超低溫冷凍對(duì)龍眼種子生理生化特性的影響

摘""要：龍眼（Dimocarpus"longan"Lour.）原產(chǎn)于我國(guó)南方，在南部和東南部地區(qū)廣泛栽培，是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的果樹(shù)。龍眼種子作為典型的頑拗性種子，對(duì)低溫和干燥具有高度敏感性，因此在傳統(tǒng)的低溫種子庫(kù)中難以保存。本研究在排除冰晶對(duì)種子影響后，對(duì)新鮮和干燥種子進(jìn)行玻璃化冷凍和直接冷凍超低溫保存，并比較生理生化指標(biāo)、內(nèi)含物和淀粉的變化。結(jié)果表明：在經(jīng)過(guò)脫水和超低溫保存后，龍眼種子活力急劇下降；與新鮮種子相比，脫水導(dǎo)致丙二醛含量大幅度增加，細(xì)胞膜受損嚴(yán)重；過(guò)氧化氫含量呈下降趨勢(shì)；抗氧化酶系統(tǒng)表達(dá)增加，含水量16%的龍眼種子玻璃化冷凍處理后SOD活性最高，且玻璃化冷凍處理降低了POD和CAT活性。低溫和脫水導(dǎo)致種子內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量增加，脫水導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，含量降低。觀察龍眼種子淀粉發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)玻璃化冷凍處理后淀粉顆粒表面有空洞和凹陷生成，直接冷凍處理造成淀粉顆粒破裂。脫水和低溫對(duì)淀粉分子結(jié)構(gòu)未造成影響，但對(duì)內(nèi)部有序結(jié)構(gòu)造成了一定程度的破壞。

關(guān)鍵詞：超低溫冷凍；生理生化特性；頑拗性種子；龍眼中圖分類(lèi)號(hào)：S667.2""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Effect"of"Cryopreservation"on"the"Physiological"and"Biochemical"Characteristics"of"Longan"Seeds

LI"Shanshan，"SUN"Zheng*，"ZENG"Lin**

Chinese"Academy"of"Medical"Sciences"/"Peking"Union"Medical"College"/"Hainan"Branch，"Institute"of"Medicinal"Plant"Development"/"Hainan"Provincial"Key"Laboratory"of"Resources"Conservation"and"Development"of"Southern"Medicine，"Haikou，"Hainan"570311，"China

Abstract："Longan"（Dimocarpus"longan"Lour.）"is"native"to"southern"China"and"widely"cultivated"in"the"southern"and"southeastern"regions."It"is"a"fruit"tree"with"high"economic"value."Longan"seeds，"as"a"typical"recalcitrant"seed，"are"highly"sensitive"to"low"temperature"and"drying，"making"them"difficult"to"preserve"in"traditional"low-temperature"seed"banks.nbsp;After"excluding"the"influence"of"ice"crystals"on"seeds，"this"study"conducted"vitrification"freezing"and"direct"freezing"ultra-low"temperature"storage"on"fresh"and"dry"seeds，"and"compared"the"changes"in"physiological"and"biochemical"indicators，"contents，"and"starch."After"dehydration"and"ultra-low"temperature"storage，"longan"seeds"almost"lost"the"vitality."Compared"with"healthy"seeds，"dehydration"led"to"a"significant"increase"in"malondialdehyde"content"and"severe"damage"to"cell"membranes."The"hydrogen"peroxide"content"showed"a"decreasing"trend."The"expression"of"antioxidant"enzyme"system"increased，"and"the"highest"SOD"activity"was"observed"in"longan"seeds"with"a"water"content"of"16%"after"vitrification"and"freezing"treatment，"while"vitrification"and"freezing"treatment"reduced"the"activities"of"POD"and"CAT."Low"temperature"and"dehydration"led"to"an"increase"in"the"content"of"soluble"sugars"and"proteins"in"seeds，"while"dehydration"led"to"protein"denaturation"and"a"decrease"in"content."Observing"the"starch"of"longan"seeds，"it"was"found"that"after"vitrification"and"freezing"treatment，"there"were"voids"and"depressions"on"the"surface"of"starch"particles，"which"were"directly"frozen"and"caused"starch"particle"rupture."Dehydration"and"low"temperature"did"not"affect"the"molecular"structure"of"starch，"but"caused"some"degree"of"damage"to"the"internal"ordered"structure.

