氮素形態(tài)對(duì)穿心蓮氮吸收、分配和內(nèi)酯成分積累的影響

摘 要： "為了明確藥用植物穿心蓮（Andrographis paniculata）對(duì)不同氮素形態(tài)的利用特征及其與穿心蓮內(nèi)酯成分積累的關(guān)系，以硝態(tài)氮（NN）、銨態(tài)氮（AN）、酰胺態(tài)氮（UN）和氨基酸態(tài)氮（GN）為單一氮源，采用15N同位素示蹤和生理生化分析，研究了氮素形態(tài)對(duì)穿心蓮不同生長(zhǎng)時(shí)期（快速生長(zhǎng)期、拔節(jié)期、現(xiàn)蕾期、開花期）氮素吸收、分配和穿心蓮內(nèi)酯成分含量的影響。結(jié)果表明：（1）葉片和根中氮含量隨生長(zhǎng)時(shí)期逐漸下降，NN處理氮含量較低。（2）穿心蓮氮吸收速率在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期較高，生殖生長(zhǎng)期急速下降，穿心蓮對(duì)AN、UN和GN的吸收速率較高。（3）現(xiàn)蕾期葉片氮分配比例減少，莖氮分配比例增加，與NN處理相比，該時(shí)期AN、UN和GN處理降低了葉片氮分配比例，而提高了莖和根氮分配比例。（4）快速生長(zhǎng)期NN處理的光合作用最大羧化速率和最大電子傳遞速率較低，葉片氮在羧化系統(tǒng)和生物能學(xué)組分中的分配比例也較低；UN和AN處理分別在現(xiàn)蕾期和開花期降低了葉片氮在羧化系統(tǒng)中的分配。（5）AN、UN和GN提高了穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量，降低了現(xiàn)蕾期和開花期14-去氧穿心蓮內(nèi)酯含量，不同氮素形態(tài)對(duì)新穿心蓮內(nèi)酯的影響較小。（6）穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯含量與葉、莖、根氮含量，氮吸收速率及葉和根中氮分配比例顯著負(fù)相關(guān)，而與莖中氮分配比例顯著正相關(guān)，14-去氧穿心蓮內(nèi)酯則相反。綜上認(rèn)為，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期是穿心蓮氮吸收的主要時(shí)期，穿心蓮能更好地利用銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮，并通過優(yōu)化氮分配促進(jìn)穿心蓮內(nèi)酯成分積累。

關(guān)鍵詞： 氮素形態(tài)， 氮吸收， 氮分配， 穿心蓮內(nèi)酯， 穿心蓮

中圖分類號(hào)： "Q945.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： "A

文章編號(hào)： "1000-3142（2024）11-2076-13

Effects of nitrogen forms on nitrogen uptake and

allocation and andrographolide components

accumulation in Andrographis paniculata

Abstract： "Nitrogen （N） is a mineral nutrient with the highest demand for plants， and it is also a vital abiotic factor that limits plant yield and quality.

In order to clarify the utilization characteristics of different N forms of Andrograhis paniculata and its relationship with the accumulation of andrographolide content， with nitrate nitrogen （NN）， ammonium nitrogen （AN）， amide nitrogen （urea， UN） and amino acid nitrogen （glycine， GN） as sole nitrogen source and combining 15N isotope tracing and physiological and biochemical analysis， the effects of nitrogen form on N uptake and distribution and andrographolide content at different growth stages （rapid growth stage， jointing stage， budding stage， flowering stage） of A. paniculata were studied.

The results were as follows： （1） N contents in leaf and root decreased gradually with the growth stage， and it was lower in the NN treatment. （2） The uptake rate of N was higher in the vegetative growth stage， and rapidly decreased in the reproductive growth stage. The uptake rates of AN， UN and GN were higher than that of NN in A. paniculata. （3） The allocation ratio of N in leaf was decreased， while the allocation ratio of N in stem was increased at budding stage. In comparison to the NN treatment， AN， UN， and GN treatments reduced N allocation ratio in leaf， but increased the ratios in stem and root at this growth stage. （4） At rapid growth stage， the maximum carboxylation rate and maximum electron transport rate of photosynthesis were lower in the NN treatment， as well as the proportion of leaf N allocation in the carboxylation system and bioenergetics components. The allocation of leaf N in the carboxylation system in UN and AN treatments were reduced at budding and flowering stages， respectively. （5） AN， UN and GN increased andrographolide and dehydroandrographolide contents， and decreased 14-deoxyandrographolide content at budding and flowering stages， while neoandrographolide was slightly affected by N forms. （6） The contents of andrographolide and neoandrographolide were significantly negatively correlated with N contents in leaf， stem and root， N uptake rate， and N allocation ratios in leaf and root， while they were significantly positively correlated with N allocation ratio in stem. The opposite was true for 14-deoxyandrographolide. Taken together， the results indicate that the vegetative growth stage is the main stage for N uptake in "A. paniculata， and that "A. paniculata can better utilize AN， UN， and GN， and promote the accumulation of andrographolide components by optimizing N allocation. The results provide a theoretical reference for N management of A. paniculata.

