生防鏈霉菌17-7菌株發(fā)酵配方優(yōu)化及發(fā)酵濾液穩(wěn)定性研究

摘""要：為了提升鏈霉菌17-7菌株的抑菌活性，合理利用菌株的代謝產(chǎn)物，本研究以橡膠樹褐根病菌為靶標(biāo)菌，采用正交試驗(yàn)和單因子試驗(yàn)相結(jié)合，在原培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對(duì)鏈霉菌17-7菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)一步優(yōu)化，獲得該菌株最適宜產(chǎn)活性物質(zhì)的配方為：大豆粉25"g/L、玉米粉10"g/L、葡萄糖10"g/L、酵母粉2"g/L、K2HPO4"1"g/L、NaCl"0.5"g/L、CaCO3"0.5"g/L。發(fā)酵濾液稀釋500倍后對(duì)橡膠樹褐根病菌的相對(duì)抑菌活性為51.37%，較優(yōu)化前提高了17.66%，并且具有廣譜的抑菌活性。在此基礎(chǔ)上測(cè)定了溫度、紫外線輻射、蛋白酶、酸堿度和貯存條件對(duì)17-7菌株發(fā)酵濾液抗真菌物質(zhì)穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：17-7菌株發(fā)酵濾液對(duì)高溫不敏感；紫外線照射1"h后發(fā)酵濾液的抑菌活性開(kāi)始顯著下降，長(zhǎng)時(shí)間紫外照射并不會(huì)喪失抑菌活性；17-7菌株發(fā)酵濾液還具有較好的酸堿耐受性，pH為3～10時(shí)其發(fā)酵濾液均能發(fā)揮較好的抑菌活性；并且對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感；菌株發(fā)酵濾液在低溫（4"℃）和室溫（25"℃）條件下貯存120"d仍能保持較強(qiáng)生物活性。對(duì)17-7菌株無(wú)菌發(fā)酵濾液穩(wěn)定性和貯存條件的研究可為后續(xù)該菌株的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：鏈霉菌17-7；發(fā)酵配方優(yōu)化；穩(wěn)定性；抑菌活性中圖分類號(hào)：S476""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Optimization"of"Fermentation"Formula"and"Stability"of"Cultural"Filtrate"Produced"by"Streptomyces"samsunensi"17-7

LIU"Yixian，"Shi"Yuping，"Li"Lanlan，"DAI"Liming，"CAI"Zhiying*

Yunnan"Key"Laboratory"of"Sustainable"Utilization"Research"on"Rubber"Tree"/"Yunnan"Institute"of"Tropical"Crops，"Jinghong，"Yunnan"666100，"China

Abstract："In"order"to"enhance"the"antifungal"activity"of"Streptomyces"samsunensis"17-7"strain"and"effectively"utilize"its"secondary"metabolites，"this"study"focused"on"optimizing"the"fermentation"medium"formula."Orthogonal"and"single"factor"experiments"were"conducted"based"on"the"original"medium，"with"Phellinus"noxious"as"the"indicator."The"optimal"formulation"for"producing"active"substances"from"the"strain"was"determined"to"include"25"g/L"soy"powder，"10"g/L"corn"meal，"10"g/L"glucose，"2"g/L"yeastnbsp;extract，"1"g/L"K2HPO4，"0.5"g/L"NaCl，"and"0.5"g/L"CaCO3."Following"a"500"times"dilution，"the"relative"antifungal"activity"of"the"fermentation"solution"increased"to"51.37%，"a"17.66%"improvement"compared"to"the"previous"optimization，"demonstrating"a"broad"spectrum"of"antifungal"activity."The"stability"of"the"antifungal"substance"was"evaluated"in"response"to"various"conditions"such"as"temperature，"pH，"protease，"UV-irradiation，"and"storage."Results"indicated"that"the"fermentation"broth"of"strain"17-7"exhibited"high"temperature"resistance，"a"significant"decrease"in"antifungal"activity"after"one"hour"of"UV"irradiation，"but"retained"its"activity"after"long-term"exposure"to"UV"light."Furthermore，"the"broth"demonstrated"good"acid-base"tolerance，"effective"antibacterial"activity"in"the"pH"range"of"3-10，"and"resistance"to"trypsin"and"pepsin."The"fermentation"broth"of"strain"17-7"maintained"its"antifungal"activity"for"120"days"at"both"4"℃"and"room"temperature"（25"℃）."This"study"on"the"stability"and"storage"conditions"of"strain"17-7’s"fermentation"broth"offers"valuable"data"for"potential"future"applications"of"the"strain"as"a"biocontrol"agent.

