在通過優(yōu)化香蕉PLA活性酸堿滴定法的測(cè)定條件，從以下5個(gè)方面探討香蕉PLA活性測(cè)定的最佳條件：反應(yīng)體系的酸堿平衡（pH）、反應(yīng)溫度、反應(yīng)濃度、提取緩沖液體積與果皮質(zhì)量的比值以及反應(yīng)時(shí)間。這些優(yōu)化結(jié)果在一定條件上能為進(jìn)一步研究植物PLA活性以及相關(guān)生物過程提供重要的參考和基礎(chǔ)。

本研究通過酸堿滴定法試驗(yàn)測(cè)得桂蕉1號(hào)香蕉PLA活性測(cè)定的最佳條件為反應(yīng)體系pH"9，反應(yīng)溫度55"℃，底物濃度4"g/L，底物溶液15"mL，酶的粗提液3"mL，提取緩沖液體積與果皮重量的比值（mL/g）為3，反應(yīng)時(shí)間7"h。在此條件下，F(xiàn)FA生成量最高可達(dá)（154.78±0.111）μmol/g，磷脂酶活性大小為（22.111±0.016）μmol/（g·h）。同樣反應(yīng)時(shí)間下，雷享亮等[14]選用酸堿滴定法測(cè)得水稻中PLA活性大小為11.428～14.286"μmol/（g·h）。鄧治等[27]選用分光光度法測(cè)得巴西橡膠樹膠乳中PLA活性大小為39.857～43.000"μmol/（mL·h）。經(jīng)過優(yōu)化的酸堿滴定測(cè)定條件能夠更加精確、便捷地測(cè)定香蕉中PLA的活性，具有良好的可重復(fù)性和可操作性，為進(jìn)一步研究植物PLA活性以及相關(guān)生物過程提供重要的參考和基礎(chǔ)。

取試驗(yàn)所得最優(yōu)條件對(duì)炭疽病脅迫下的香蕉果實(shí)PLA活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在炭疽菌侵染香蕉果實(shí)后，與對(duì)照組相比，其PLA活性明顯增加。此外，隨著病害程度加深，果實(shí)的PLA活性也不斷增大。這可能是由于在病害侵襲下，果實(shí)細(xì)胞膜會(huì)受到損傷或改變。為了修復(fù)細(xì)胞膜損傷，并釋放有益于抵御病原體侵入的信號(hào)分子和代謝產(chǎn)物，香蕉果實(shí)通過增加PLA酶的活性，使磷脂酰膽堿等磷脂類物質(zhì)發(fā)生水解并釋放出游離脂肪酸、溶解產(chǎn)物和次級(jí)信號(hào)分子來參與植物的防御反應(yīng)。此外，PLA活性增大還可能是由于香蕉果實(shí)對(duì)病原微生物或逆境脅迫產(chǎn)生的信號(hào)分子的感知和響應(yīng)。這些信號(hào)分子可能通過調(diào)節(jié)PLA酶的表達(dá)和活性來調(diào)控植物的防御反應(yīng)。因此，我們認(rèn)為果實(shí)的PLA活性變化與其受到的病害程度密切相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)將為進(jìn)一步研究PLA活性與病害脅迫之間的關(guān)系提供重要的理論依據(jù)。

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