Key words： nitrogen form， nitrogen uptake， nitrogen allocation， andrographolide， Andrographis paniculata

氮是植物需求量最大的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，也是限制植物產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵非生物因子。植物所需的氮主要來源于土壤，以無機(jī)態(tài)的硝酸根（NO3-）和銨根（NH4+）離子為主，也包括一些小分子的氨基酸和多肽等有機(jī)態(tài)氮（曹小闖等，2015）。不同的氮素形態(tài)不僅對(duì)植物生長(zhǎng)和生理特征有較大影響（Guo et al.， 2007），也是影響藥用植物次生代謝物積累的關(guān)鍵因子。不同氮素形態(tài)對(duì)植物次生代謝物積累的影響有很大差別，與次生代謝物種類、植物對(duì)氮素形態(tài)的偏好性及氮形態(tài)的組成有關(guān)。如蕁麻多酚物質(zhì)（Biesiada et al.， 2009）、甜葉菊的甜菊苷（Sun et al.， 2021）、醫(yī)用大麻的大麻素和萜類物質(zhì)（Saloner amp; Bernstein， 2022）等在硝態(tài)氮條件下積累較銨態(tài)氮條件下高，而在茶樹（Camellia sinensis）（Yang et al.， 2018）、天門冬（梁娟等，2018）、菘藍(lán)（唐曉清等，2017）等植物中，較高比例的銨態(tài)氮更有利于次生代謝物質(zhì)的積累。不同氮素形態(tài)可能通過調(diào)控藥用植物初生代謝（如氨基酸合成、三羧酸循環(huán)和糖酵解）和次生代謝的關(guān)系以及次生代謝通路酶編碼基因的表達(dá)影響次生代謝物的積累（張強(qiáng)等，2018；羅佳琪和付立忠，2020；Chen et al.， 2023）。然而，其具體的影響機(jī)制還缺乏系統(tǒng)研究。不同氮形態(tài)對(duì)植物體內(nèi)活性成分影響的差異在一定程度上與植物對(duì)不同形態(tài)氮的吸收利用差異有關(guān)（晏楓霞等，2010）。但目前為止，關(guān)于藥用植物對(duì)不同氮素形態(tài)的吸收利用特征及其對(duì)次生代謝物積累的影響還鮮有報(bào)道。

穿心蓮（Andrographis paniculata）是我國(guó)重要的南藥大宗藥材之一，在全球草藥市場(chǎng)占有重要地位。它起源于南亞的印度和斯里蘭卡，廣泛應(yīng)用于南亞、東南亞和東亞傳統(tǒng)醫(yī)藥，具有祛熱解毒，消炎止痛等功效，是“天然抗生素藥物”。筆者前期研究表明，氮素形態(tài)影響穿心蓮主要活性成分穿心蓮內(nèi)酯的積累，銨態(tài)氮和有機(jī)態(tài)的酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮相對(duì)于硝態(tài)氮能提高穿心蓮內(nèi)酯含量（Zhong et al.， 2021）。鑒于植物對(duì)不同氮素形態(tài)的吸收利用普遍存在差異，因此推測(cè)不同氮素形態(tài)對(duì)穿心蓮內(nèi)酯成分積累的影響可能與穿心蓮對(duì)不同形態(tài)氮源的吸收、分配差異有關(guān)。本研究以4種氮素形態(tài)作為唯一氮源，采用無土基質(zhì)培育穿心蓮植株，通過生理生化研究方法和15N穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)，擬探討穿心蓮不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)各氮素形態(tài)的吸收利用特征及其與穿心蓮內(nèi)酯成分積累的關(guān)系，以期為穿心蓮氮素養(yǎng)分的科學(xué)管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理