Keywords："cryopreservation;"physiological"and"biochemical"characteristics;"recalcitrant"seeds;"longan

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.12.012

龍眼（Dimocarpus"longan"Lour.）是無(wú)患子科龍眼屬植物，廣泛分布于中國(guó)、泰國(guó)、馬來(lái)西亞和越南等亞熱帶地區(qū)，是我國(guó)南部和東南部地區(qū)著名的果樹(shù)之一，主要有石硤、青山、儲(chǔ)良等品種?！侗静菥V目》中記載龍眼具有開(kāi)胃健脾，補(bǔ)虛益智的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)龍眼種子含有多種生物活性化合物，具有抗氧化、抗炎和抗癌等多種藥理作用[1-2]。龍眼種子在成熟脫落之后，種子含有大量水分，新陳代謝旺盛，在適宜條件下可以迅速萌發(fā)。但龍眼種子在儲(chǔ)存過(guò)程中，低溫和干燥均會(huì)導(dǎo)致種子活力降低甚至喪失，在貯藏和脅迫環(huán)境下難以存活，即為頑拗性種子[3]。由于頑拗性種子對(duì)低溫和干燥敏感，傳統(tǒng)的儲(chǔ)存方式無(wú)法維持種子活力，低溫保存是植物物種長(zhǎng)期保存的首選方法。已知的頑拗性種子，如橡膠樹(shù)、可可、荔枝、黃皮等[4]種胚的壽命很短，其種質(zhì)無(wú)法通過(guò)種子庫(kù)5"℃冷藏和–20"℃或–80"℃冷凍保存，通過(guò)超低溫保存整個(gè)種子或芽尖有助于種胚的活力保存。在超低溫條件下，長(zhǎng)期儲(chǔ)存的植物組織可以盡量減少細(xì)胞分裂和代謝活動(dòng)，從而達(dá)到保持植物遺傳完整性的目的[5]。玻璃化冷凍是目前植物冷凍應(yīng)用最廣泛的方法，并已經(jīng)成功地應(yīng)用于熱帶和亞熱帶地區(qū)的物種保存[6]。植物玻璃化保護(hù)液使細(xì)胞形成玻璃化狀態(tài)，避免冰晶產(chǎn)生，從而降低細(xì)胞器結(jié)構(gòu)受損的風(fēng)險(xiǎn)，有助于植物在超低溫條件下保存[7]。目前對(duì)一些作物如馬鈴薯和木薯的莖尖、植被繁殖的果樹(shù)和無(wú)性繁殖的草本植物和蔬菜的植物冷凍保存已經(jīng)取得了許多進(jìn)展。例如，PARASHER等[8]利用玻璃化冷凍技術(shù)凍存的瀕危物種菖蒲再生率可達(dá)到75%。然而，關(guān)于熱帶頑拗性種子物種的報(bào)道較少，為了實(shí)現(xiàn)頑拗性種子的超低溫保存，種子中與干燥和低溫脅迫相關(guān)的生理機(jī)制備受關(guān)注。干燥和低溫的惡劣環(huán)境會(huì)干擾頑拗性種子的代謝過(guò)程，導(dǎo)致潛在有害的活性氧增加，包括過(guò)氧化氫、超氧化物和羥自由基等，有毒的活性氧可能破壞細(xì)胞膜的完整性，或者通過(guò)氧化修飾改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性[9-10]。含水量低的細(xì)胞可以在超低溫環(huán)境下不受損害，但含水量高的細(xì)胞由于冰晶生長(zhǎng)具有細(xì)胞破裂的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)前頑拗性種子干燥、低溫不耐受的具體機(jī)制尚不清楚，本研究以龍眼種子為材料，對(duì)比研究高含水量和無(wú)冰晶產(chǎn)生含水量龍眼種子在直接和玻璃化超低溫保存方式下，其生理生化指標(biāo)、內(nèi)含物和淀粉的變化，為系統(tǒng)研究龍眼種子超低溫保存技術(shù)提供依據(jù)。