Keywords："Streptomyces"samsunensi"17-7;"fermentation"medium"optimization;"stability;"antifungal"activity

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.12.021

鏈霉菌（Streptomyces）是放線菌門中最為龐大且極具代表性的分支，具有強(qiáng)大的生態(tài)適應(yīng)能力，廣泛分布于各種環(huán)境中[1]。并且鏈霉菌也是目前最大的新型次生代謝產(chǎn)物資源菌，是天然產(chǎn)物的重要工業(yè)生產(chǎn)菌[2]。鏈霉菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)可用作農(nóng)用殺菌劑、殺蟲劑、除草劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，因其具有高效、低毒和環(huán)境友好等特點(diǎn)在農(nóng)作物病蟲草害綠色防控中占據(jù)重要地位[3]。

鏈霉菌具有大量編碼天然產(chǎn)物的生物合成基因簇，然而大部分基因簇在常規(guī)條件下處于沉默狀態(tài)[4]。為了增強(qiáng)菌株代謝產(chǎn)物活性，激活鏈霉菌沉默基因表達(dá)，以獲得更多的活性天然產(chǎn)物，非定向激活策略是普遍使用的一種方法，即通過(guò)改變培養(yǎng)基的組成（碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽）等方式，誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生更多的代謝產(chǎn)物[5-7]。

天然橡膠是我國(guó)熱區(qū)重要的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，也是國(guó)家重要的戰(zhàn)略物資。我國(guó)橡膠樹上已報(bào)道的病害有91種，局部或全面嚴(yán)重危害的有9種[8]，已成為制約橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。運(yùn)用微生物資源或其代謝產(chǎn)物進(jìn)行生物防治已成為綠色農(nóng)業(yè)潮流下的主要趨勢(shì)。Streptomyces"samsunensi"17-7菌株是由本實(shí)驗(yàn)室從橡膠樹根際土壤中分離到的一株具有巨大生防潛力的鏈霉菌，對(duì)橡膠樹褐根病菌具有較強(qiáng)抑制作用[9]。但近期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)17-7菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性有所下降，稀釋500倍后對(duì)橡膠褐根病菌的相對(duì)抑菌活性為33.71%，并且該菌株發(fā)酵濾液對(duì)外界環(huán)境條件的穩(wěn)定性仍不明確。為了提升17-7菌株的抑菌活性，獲得穩(wěn)定的活性物質(zhì)，并進(jìn)一步研究其發(fā)酵濾液的穩(wěn)定性。本研究通過(guò)改變培養(yǎng)基組成，在原培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加玉米粉和酵母粉，采用正交試驗(yàn)和單因子試驗(yàn)相結(jié)合，篩選出對(duì)橡膠褐根病菌具有最佳抑菌活性的培養(yǎng)基組成；并進(jìn)一步通過(guò)單因子變量試驗(yàn)研究外界環(huán)境對(duì)17-7菌株發(fā)酵濾液抑菌活性的影響，為更好地發(fā)揮菌株的生防潛力提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試菌株""17-7菌株（S."samsunensi）、橡膠樹白根病菌（Rigidoporus"lignosus）、橡膠樹褐根病菌（Phellinus"noxius）、云南鏈格孢（Alter naria"yunnanensis）、橡膠樹棒孢霉落葉病菌（Corynespora"cassiicola）、橡膠樹炭疽病菌（Colle totrichum"siamense、C."karstii、C."wanningense、C."plurivorum、C."fructicola、C."bannaense、C."brevisporum）均由云南省熱帶作物科學(xué)研究所植物保護(hù)與微生物利用研究中心分離保存。