以藥用植物穿心蓮為材料，原始種子由廣西藥用植物園種子庫(kù)提供，由鐘楚博士鑒定為爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮。經(jīng)本課題組篩選和純化后獲得性狀一致、穩(wěn)定的株系，用于后續(xù)研究。在培養(yǎng)室晝夜恒溫（約28 ℃）條件下，將穿心蓮種子放在裝有濕濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽，過程中保持濾紙完全濕潤(rùn)。光照周期為14 h光照/10 h黑暗，200 μmol·m-2·s-1的光合有效輻射（photosynthetically active radiation， PAR），相對(duì)濕度60%。大約10 d后，將發(fā)芽的幼苗移植到裝有蛭石、珍珠巖和品氏泥炭土（體積比約為4∶1∶1）混合基質(zhì)的育苗盤中繼續(xù)生長(zhǎng)，定期澆水防止幼苗干旱，直到5對(duì)葉齡。選取健康、長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移植到裝有蛭石和珍珠巖（4∶1）的花盆中進(jìn)行N形態(tài)處理。每盆1株，移栽前抖凈根上附著的基質(zhì)，每處理48盆（株）。將植物置于光溫培養(yǎng)室中進(jìn)行生長(zhǎng)，光、溫環(huán)境同上。

分別以2 mmol·L-1 KNO3和2 mmol·L-1 Ca（NO3）2、6 mmol·L-1 NH4Cl、3 mmol·L-1 尿素 ［CO（NH2）2］以及6 mmol·L-1甘氨酸提供氮源，分別作為硝態(tài)氮（nitrate nitrogen，NN）、銨態(tài)氮（ammonium nitrogen，AN）、酰胺態(tài)氮（urea nitrogen，UN）和氨基酸態(tài)氮（glycine nitrogen，GN）處理。營(yíng)養(yǎng)液中的其他礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素含有1 mmol·L-1 NaH2PO4、2 mmol·L-1 KCl、2 mmol·L-1 CaCl2、1 mmol·L-1 MgSO4、18 μmol·L-1 H3BO3、0.15 μmol·L-1 ZnSO4、0.15 μmol·L-1 CuSO4、0.52 μmol·L-1 （NH4）6Mo7O24、9.5 μmol·L-1 MnSO4和36 μmol·L-1 Fe-EDTA。為了維持各處理中K+和Ca2+濃度一致，NN處理不加KCl和CaCl2，K+和Ca2+由KNO3和Ca（NO3）2提供。將溶液的pH值調(diào)至5.8～6.0，并在營(yíng)養(yǎng)液中加入10 mg·L-1氨芐青霉素以抑制微生物繁殖。每周澆營(yíng)養(yǎng)液2次，每盆100 mL。每處理長(zhǎng)勢(shì)一致的植株有40株左右，可滿足取樣的需求。處理30、50、70、85 d后取樣分析。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 光合作用CO2響應(yīng)曲線 分別在移栽后30 d（快速生長(zhǎng)期）、50 d（拔節(jié)期）、70 d（現(xiàn)蕾期）和85 d（開花期）選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株3株，采用LI-6400XT便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)，測(cè)定主莖上第9至第12葉位（不同時(shí)期葉位不同，但同一時(shí)期各處理葉位相同）葉片光合作用CO2響應(yīng)特征。使用內(nèi)置LED光源，紅藍(lán)光比例為9∶1，光合有效輻射（PAR）為1 500 μmol·m-2·s-1，葉室溫度25 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，CO2濃度梯度為50、100、150、200、300、400、600、800、1 000、1 200、1 500 μmol·mol-1。

將葉片置于葉室中，在1 500 μmol·m-2·s-1 PAR、400 μmol·mol-1 CO2濃度下適應(yīng)至少20 min，待各參數(shù)穩(wěn)定后，開始測(cè)量各CO2濃度下的光合氣體交換參數(shù)。根據(jù)FvCB模型（Farquhar et al.， 1980）對(duì)CO2響應(yīng)曲線進(jìn)行擬合，計(jì)算最大羧化速率（Vcmax）和最大電子傳遞速率（Jmax）。

1.2.2 葉綠素含量、比葉重和比葉氮測(cè)定 測(cè)定完光合作用之后，用直徑6 mm的打孔器在葉片中部主脈兩側(cè)各取4片葉圓片置于10 mL離心管中，加入5 mL丙酮∶乙醇（1∶1，體積比）混合液，在室溫暗處浸提24 h，直至葉片完全變白。測(cè)定浸提溶液在663 nm和645 nm處的吸光值，計(jì)算葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量（張憲政，1986）。