1""材料與方法

1.1""材料

龍眼種子由國(guó)家南藥基因資源庫(kù)提供，剝皮去果肉之后，選取外表、大小、色澤一致，無(wú)病蟲(chóng)害的種子備用。

1.2""方法

1.2.1""種子脫水和含水量測(cè)定""通過(guò)硅膠干燥法獲得不同梯度含水量的龍眼種子。將種子放在盛有硅膠的干燥器中，一定時(shí)間后取出，剪碎后稱(chēng)重，在130"℃條件下干燥至恒重后稱(chēng)重，干燥前后重量差值與干燥前重量比即為種子含水量，最后獲得含水量分別為36.78%（新鮮種子，CK）、21.17%、20.25%、19.14%、18.60%、17.20%和16.78%的龍眼種子。

1.2.2""基于DSC的熱力學(xué)分析""使用瑞士梅特勒公司的差示掃描量熱儀對(duì)龍眼種子的種胚進(jìn)行熱力學(xué)測(cè)定，解剖不同含水量龍眼種子的種胚稱(chēng)取10"mg，置于鋁盤(pán)內(nèi)密封。DSC分析條件為30"℃保持1"min，以10"℃/min降溫至–80"℃后保持2"min，再以10"℃/min升溫至30"℃；通過(guò)分析不同含水量下種子種胚熱焓值變化，記錄脫水臨界含水量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3""種子超低溫保存""根據(jù)熱力學(xué)分析結(jié)果，分別將含水量為36.78%和16.78%的種子采用直接冷凍法和玻璃化冷凍法進(jìn)行超低溫保存測(cè)定。

直接冷凍法：種子放入凍存管中，直接投入液氮中保存。玻璃化冷凍法：將種子置于裝載液LS（每升MS溶液中含2"mol甘油和0.4"mol蔗糖）中室溫處理25"min后，轉(zhuǎn)入玻璃化保護(hù)劑PVS2（每升MS溶液中含30%甘油、0.4"mol蔗糖、15%乙二醇和15%二甲亞砜）進(jìn)行30"min的冰水浴處理，再換上預(yù)冷新鮮的PVS2后迅速投入液氮中保存。解凍程序：取出液氮保存24"h后的龍眼種子，將凍存管置于40"℃溫水浴中解凍5"min，其中玻璃化冷凍法超低溫保存的龍眼種子用US洗滌溶液（每升MS溶液中含1.2"mol蔗糖）洗滌10"min，蒸餾水清洗浸泡3次，每次10"min，隨后進(jìn)行后續(xù)測(cè)試。

處理后的種子分別命名為：36.78%"CK（36-CK）、36.78%玻璃化冷凍（36-VF）、36.78%直接冷凍（36-DF）、16.78%"CK（16-CK）、16.78%玻璃化冷凍（16-VF）、16.78%直接冷凍（16-DF）。

1.2.4""種子活力和生理生化測(cè)定""龍眼種子植物脫氫酶（PDHA）活性、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、過(guò)氧化氫（H2O2）含量、超氧陰離子、羥自由基清除能力檢測(cè)均使用北京盒子生工科技有限公司試劑盒。

1.2.5""可溶性糖含量測(cè)定""可溶性糖含量通過(guò)硫酸-蒽酮法使用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。

1.2.6""可溶性蛋白質(zhì)測(cè)定""可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，稱(chēng)取胚軸0.5"g，加入5"mL蒸餾水機(jī)械勻漿，12"000"r/min離心20"min，取上清液1"mL，加入5"mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻，2"min"后在595"nm波長(zhǎng)下比色。