1.1.2""培養(yǎng)基""種子液培養(yǎng)為液體高氏一號(hào)培養(yǎng)基（每升含可溶性淀粉20.0nbsp;g，KNO3"1.0"g，K2HPO4"0.5"g，MgSO4·7H2O"0.5"g，NaCl"0.5"g，F(xiàn)eSO4·7H2O"0.01"g，瓊脂20"g，pH為7.4～7.6）；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基[9]（每升含葡萄糖20"g、大豆粉25"g、K2HPO4"1"g、NaCl"0.5"g、CaCO3"0.5"g）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.1.3""主要儀器""CLIMACELL培養(yǎng)箱（美國(guó)3M）；BSD-400博迅振蕩培養(yǎng)箱。

1.2""方法

1.2.1""放線菌發(fā)酵濾液的制備""種子液：挑取單個(gè)菌落接種于100"mL的液體高氏一號(hào)培養(yǎng)基中，于28"℃、140"r/min振蕩培養(yǎng)5"d，制成種子液。

發(fā)酵：發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH為8，培養(yǎng)基裝瓶量為150"mL/500"mL，搖床轉(zhuǎn)速為140"r/min，種子液的接種量為10%，在28"℃條件下培養(yǎng)5"d后，12"000"r/min離心15"min，經(jīng)0.22"μm濾膜過(guò)濾，獲得無(wú)菌發(fā)酵濾液。

1.2.2""菌絲生長(zhǎng)速率法""以橡膠樹褐根病菌為指示菌，采用內(nèi)徑為5"mm的打孔器在活化的橡膠樹褐根病菌菌落周圍打取菌餅。將PDA培養(yǎng)基融化冷卻至50"℃左右，取1"mL濾液與99"mL"PDA培養(yǎng)基混勻，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中制成帶毒培養(yǎng)基平板。在每個(gè)平板中接入1個(gè)菌餅，帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，以無(wú)菌水與培養(yǎng)基混合的平板為對(duì)照。28"℃下暗培養(yǎng)4"d后，用十字交叉法測(cè)定供試菌生長(zhǎng)直徑，計(jì)算抑制率，抑制率="[（對(duì)照菌直徑-處理菌直徑）/（對(duì)照菌直徑-菌餅直徑）]×100%。

1.2.3""雙碳源、雙氮源對(duì)17-7菌株抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的影響""雙碳源和雙氮源正交試驗(yàn)：基于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選擇雙碳源（葡萄糖、酵母粉）和雙氮源（大豆粉、玉米粉）共4個(gè)因素，設(shè)置4個(gè)水平（表1），選用L16（44）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，發(fā)酵試驗(yàn)重復(fù)3次。將菌株發(fā)酵濾液稀釋5倍后取1"mL與99"mL"PDA培養(yǎng)基混勻，制成含毒平板。根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌率。

1.2.4""無(wú)機(jī)鹽篩選""以1.2.3中篩選出的雙碳源、雙氮源培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選擇CuSO4、ZnSO4、MnCl2、NaCl、FeSO4、K2HPO4、CaCO3、MgSO4、KCl等9種無(wú)機(jī)鹽，按質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.1%加入雙碳氮源培養(yǎng)基，配成含不同無(wú)機(jī)鹽離子的培養(yǎng)基。測(cè)定不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)17-7菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響，每個(gè)處理3次重復(fù)，選擇抑菌活性較好的3種無(wú)機(jī)鹽。根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌率。

1.2.5""優(yōu)化后培養(yǎng)基發(fā)酵濾液抑菌譜測(cè)定""分別取優(yōu)化后的菌株發(fā)酵濾液原液1"mL或稀釋5倍后取1"mL與99"mL"PDA培養(yǎng)基混勻，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中分別制成含稀釋100倍與稀釋500倍發(fā)酵濾液的PDA平板，按照1.2.2的方法接種11株病原菌，并測(cè)定抑菌率，對(duì)比優(yōu)化后培養(yǎng)基不同稀釋倍數(shù)對(duì)供試病原菌的抑菌活性。

1.2.6""發(fā)酵濾液穩(wěn)定性測(cè)試""（1）溫度穩(wěn)定性。將發(fā)酵濾液分別于20、40、60、80、100"℃水浴處理30"min，取菌株發(fā)酵濾液1"mL與99"mL"PDA培養(yǎng)基混勻。每處理重復(fù)3次，根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌率。

（2）紫外穩(wěn)定性。將發(fā)酵濾液置于15"W紫外燈下約20"cm處，分別照射1、2、3、4、5、6"h。每處理重復(fù)3次，根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌率。