另用打孔器在葉片兩側(cè)各取5片葉圓片，70 ℃烘干至恒重，稱重后，葉片用H2SO4-H2O2在260 ℃消煮，靛酚藍(lán)比色法測(cè)定總氮含量（呂偉仙等，2004）。比葉重（specific leaf weight，SLM）和比葉氮（specific leaf nitrogen，SLN）分別為單位葉片面積的重量和氮含量。

1.2.3 15N同位素標(biāo)記和測(cè)定 分別在快速生長(zhǎng)期、拔節(jié)期、現(xiàn)蕾期和開花期各處理選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株4株，取樣前6 d，將營(yíng)養(yǎng)液中的氮源分別換成15N標(biāo)記的相應(yīng)氮源，15N原子豐度均為10%。每3 d處理1次，處理結(jié)束后，將植株根系完整取出，先用自來水沖洗干凈附著的蛭石和珍珠巖，再用1 mmol·L-1 CaCl2沖洗1 min，最后用去離子水沖洗干凈。把植株根、莖、葉各部位分開，分別裝入牛皮紙袋后105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒重，稱重后將各部位研磨成細(xì)粉。采用連續(xù)流動(dòng)同位素比值質(zhì)譜儀偶聯(lián)碳氮元素分析儀（ANCA-MS，PDZ-Eropa）測(cè)定各部位15N原子豐度，并計(jì)算15N含量和吸收速率。

1.2.4 植株生物量和總氮含量測(cè)定 生物量和植株總氮含量采用1.2.3樣品進(jìn)行測(cè)定。總氮含量采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定（呂偉仙等，2004）。

1.2.5 穿心蓮內(nèi)酯成分含量 葉片干樣中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯含量的測(cè)定參考王雨霞等（2022）的方法，采用1.2.3樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

光合氮（photosynthetic nitrogen，PN）分配：將光合機(jī)構(gòu)分為羧化系統(tǒng)（PNC）、生物能學(xué)（PNB）和集光系統(tǒng)（PNL）3部分（史作民等，2015）。各部分氮的分配比例按下式計(jì)算：

式中：Vc max為最大羧化速率（μmol·m-2·s-1）；Jmax為最大電子傳遞速率（μmol·m-2·s-1），由CO2響應(yīng)曲線根據(jù)FvCB模型擬合得到；CC為葉綠素含量（mmol·m-2）；Narea為單位葉片面積氮含量（SLN，g·m-2）；Vcr為Rubisco比活，取值為20.78 μmol CO2·g-1 Rubisco·s-1；Jmc為單位Cyt f的最大電子傳遞速率，取值156 μmol e-·μmol-1 Cyt f·s-1；CB為捕光系統(tǒng)中葉綠素與氮的比值，取值2.15 mmol·g-1 N（史作民等，2015）。

采用單因素方差分析和LSD法多重比較處理間差異顯著性。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3或4）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中進(jìn)行，以Microsoft Excel 2023進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源對(duì)穿心蓮生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，用不同氮源處理5對(duì)葉齡穿心蓮植株30 d（圖1：A，S1）、50 d（圖1：B，S2）、70 d（圖1：C，S3）和85 d（圖1：D，S4）的表型沒有太大差別，硝態(tài)氮（NN）處理的植株進(jìn)入開花期稍晚。各處理前3個(gè)時(shí)期株高差異較小，而在開花期NN處理株高顯著高于其他3個(gè)處理（圖1：E）。各處理植株生物量在S1時(shí)期沒有顯著差異，而S2時(shí)期NN處理顯著高于其他3個(gè)處理，S3時(shí)期AN和UN的生物量較低，而S4時(shí)期以AN的生物量最低，顯著低于其他3個(gè)處理（圖1：F）。葉片生物量占地上部生物量的比例（葉重比）隨生長(zhǎng)時(shí)期變化而逐漸下降，S1時(shí)期以UN處理最低，而S2和S3時(shí)期以AN處理最低，S4時(shí)期各處理沒有顯著差異（圖1：G）。