1.2.7""淀粉提取及結(jié)構(gòu)測(cè)定""（1）龍眼種子淀粉制備。將龍眼種子剪碎，與蒸餾水按料水比1∶4在打漿機(jī)中磨碎10"min，重復(fù)2次后，漿液用200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾。所得濾液在燒杯中靜置12"h，棄上清液收集白色沉淀，去除上方的黃色雜質(zhì)，用蒸餾水反復(fù)洗滌至上清液澄清。用NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，去除淀粉中的蛋白質(zhì)，正己烷攪拌浸泡24"h去除脂質(zhì)，抽濾所得淀粉并用蒸餾水反復(fù)洗滌4～5次，沉淀置于45"℃鼓風(fēng)干燥箱干燥至恒定重量，粉碎過(guò)160目篩即得淀粉。

（2）直鏈淀粉含量測(cè)定。直鏈淀粉使用南京建成生物工程研究所直鏈淀粉測(cè)試試劑盒測(cè)定。

（3）掃描電子顯微鏡SEM觀察。取少量淀粉，均勻涂抹在導(dǎo)電雙面膠上，經(jīng)過(guò)噴金處理后置于掃描電子顯微鏡下觀察，電壓5"kV，4000倍鏡下觀察淀粉顆粒形貌。

（4）X射線衍射XRD檢測(cè)。通過(guò)X射線衍射分析儀檢測(cè)淀粉的晶體結(jié)構(gòu)，在Cu-靶射線下，管壓40"kV，電流40"mA，2θ測(cè)定范圍為3°～60°。

（5）傅里葉變換紅外光譜FTIR測(cè)定。將淀粉和干燥KBr粉末混勻在瑪瑙研體內(nèi)研磨，將混合物壓片并在傅里葉變換光譜儀上進(jìn)行觀察，掃描波長(zhǎng)為400～4000"cm–1，分辨率4"cm–1，掃描速率為20"s/次，掃描64次。

1.3""數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均做3次重復(fù)，用origin"2021和IBM"SPSS"Statistics"25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2""結(jié)果與分析

2.1""熱力學(xué)特征分析

不同含水量龍眼種子的熱力學(xué)性質(zhì)參數(shù)差異明顯，由表1可知，隨著含水量降低，種胚的熱焓值呈下降趨勢(shì)，冷卻結(jié)晶階段起始溫度和峰值溫度代表種胚在降溫過(guò)程中形成冰晶的溫度，加熱熔融階段代表在升溫過(guò)程中冰晶融解的溫度[11]。36-CK龍眼種胚的冷卻結(jié)晶起始溫度是–20.94"℃，遠(yuǎn)低于冰晶融解起始溫度0.83"℃，熱焓值為120.35"J/g，表明在原始含水量種子中，可結(jié)晶水含量高，種胚內(nèi)部低溫時(shí)產(chǎn)生的結(jié)晶多。16-CK種胚中無(wú)結(jié)晶峰產(chǎn)生。隨著含水量的降低，冷卻結(jié)晶的溫度和熱焓值不斷降低，說(shuō)明種胚脫水后，可冰凍結(jié)晶的自由水含量下降，可以盡量降低冷凍冰晶對(duì)種胚產(chǎn)生的傷害。

2.2""不同處理龍眼種子活力變化

根據(jù)種胚中植物脫氫酶活性的高低可以判斷種子活力的大小，如表2所示，36-CK的種子植物脫氫酶活性最高，經(jīng)過(guò)低溫和干燥處理后，種子活力急劇下降。16-CK、16-VF和16-DF的種子活力急劇下降，但16-VF的種子活力高于16-CK。

2.3""不同處理龍眼種子生理生化指標(biāo)變化

2.3.1""不同處理龍眼種子MDA和H2O2含量變化""氧自由基主要攻擊或破壞生物膜系統(tǒng)，氧化分解生物膜中的不飽和脂肪酸，生成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物——MDA，最終造成生物膜的損傷、滲漏，甚至細(xì)胞的死亡[12]。種子MDA含量與種子干燥、冷凍損傷的關(guān)系如表2所示。與36-CK龍眼種子（99.25"nmol/g）相比，36-VF種子MDA含量為103.91"nmol/g，只有小幅度增加；經(jīng)過(guò)直接冷凍后，MDA含量明顯增加至156.75"nmol/g。16-CK種子MDA含量達(dá)到峰值178.91"nmol/g，經(jīng)冷凍處理后MDA含量下降，16-DF含量與36-CK含量相近。說(shuō)明玻璃化冷凍處理減少了氧自由基對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷，使機(jī)體MDA含量降低，而種子含水量較低時(shí)，機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度較高。