（3）蛋白酶穩(wěn)定性。在發(fā)酵濾液中分別加入終濃度為1"mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K，于37"℃處理2"h，以未添加蛋白酶處理的發(fā)酵濾液為對(duì)照。每處理重復(fù)3次，根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌率。

（4）酸堿穩(wěn)定性。采用1"mol/L"NaOH和1"mol/L"HCl調(diào)節(jié)發(fā)酵濾液pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，放置24"h后再次將pH調(diào)回中性。每處理重復(fù)3次，根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌率。

（5）儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。將發(fā)酵濾液分別置于4"℃和25"℃下放置3、6、9、15、30、60、120"d。每處理重復(fù)3次，根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌率。

1.3""數(shù)據(jù)處理

利用Excel"2003和SASnbsp;9.4M6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用GraphPad"Prism"8.0軟件作圖，并應(yīng)用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2""結(jié)果與分析

2.1""17-7菌株碳、氮源正交試驗(yàn)

選擇葡萄糖、酵母粉、大豆粉、玉米粉4個(gè)因素，進(jìn)行4因素4水平正交試驗(yàn)（表2），根據(jù)抑菌活性結(jié)果，確定最終發(fā)酵配方。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)橡膠褐根病菌抑制率的影響順序?yàn)锽gt;Cgt;Agt;D，最佳水平組合為A4B4C2D1。根據(jù)方差分析的結(jié)果，主效因子B在2、3、4水平差異不顯著，出于成本考慮，最佳組合為A4B2C2D1，即大豆粉25"g，玉米粉10"g，葡萄糖10"g，酵母粉2"g。

2.2""不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)17-7菌株抑菌活性的影響

供試的9種無(wú)機(jī)鹽對(duì)17-7菌株抑菌活性的影響具有顯著差異（圖1）。添加K2HPO4和CaCO3的抑菌活性顯著高于其他無(wú)機(jī)鹽離子，其次為NaCl，選取抑菌活性較高的3種無(wú)機(jī)鹽離子進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。根據(jù)前期研究結(jié)果[9]，K2HPO4選擇添加量為1"g時(shí)，17-7菌株的抑菌活性最好，NaCl和CaCO3不同水平添加量的抑菌率無(wú)顯著差異，因此選擇NaCl和CaCO3添加量為0.05%，即1"L發(fā)酵培養(yǎng)基中含大豆粉25"g、玉米粉10"g、葡萄糖10"g、酵母粉2"g、K2HPO4"1"g、NaCl"0.5"g、CaCO3"0.5"g。

2.3""17-7菌株發(fā)酵濾液抑菌譜測(cè)定

采用優(yōu)化后17-7菌株的發(fā)酵濾液，對(duì)供試的11種橡膠樹病原菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)17-7菌株具有廣譜的抑菌活性。發(fā)酵濾液在稀釋100倍和500倍時(shí)均具有較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)橡膠褐根病菌的抑菌率分別為83.93%和51.37%，稀釋500倍時(shí)抑菌率較優(yōu)化前提高了17.66%。17-7菌株發(fā)酵濾液對(duì)炭疽病菌的抑菌效果較突出，稀釋500倍時(shí)其抑菌率仍能達(dá)到68.33%～78.89%（表3）。

2.4""發(fā)酵濾液的溫度穩(wěn)定性

由圖2可以看出，在20～100"℃范圍內(nèi)，17-7菌株發(fā)酵濾液熱處理30"min均具有較好的抑菌活性，抑菌率均在80%以上，其中，20～80"℃范圍內(nèi)的抑菌活性最佳，與CK發(fā)酵濾液抑菌活性無(wú)顯著性差異；100"℃時(shí)，17-7菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性略有下降，其抑菌率為84.31%。發(fā)酵濾液在100"℃處理30"min后仍具有較好的抑菌活性，說(shuō)明發(fā)酵濾液中的抑菌活性物質(zhì)對(duì)高溫不敏感，具有較好的熱穩(wěn)定性。121"℃處理30"min后，抑菌活性為56.53%，說(shuō)明發(fā)酵濾液中存在部分抑菌活性物質(zhì)在高溫高壓條件下易失活。