2.2 氮源對(duì)穿心蓮氮吸收、積累和分配的影響

各處理植株葉片氮含量隨生長(zhǎng)時(shí)期呈逐漸下降的變化。NN處理各時(shí)期葉片氮含量相對(duì)較低，在S1和S3時(shí)期顯著低于其他3個(gè)處理（圖2：A）。莖中氮含量在整個(gè)生育期變化不大。S1時(shí)期NN和AN相對(duì)較低，與UN差異顯著；S2時(shí)期AN最低，與NN和GN差異顯著；S3時(shí)期AN最低，與UN差異顯著；S4時(shí)期各處理差異不顯著（圖2：B）。根中氮含量隨生長(zhǎng)時(shí)期呈逐漸下降的變化。UN處理在各時(shí)期均最高，除S2時(shí)期，NN處理在其他3個(gè)時(shí)期均最低；NN和AN處理在S1、S2和S4時(shí)期顯著低于UN和GN（S4時(shí)期AN除外），而在S3時(shí)期NN和GN顯著低于AN和UN（圖2：C）。植株總氮含量隨生長(zhǎng)時(shí)期呈逐漸下降變化，NN處理在各時(shí)期普遍較低（圖2：D）。

以15N穩(wěn)定同位素進(jìn)行示蹤，測(cè)定了不同氮源處理下穿心蓮的氮吸收速率。如圖3：A所示，在前2個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期穿心蓮對(duì)氮的吸收速率較高， 隨后急劇下降。各生長(zhǎng)時(shí)期穿心蓮對(duì)硝態(tài)氮的15N吸收速率始終最低，S1-S3時(shí)期顯著低于AN處理，而S3和S4時(shí)期顯著低于UN處理，S1和S4時(shí)期顯著低于GN處理。結(jié)果說明，穿心蓮可以更好地利用銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮。

通過計(jì)算15N在各器官中的分配比例，結(jié)果表明，S1和S2時(shí)期各氮源處理穿心蓮吸收的15N主要分布在葉片中，而S3和S4時(shí)期在莖中的分配比例大幅增加，甚至高于葉片中分配的比例（圖3：B）。S1時(shí)期AN處理與NN處理的15N分配較為相似，而UN與GN處理相似。NN和AN處理穿心蓮葉片中15N的分配比例明顯高于UN和GN處理，而根中15N的分配比例則明顯低于UN和GN處理。S2時(shí)期NN和AN各器官15N的分配比例沒有太大變化，而UN和GN處理根中15N的分配比例明顯下降，葉片和莖中15N的分配比例有所增加。S3時(shí)期AN、UN和GN處理葉片中15N的分配比例明顯較NN處理低，而根中分配比例則明顯較高。S4時(shí)期各處理各器官中15N的分配比例沒有明顯差異。

2.3 氮源對(duì)穿心蓮光合氮分配的影響

不同氮源處理對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期穿心蓮光合作用CO2響應(yīng)特征有明顯影響。由表1可知：AN、UN和GN處理在S1時(shí)期Vc max和Jmax均顯著高于NN處理，S2時(shí)期AN處理Vc max和Jmax最高，顯著高于UN和NN處理，S3時(shí)期AN處理的Vc max和Jmax仍顯著高于其他3個(gè)處理，而S4時(shí)期各處理之間沒有顯著差異；各處理葉綠素含量在生長(zhǎng)前期較低，后期較高， S1和S4時(shí)期處理間差異不顯著，S2時(shí)期GN處理葉綠素含量最高，顯著高于NN和UN處理，S3時(shí)期AN處理葉綠素含量顯著高于其他處理；各處理比葉氮（SLN）在S1和S2時(shí)期相對(duì)較低，而S3和S4時(shí)期相對(duì)較高，S1時(shí)期AN 和UN處理顯著高于GN處理，S3和S4時(shí)期AN處理最高。

由圖4的葉片氮在光合機(jī)構(gòu)中的分配情況可知，分配于光合機(jī)構(gòu)中的葉片氮比例為52.8%～88.7%，隨生長(zhǎng)時(shí)期呈先升高后降低的趨勢(shì)，S2時(shí)期比例最高，與該時(shí)期有較高的Vc max和Jmax結(jié)果一致。葉片氮在光合機(jī)構(gòu)3個(gè)組分中分配的比例以生物能學(xué)（PNB）最低，不到10%。S1和S2時(shí)期各處理葉片氮在集光系統(tǒng)（PNL）和羧化系統(tǒng)（PNC）中分配的比例相當(dāng)，但S1時(shí)期NN處理PNC中氮的分配比例較其他處理低。S3和S4時(shí)期各處理葉片氮主要分配于PNL中，處理間相差不大。S3時(shí)期UN處理和S4時(shí)期AN處理的PNC氮分配比例明顯低于同時(shí)期其他處理。