過(guò)氧化氫是一種活化氧，在細(xì)胞內(nèi)氧化生物大分子，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜受到損害。不同處理的龍眼種胚中過(guò)氧化氫含量呈波動(dòng)式下降。36-CK、36-VF、36-DF龍眼種子的H2O2含量總體高于16-CK、16-VF和16-DF龍眼種子，其中36-VF（13.35"μmol/g）最低；16-VF（13.21"μmol/g）過(guò)氧化氫含量高于16-CK和16-DF。表明龍眼種子脫水后進(jìn)行超低溫保存能有效減少因過(guò)氧化氫造成的細(xì)胞膜損害。

2.3.2""不同處理龍眼種子抗氧化酶系統(tǒng)的變化""36-CK龍眼種子SOD活性為1044.56"U/g，與16-CK種子（1227.14"U/g）相近，在經(jīng)過(guò)超低溫保存后，SOD活性有小幅度增加，其中36-VF種子活性較高。16-DF種子SOD活性與16-CK種子較接近，而16-VF種子SOD活性直線上升，與16-CK種子相比，活性增長(zhǎng)近4倍。說(shuō)明超低溫冷凍過(guò)程和種子脫水過(guò)程中膜脂過(guò)氧化反應(yīng)程度較大。

與未脫水的種子（386.67"U/g）相比，干燥對(duì)POD活性的影響較?。?6-DF龍眼種子的POD活性大幅度上升達(dá)到813.33"U/g；16-DF種子POD活性（453.33"U/g）與16-CK"（426.67"U/g）相似，但玻璃化冷凍會(huì)降低POD活性。說(shuō)明超低溫冷凍對(duì)POD活性影響較大，而直接冷凍能有效增加龍眼種子機(jī)體內(nèi)POD活性。

36-CK的種子在經(jīng)過(guò)超低溫保存后CAT活性明顯下降，而含水量降低后，超低溫儲(chǔ)存的種子CAT活性變化趨勢(shì)與POD相同，均是玻璃化冷凍后酶活性降低。說(shuō)明相比于脫水過(guò)程，超低溫冷凍過(guò)程更能影響種子氧化反應(yīng)。

2.4""不同處理龍眼種子內(nèi)含物含量變化

不同處理龍眼種子可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量的變化如表3所示，與新鮮種子（199.32"mg/g）相比，干燥后的種子可溶性糖含量顯著增加至286.64"mg/g。玻璃化冷凍和直接冷凍均會(huì)使種子中可溶性糖含量升高，相比之下，新鮮種子直接冷凍后可溶性糖含量高于玻璃化冷凍種子；16-VF與16-DF可溶性糖含量相近，在所有處理中，16-DF種子可溶性糖含量最高，達(dá)到320.18"mg/g。

龍眼種子干燥后，隨著含水量降低，種子中可溶性蛋白質(zhì)的含量從94.47"mg/g降至92.65"mg/g。36-CK龍眼種子在經(jīng)過(guò)直接冷凍（99.65"mg/g）和玻璃化冷凍（101.28"mg/g）處理后可溶性蛋白質(zhì)含量均有上升；而16-CK種子在玻璃化冷凍后可溶性蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著變化，直接冷凍處理后可溶性蛋白質(zhì)含量上升至95.92"mg/g。