2.5""發(fā)酵濾液的紫外穩(wěn)定性

不同紫外照射時(shí)間對(duì)17-7菌株發(fā)酵濾液抑菌活性的影響具有明顯差異（圖3）。紫外照射時(shí)間越長(zhǎng)其抑菌活性越低，照射1"h后其抑菌率為87.81%，與CK無(wú)顯著差異，仍具有較好的抑菌活性。紫外照射2"h后其抑菌率下降至73.79%，照射4"h后抑菌率降至46.75%，并逐漸趨于穩(wěn)定。說(shuō)明17-7菌株發(fā)酵濾液中可能存在對(duì)紫外敏感的活性物質(zhì)，或者由于發(fā)酵濾液中存在某種紫外保護(hù)劑延緩了紫外線對(duì)發(fā)酵濾液抑菌活性的影響。

2.6""發(fā)酵濾液的蛋白酶穩(wěn)定性

經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，17-7菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性與CK發(fā)酵濾液無(wú)顯著差異，抑菌率均在80%以上，經(jīng)蛋白酶K處理的菌株發(fā)酵濾液抑菌率為78.98%，略有下降（圖4）。說(shuō)明17-7菌株發(fā)酵濾液中，主要的抑菌活性物質(zhì)對(duì)蛋白酶不敏感，代謝產(chǎn)物中可能存在少量的抑菌蛋白，經(jīng)蛋白酶K處理后失活。

2.7""發(fā)酵濾液的酸堿穩(wěn)定性

在酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)中，17-7菌株發(fā)酵濾液在pH為4～7時(shí)均具有較好的抑菌活性，其抑菌率與CK無(wú)顯著差異，發(fā)酵濾液對(duì)酸性環(huán)境更為耐受，pH為4時(shí)其抑菌率最大為78.98%。pH為2～12時(shí)，發(fā)酵濾液的抑菌活性變化趨緩，抑菌率仍能保持在57.00%以上，但強(qiáng)堿性環(huán)境下更容易使發(fā)酵濾液中的活性物質(zhì)失活。在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境下發(fā)酵濾液抑菌活性下降趨勢(shì)明顯，pH為1和13時(shí)，抑菌率分別降至31.02%和21.16%（圖5）。

2.8""發(fā)酵濾液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

在不同的儲(chǔ)藏溫度下，17-7菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性具有一定差異（圖6）。儲(chǔ)藏30"d內(nèi)，4"℃環(huán)境下發(fā)酵濾液抑菌活性明顯高于25"℃環(huán)境下的抑菌活性，4"℃儲(chǔ)藏3"d時(shí)抑菌率為91.99%，而25"℃儲(chǔ)藏3"d時(shí)抑菌率降至53.36%，說(shuō)明17-7菌株發(fā)酵濾液中存在一類活性物質(zhì)在水相中極不穩(wěn)定，低溫環(huán)境可以延緩其反應(yīng)速度。值得注意的是，30"d后不同儲(chǔ)存溫度下的發(fā)酵濾液抑菌活性相當(dāng)，抑菌率分別為49.18%、48.01%，到120"d時(shí)呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，抑菌率分別上升至62.58%、61.91%，均顯著高于30"d時(shí)的抑菌率（Plt;0.05）。

3""討論

鏈霉菌能產(chǎn)生約10萬(wàn)種抗生素化合物，占所有農(nóng)化應(yīng)用天然產(chǎn)物的70%～80%，被稱為天然產(chǎn)物的儲(chǔ)存庫(kù)[10-12]。培養(yǎng)基組成（即碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等）對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響非常復(fù)雜，且對(duì)不同微生物產(chǎn)生明顯差異[7，"13]。研究表明，營(yíng)養(yǎng)組成的變化可激發(fā)鏈霉菌產(chǎn)生不同類型的活性物質(zhì)[14]。本研究以橡膠樹褐根病菌為靶標(biāo)菌，在原培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了玉米粉和酵母粉，采用正交試驗(yàn)和單因子試驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)鏈霉菌17-7菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，獲得該菌株最適宜產(chǎn)活性物質(zhì)的配方為：大豆粉25"g/L、玉米粉10"g/L、葡萄糖10"g/L、酵母粉2"g/L、K2HPO4"1"g/L、NaCl"0.5"g/L、CaCO3"0.5"g/L，發(fā)酵濾液稀釋500倍后對(duì)橡膠樹褐根病菌的抑菌率為51.37%，較優(yōu)化前提高了17.66%。