2.4 氮形態(tài)對(duì)穿心蓮內(nèi)酯成分積累的影響

如圖5：A所示，AN處理穿心蓮內(nèi)酯含量在各時(shí)期均較高，其中S1和S2時(shí)期顯著高于其他3個(gè)處理，而其他3個(gè)處理差異不顯著。尤其是S2時(shí)期，AN處理的穿心蓮內(nèi)酯含量超過其他處理的4倍。S3時(shí)期UN和GN處理的穿心蓮內(nèi)酯含量迅速上升，其中UN與AN差異不顯著，GN處理顯著低于AN和UN，但都顯著高于NN。該時(shí)期AN和UN處理的穿心蓮內(nèi)酯含量是NN處理的3倍左右。S4時(shí)期UN處理的穿心蓮內(nèi)酯含量仍維持較高水平，顯著高于其他處理，而GN處理的穿心蓮內(nèi)酯含量下降，與NN差異不顯著，二者顯著低于AN處理。

各處理新穿心蓮內(nèi)酯含量隨生長(zhǎng)時(shí)期逐漸升高。S1時(shí)期以GN最高，顯著高于其他處理；S2時(shí)期UN最低，顯著低于NN處理；S3時(shí)期各處理沒有顯著差異，而S4時(shí)期UN處理最高，顯著高于其他3個(gè)處理（圖5：B）。14-去氧穿心蓮內(nèi)酯含量隨生長(zhǎng)時(shí)期逐漸下降，NN處理各時(shí)期相對(duì)較高，尤其在S3和S4時(shí)期顯著高于其他3個(gè)處理（圖5：C）。各時(shí)期NN處理的脫水穿心蓮內(nèi)酯含量都較低，在S1和S3時(shí)期未檢出；AN處理各時(shí)期脫水穿心蓮內(nèi)酯含量都最高，顯著高于其他3個(gè)處理；UN和GN處理的脫水穿心蓮內(nèi)酯含量在前2個(gè)時(shí)期較低，而后2個(gè)時(shí)期相對(duì)較高（圖5：D）。AN處理總內(nèi)酯含量在S1和S2時(shí)期顯著高于其他3個(gè)處理，而其他3個(gè)處理之間沒有顯著差異；S3時(shí)期AN與UN和GN差異不顯著，三者顯著高于NN處理；S4時(shí)期以UN處理最高，其次為AN，NN和GN處理最低（圖5：E）。總體來看，銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮有利于提高穿心蓮內(nèi)酯及總內(nèi)酯含量。

2.5 穿心蓮內(nèi)酯成分含量與氮吸收和分配的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果（表2）表明，穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯含量與根、莖、葉氮含量以及葉片和根中氮分配比例、氮吸收速率負(fù)相關(guān)，而與莖中氮分配比例極顯著正相關(guān)。14-去氧穿心蓮內(nèi)酯含量與穿心蓮內(nèi)酯含量和新穿心蓮內(nèi)酯含量極顯著負(fù)相關(guān)，因此其與葉和根的氮含量、氮分配比例、氮吸收速率顯著或極顯著正相關(guān)，而與莖中氮分配比例極顯著負(fù)相關(guān)。總內(nèi)酯含量與穿心蓮內(nèi)酯含量相似，與莖和根中氮含量及葉中氮分配比例極顯著負(fù)相關(guān)，與莖中氮分配比例極顯著正相關(guān)。結(jié)果說明，降低植株氮含量，增加氮在莖中的分配比例可以有效提高穿心蓮內(nèi)酯及總內(nèi)酯含量。

各器官氮含量之間相互呈極顯著正相關(guān)，而莖中氮分配比例與葉和根中氮分配比例均呈極顯著負(fù)相關(guān)，尤其與葉中氮分配比例的相關(guān)性最強(qiáng)。葉和根中較高的氮含量也會(huì)提高氮在它們當(dāng)中的分配比例，而不利于莖中氮分配比例的增加。