2.5""不同處理龍眼種子淀粉比較

2.5.1""不同處理龍眼種子淀粉顆粒形貌""淀粉顆粒形態(tài)是淀粉粒分析對(duì)比的重要指標(biāo)[2]。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察到的龍眼種子干燥及冷凍前后淀粉的顆粒形態(tài)如圖1所示。新鮮的龍眼種子淀粉呈橢圓形和方形，表面光滑，無(wú)明顯裂隙；在經(jīng)過(guò)干燥后的16-CK淀粉形狀沒(méi)有明顯變化，但表面出現(xiàn)孔洞和凹陷。36-VF的龍眼淀粉形態(tài)無(wú)明顯變化；但36-DF淀粉顆粒出現(xiàn)凹陷和部分開(kāi)裂的不規(guī)則淀粉聚集體。16-VF的龍眼種子淀粉同樣與冷凍前淀粉形態(tài)相似，均有孔洞和凹陷，表面光滑，但16-DF的部分淀粉維持原形態(tài)，同時(shí)觀察到大量的淀粉碎片，表示在超低溫環(huán)境下直接冷凍嚴(yán)重破壞了淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)。這可能是在低溫環(huán)境的影響下，淀粉顆粒的膨脹力和壓力過(guò)高導(dǎo)致的淀粉顆粒發(fā)生破裂。

2.5.2""不同處理龍眼種子淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)和短程有序結(jié)構(gòu)""淀粉顆粒由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，直鏈淀粉是多數(shù)淀粉的次要組成成分。如表4所示，新鮮未經(jīng)過(guò)冷凍處理的龍眼種子淀粉直鏈淀粉含量為22.14%，直接冷凍后直鏈淀粉含量21.74%略有降低趨勢(shì)。干燥后的龍眼種子在冷凍前后直鏈淀粉含量均低于新鮮龍眼種子淀粉，其中玻璃化冷凍后的龍眼種子直鏈淀粉含量最低。

龍眼淀粉的XRD衍射圖譜如圖2所示，龍眼種子淀粉2θ在15°、23°處有強(qiáng)衍射峰，在17°、18°處有典型衍射雙峰，屬于A型晶體結(jié)構(gòu)。淀粉在經(jīng)過(guò)干燥和冷凍處理后仍然呈現(xiàn)出相似的XRD圖譜，說(shuō)明淀粉的晶體結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變。

通過(guò)FTIR光譜及其參數(shù)可觀察淀粉顆粒的短程有序結(jié)構(gòu)[13]。如圖2所示，在3300～4000"cm–1區(qū)域觀察到由O-H的拉伸引起的寬帶，在800～"1200"cm–1范圍因C-C、C-OH和C-H拉伸振動(dòng)引起了峰值變化。6種龍眼種子淀粉分別顯示出相似的FTIR光譜，峰的數(shù)量沒(méi)有明顯變化，僅觀察到峰值強(qiáng)度的差異，表明淀粉結(jié)構(gòu)相似。通過(guò)計(jì)算1047/1022"cm–1（R1047/1022）和995/1022"cm–1（R995/1022）處的吸光度比（表3），可揭示淀粉短程有序度和雙螺旋結(jié)構(gòu)的變化。R1047/1022代表了淀粉結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)的比值，通常用來(lái)評(píng)估淀粉分子短程有序程度。新鮮未經(jīng)冷凍處理的龍眼種子淀粉R1047/1022和R995/1022值最高，分別為1.06和1.15；干燥處理后吸光度比均低于新鮮種子，且玻璃化冷凍和直接冷凍處理后仍有下降趨勢(shì)。表示干燥和冷凍處理破壞了淀粉鏈之間的結(jié)合，淀粉分子有序程度降低。

3""討論

通過(guò)差示掃描量熱法排除冰晶傷害對(duì)種胚的影響，確定含水量為16.78%的種子進(jìn)行后續(xù)玻璃化冷凍和直接冷凍保存并進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。龍眼種子成熟脫落后含水量高，對(duì)低溫和脫水敏感，本研究通過(guò)測(cè)試種子植物脫氫酶活性判斷種子活力，發(fā)現(xiàn)新鮮種子在經(jīng)過(guò)超低溫保存后，活力大幅度下降，干燥后活力幾乎喪失。活性的強(qiáng)弱與種子自身貯藏物質(zhì)和細(xì)胞系統(tǒng)完整性有關(guān)。