微生物生物合成基因簇的激活通常與營(yíng)養(yǎng)類型或濃度的變化有關(guān)，特別是碳、氮或無(wú)機(jī)鹽的變化能成功誘導(dǎo)微生物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[15]。SCHWARZ等[14]選擇5株具有豐富次生代謝產(chǎn)物基因簇背景的菌株，通過(guò)改變培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件，在30種不同培養(yǎng)條件下，從發(fā)酵液中共檢測(cè)到590個(gè)新的化合物，編碼這些化合物的基因簇?cái)?shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了所預(yù)測(cè)的次生代謝產(chǎn)物基因簇?cái)?shù)量。大豆粉、玉米粉等農(nóng)副產(chǎn)品具有高蛋白質(zhì)含量，利用其作為氮源的放線菌能產(chǎn)生更多的活性物質(zhì)[16-17]。葡萄糖作為一種優(yōu)質(zhì)碳源，被廣泛應(yīng)用于一些工業(yè)化生產(chǎn)的抗生素中，酵母粉也是卡那霉素鏈霉菌（S."kanamyceticus）等鏈霉菌產(chǎn)抗菌素的理想碳源[18]。本研究通過(guò)改變培養(yǎng)基組成和添加量，有效提升了菌株的抑菌活性，推測(cè)可能是由于營(yíng)養(yǎng)成分的改變激活了一些沉默的次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，增加了活性物質(zhì)的種類。

本研究對(duì)17-7菌株抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性分析顯示，17-7菌株發(fā)酵濾液具有較好的熱穩(wěn)定性，100"℃處理30"min后的抑菌效果與CK無(wú)顯著差異，但121"℃處理30"min后抑菌率降至56.53%，說(shuō)明17-7菌株發(fā)酵濾液中存在一部分耐高溫高壓的活性物質(zhì)。鏈霉菌發(fā)酵液普遍具有熱穩(wěn)定性，如黃麻鏈霉菌AUH-1菌株發(fā)酵液在60～80"℃熱處理下對(duì)水稻紋枯病菌的抑制率無(wú)顯著差異[19]，黃三素鏈霉菌15-6菌株發(fā)酵液在60"℃和80"℃不同時(shí)間處理后的抗菌效果也無(wú)明顯改變[20]，但是當(dāng)溫度明顯高于80"℃時(shí)，其發(fā)酵液的抗菌活性均明顯降低。紫外線長(zhǎng)時(shí)間照射會(huì)破壞17-7菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性，隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)抑菌活性逐漸降低，但紫外照射時(shí)間在1"h以內(nèi)的抑菌活性與CK無(wú)顯著差異。鏈霉菌能產(chǎn)生一些具有吸收紫外線、抗氧化活性的代謝產(chǎn)物，可以通過(guò)減輕紫外線輻射的有害影響來(lái)實(shí)現(xiàn)光保護(hù)作用[21]。SáNCHEZ-SUáREZ等[22]發(fā)現(xiàn)鏈霉菌代謝產(chǎn)生的生物堿是抗氧化化合物中最具代表性的一類，17-7菌株可能通過(guò)代謝產(chǎn)生該類物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)光保護(hù)特性。17-7菌株發(fā)酵濾液還具有較好的酸堿耐受性，并且對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感，具有較好的抑菌穩(wěn)定性。pH為3～10時(shí)發(fā)酵濾液均能發(fā)揮較好的抑菌活性，只有在強(qiáng)酸強(qiáng)堿（pH為1或13）環(huán)境下會(huì)顯著降低發(fā)酵濾液的抑菌活性。此外，值得注意的是17-7菌株發(fā)酵濾液在4"℃和25"℃的抑菌活性均呈先降后升的趨勢(shì)，儲(chǔ)藏120"d后其抑菌活性分別上升至62.58%、61.91%，顯示17-7菌株具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

本研究以橡膠樹褐根病菌為生物活性指示菌，通過(guò)改變培養(yǎng)基組成提升17-7菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性，并明確了菌株發(fā)酵濾液在不同溫度、酸堿度、紫外線照射、酶液處理等條件下的穩(wěn)定性，為17-7菌株的田間應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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