3 討論與結(jié)論

3.1 穿心蓮對(duì)不同氮源的吸收和利用特征

植物可以直接利用無機(jī)態(tài)氮和有機(jī)態(tài)氮，但對(duì)不同氮素形態(tài)的吸收利用存在較大差異，大部分陸地植物以吸收硝態(tài)氮為主，只有少數(shù)植物如水稻、茶樹、馬鈴薯等以利用銨態(tài)氮為主（郝凱等，2020）。本研究中通過15N示蹤發(fā)現(xiàn)，穿心蓮對(duì)銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮的吸收速率要明顯高于對(duì)硝態(tài)氮的吸收速率，尤其對(duì)銨態(tài)氮的吸收速率最高，表現(xiàn)出對(duì)銨態(tài)氮有一定的偏好性。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)氮及酰胺態(tài)氮、氨基酸態(tài)氮處理穿心蓮葉片在現(xiàn)蕾期以前均有較高的氮含量。以上結(jié)果說明，穿心蓮能更好地利用這3種氮形態(tài)。值得注意的是，銨態(tài)氮處理植株雖然生物量相對(duì)較少，但并未出現(xiàn)如葉片黃化、植株生長(zhǎng)受抑制，甚至致死等典型的銨毒癥狀（Jian et al.， 2018; Hachiya et al.， 2021）。銨抑制穿心蓮生物量積累的原因仍有待進(jìn)一步研究。

利用15N同位素示蹤比較不同生長(zhǎng)時(shí)期氮素

吸收速率的變化可知，拔節(jié)期（S2）之前是穿心蓮氮素吸收的主要時(shí)期，進(jìn)入現(xiàn)蕾期（S3）之后氮素吸收速率開始大幅下降。結(jié)果表明，拔節(jié)期之前的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期是穿心蓮氮需求的關(guān)鍵時(shí)期，而進(jìn)入生殖生長(zhǎng)后對(duì)氮素的需求急劇減少。15N同位素示蹤結(jié)果還表明，現(xiàn)蕾期是植株水平上氮素重新分配的關(guān)鍵時(shí)期。因氮吸收減少，葉片中氮分配比例下降，植株將氮轉(zhuǎn)移至莖和根，尤以銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮處理的植株該時(shí)期葉片中的氮向根和莖中轉(zhuǎn)運(yùn)更加明顯。此外，這3種氮源處理的植株根中氮含量也普遍較硝態(tài)氮處理高，與15N測(cè)定結(jié)果一致。綜上認(rèn)為，穿心蓮生產(chǎn)上氮肥應(yīng)主要在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期施用，生殖生長(zhǎng)期因氮吸收速率下降，植株體內(nèi)氮以重新分配為主，應(yīng)避免在生殖生長(zhǎng)期施用氮肥。

3.2 氮源對(duì)穿心蓮內(nèi)酯成分的影響

本研究表明，不同氮素形態(tài)對(duì)穿心蓮內(nèi)酯成分有較大影響。氮素形態(tài)對(duì)藥用植物不同活性成分的影響差異已有廣泛報(bào)道，但關(guān)于其機(jī)理還缺乏深入研究。根據(jù)碳/養(yǎng)分平衡假說，較高的氮含量通常導(dǎo)致藥用植物富含碳的次生代謝物質(zhì)積累下降（羅佳琪和付立忠，2020）。本研究中穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯和總內(nèi)酯含量與葉、莖、根中的氮含量及氮吸收速率負(fù)相關(guān)。然而， 銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮處理下植株葉片氮含量和氮吸收速率較硝態(tài)氮處理植株高且穿心蓮內(nèi)酯含量也相對(duì)較高。相關(guān)性分析結(jié)果反映了各生長(zhǎng)時(shí)期氮含量變化與穿心蓮內(nèi)酯成分變化有關(guān)，而不同氮素形態(tài)處理之間葉片氮含量和氮吸收速率的差異不是造成內(nèi)酯含量差異的主要原因。

光合產(chǎn)物是植物次生代謝的最初物質(zhì)來源，維持較高的光合能力可以為次生代謝提供更多的同化物。銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮處理的植株具有較強(qiáng)的光合能力，可能是導(dǎo)致穿心蓮內(nèi)酯含量較高的原因之一。植物葉片中大部分的氮都存在于光合器官中參與光合作用（Makino et al.， 2003）。因此，葉片氮含量及其在光合機(jī)構(gòu)各組分中的分配對(duì)光合作用有重要影響（史作民等，2015）。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期是植物干物質(zhì)積累的重要時(shí)期。本研究中，銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮處理的穿心蓮葉片始終具有相對(duì)較高的氮含量，而且在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期（S1和S2）具有較高的光合能力以及較高的Vc max和Jmax，表明這3種氮源處理的植株將更多的氮投入到光合作用中，光合作用受到的化學(xué)限制也較小。從氮在光合機(jī)構(gòu)組分中的分配可以看出，S1時(shí)期硝態(tài)氮處理的植株光合氮在羧化系統(tǒng)和生物能學(xué)組分中分配的比例較其他處理低，可能是導(dǎo)致其光合能力較低的重要原因。