新鮮種子的含水量和代謝活性相對(duì)較高，低溫和脫水可能會(huì)破壞細(xì)胞并誘導(dǎo)氧化和自由基生成[14-15]。MDA是由活性氧與組織的脂質(zhì)分子反應(yīng)形成的，MDA對(duì)生物大分子有毒性，降低抗氧化酶系統(tǒng)活性，通常被用作細(xì)胞損傷的參考[16]。種子的膜脂過(guò)氧化程度加深，活力降低。種子內(nèi)部的新陳代謝受溫度影響，低溫時(shí)種子生理機(jī)能被抑制，當(dāng)種子新陳代謝降低時(shí)，活性氧的產(chǎn)生也會(huì)隨之減少[17]。本研究中，龍眼種子干燥后，種子脫水劣變，丙二醛含量大幅度增加；但冷凍處理的龍眼種子丙二醛含量變化幅度相較之下更小，表明在超低溫條件下，種子內(nèi)部調(diào)節(jié)功能強(qiáng)。種子在受到低溫脅迫時(shí)，代謝停止，呼吸減少，導(dǎo)致過(guò)氧化氫含量波動(dòng)式下降。

種子在受到低溫和脫水脅迫過(guò)程中，組織內(nèi)的抗氧化酶等物質(zhì)相互作用，以維持活性氧的產(chǎn)生和清除達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。但過(guò)度的失水打破了頑拗性種子的穩(wěn)定代謝，低溫和干燥脅迫導(dǎo)致有害物質(zhì)累計(jì)，激活種子內(nèi)部抗氧化酶系統(tǒng)，植物細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性增加，保護(hù)細(xì)胞膜不受損害[18-19]。SOD活性在脫水種子玻璃化冷凍保存時(shí)突然增高可能與細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)啟動(dòng)有關(guān)，SOD主要分解有害物質(zhì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫和氧氣，這也解釋了過(guò)氧化氫含量比干燥種子冷凍前增加的原因。POD和CAT活性在玻璃化冷凍保存后降低可能是低溫脅迫刺激酶活性表達(dá)，防御系統(tǒng)紊亂。

在種子發(fā)育過(guò)程中，淀粉、可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)是重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在種子脫水過(guò)程中，可溶性糖代替水分子起到保護(hù)種子的作用，因此隨著種子含水量降低，可溶性糖含量增加[20-21]。在超低溫保存過(guò)程中，可溶性糖的生成可以提高組織的耐寒性。同時(shí)，低溫環(huán)境可能刺激了新的可溶性蛋白質(zhì)生成，導(dǎo)致冷凍保存和超低溫保存新鮮種子中可溶性蛋白質(zhì)含量增加。干燥后的龍眼種子過(guò)度失水，蛋白質(zhì)發(fā)生變性劣變，含量大幅度下降。

龍眼種子含有淀粉和其他天然成分，龍眼種子含有高達(dá)49.5%的淀粉，是種子主要的營(yíng)養(yǎng)成分之一。通過(guò)掃描電鏡觀察到脫水造成淀粉顆粒產(chǎn)生孔洞和凹陷，玻璃化冷凍較好地保存了淀粉顆粒，相反，直接冷凍導(dǎo)致種子內(nèi)淀粉顆粒破裂。脫水和超低溫保存并未對(duì)淀粉晶型和分子結(jié)構(gòu)造成改變，但低溫對(duì)淀粉的有序結(jié)構(gòu)造成了一定程度的破壞。

4""結(jié)論

本研究分析了含水量和超低溫冷凍對(duì)龍眼種子生理生化特性的影響?；诓钍緬呙枇繜峒夹g(shù)，確定龍眼種子超低溫冷凍安全（無(wú)冰晶形成）含水量為16.78%。龍眼種子在經(jīng)過(guò)脫水和超低溫冷凍處理后，其活力急劇下降，且脫水的影響大于低溫處理；種子低含水量時(shí)，玻璃化冷凍處理的種子其活力高于對(duì)照；脫水和低溫冷凍均對(duì)龍眼種子生理生化特性指標(biāo)產(chǎn)生了不同程度的影響；低溫和脫水導(dǎo)致種子內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量增加，但脫水導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、含量降低；直接冷凍對(duì)淀粉顆粒形貌造成的影響大于玻璃化冷凍。

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