植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化期是氮素轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵時(shí)期，也是穿心蓮內(nèi)酯成分積累的重要時(shí)期（陳娟等，2014）。本研究中現(xiàn)蕾期（S3）穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯含量開始大量積累。該時(shí)期銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮處理葉片氮的分配比例較硝態(tài)氮處理明顯下降，而根和莖中的氮分配比例增加。相關(guān)性分析也表明，穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯含量與葉片氮分配比例顯著負(fù)相關(guān)而與莖中氮分配比例顯著正相關(guān)，說明該時(shí)期葉片氮向莖中轉(zhuǎn)移增加對(duì)穿心蓮內(nèi)酯積累有促進(jìn)作用。葉片是氮同化的主要器官，尤其生長(zhǎng)后期大量氮積累將增加碳水化合物消耗而不利于次生代謝物質(zhì)積累（Zhong et al.， 2021）。本研究結(jié)果在一定程度上符合碳/養(yǎng)分平衡假說的預(yù)測(cè)。氮在光合機(jī)構(gòu)各組分中的分配也影響植物對(duì)氮的再利用（劉濤，2018）。水溶性蛋白較其他類型蛋白更易被降解而再利用。羧化系統(tǒng)中的氮主要以羧化酶為主，占水溶性蛋白的一半以上（Carmo-Silva et al.， 2015）。羧化系統(tǒng)中維持較高的氮比例不僅降低植物光合效率（Mu et al.， 2016），也降低葉片中氮的轉(zhuǎn)移和再利用。生長(zhǎng)后期（S3和S4）銨態(tài)氮和酰胺態(tài)氮處理植株羧化系統(tǒng)氮的比例下降，可能有利于葉片中氮的轉(zhuǎn)移。

綜合以上分析，銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮影響穿心蓮植株和葉片氮分配，提高穿心蓮營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期光合能力，促進(jìn)生殖生長(zhǎng)期植株葉片氮素向莖中的轉(zhuǎn)移，為葉片中穿心蓮內(nèi)酯成分的合成與積累提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.3 本研究的潛在意義

氮素形態(tài)通過調(diào)控藥用植物次生代謝物合成通路中酶基因的表達(dá)而影響活性成分積累（張強(qiáng)等，2018）。穿心蓮內(nèi)酯屬于半日花烷型二萜內(nèi)酯，其合成通路還尚未被解析。本研究中發(fā)現(xiàn)，14-去氧穿心蓮內(nèi)酯含量與穿心蓮內(nèi)酯含量極顯著負(fù)相關(guān)，銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮不僅提高了穿心蓮內(nèi)酯含量，還特異性地提高了脫水穿心蓮內(nèi)酯含量，尤以銨態(tài)氮的效果更加明顯。結(jié)果說明，穿心蓮內(nèi)酯含量的提高與14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量的變化有密切聯(lián)系。本研究結(jié)果支持了任俊澤（2023）最近提出的穿心蓮內(nèi)酯合成的推測(cè)路徑，即由14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯通過單加氧反應(yīng)形成穿心蓮內(nèi)酯。細(xì)胞色素氧化酶P450（CYP450）家族蛋白酶催化單加氧反應(yīng)，在藥用植物化學(xué)成分的修飾方面起到重要作用（Xu et al.， 2015）?？梢酝茰y(cè)，銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮可能誘導(dǎo)了某個(gè)（或某幾個(gè)）CYP450基因的上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)了14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯向穿心蓮內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化。長(zhǎng)期以來，雖然有較多關(guān)于穿心蓮 CYP450基因的研究（Garg et al.， 2015；Liang et al.， 2020；孫銘陽(yáng)等，2022），但催化穿心蓮內(nèi)酯合成的關(guān)鍵CYP450基因還未見報(bào)道。本研究為穿心蓮內(nèi)酯合成通路中CYP450基因的挖掘奠定了基礎(chǔ)。

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