海南油茶自交與異交的花粉管生長差異分析

摘""要：油茶（Camellia"spp.）是我國重要的木本油料，在保障國家糧油安全中占有重要地位。前人初步研究表明，油茶的自交不親和性可能是導(dǎo)致油茶結(jié)實率低的重要原因之一。本研究擬采用熒光顯微鏡觀察法，結(jié)合形態(tài)觀察，以熱研2號、熱研3號海南油茶為材料，自交和雜交組合分別為熱研3號×熱研3號、熱研3號×熱研2號，進(jìn)行自交和異交授粉后采樣，采用“雙載玻片貼合兩面觀察法”制片后，進(jìn)行花粉管熒光顯微觀察，比較二者花粉管生長的差異。結(jié)果表明：熱研系列海南油茶柱頭前端均有不同程度的彎曲，柱頭數(shù)為3～5個不等，雌蕊長度略大于雄蕊長度；雌蕊長度和雄蕊數(shù)量、雄蕊長度呈顯著正相關(guān)。其單花開放持續(xù)5～8"d，花粉散粉時間和柱頭具可授性的時間重疊?；ǚ酃軣晒庥^察表明，熱研3號海南油茶自交與異交花粉管前期生長速度大致相同，二者生長速度均在授粉后12～24"h內(nèi)達(dá)到頂峰，自36"h后，雜交花粉管生長長度超過自交花粉管，直至生長至子房內(nèi)。授粉48"h后，自交與異交花粉管均能到達(dá)花柱基部，此時已觀察到異交花粉管能進(jìn)入子房，但自交花粉管生長速度則變慢，直至在花柱基部接近子房處生長停滯。該研究結(jié)果為海南油茶品種配置和高效栽培提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：海南油茶；自交；異交；花粉管中圖分類號：S432.1""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Analysis"of"Pollen"Tube"Growth"Difference"Between"Self"and"Cross-"pollin ation"of"Camellia"hainanensis

YU"Zhaoyan，"GONG"Han，"XU"Yufen，"LIU"Yanju，"WU"Kunlin，"CAO"Qiulin，"JIA"Xiaocheng*

Coconut"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Wenchang，"Hainan"571339，"China

Abstract："Camellia"spp."is"an"important"woodynbsp;oil"in"China，"which"plays"an"important"role"in"ensuring"national"grain"and"oil"security."Previous"studies"showed"that"the"self-incompatibility"of"Camellia"spp."may"be"one"of"the"important"reasons"for"the"low"seed"setting"rate."In"this"study，"fluorescence"microscopy"and"morphological"observation"were"adopted."C."hainanica"Reyan"2"and"Reyan"3"were"used"as"the"material，"and"the"self-cross"and"hybrid"combinations"were"Reyan"3×Reyan"3，"Reyan"3×Reyan"2，"respectively."Samples"were"collected"after"self-cross"and"cross-pollination."The"difference"of"pollen"tube"growth"between"the"two"groups"was"compared"by"fluorescence"microscopy."The"results"showed"that"there"were"different"degrees"of"curvature"at"the"front"end"of"the"stigmas，"the"number"of"stigmas"ranged"from"3"to"5，"and"the"pistil"length"was"slightly"larger"than"the"stamen"length."The"length"of"pistil"was"positively"correlated"with"the"number"and"length"of"stamen."The"single"flower"opening"lasted"for"5?8"d，"and"the"time"of"pollen"dispersal"overlapped"with"the"time"of"stigma"receptivity."Pollen"tube"fluorescence"observation"showed"that"the"growth"rates"of"autocross"and"outcross"pollen"tubes"of"Reyan"3"Camellia"hainanica"were"roughly"the"same"in"the"early"stage，"and"the"growth"rates"of"both"reached"the"peak"within"12?24"h"after"pollination."After"36"h，"the"growth"length"of"hybrid"pollen"tube"exceeded"that"of"autocross"pollen"tube"until"it"grew"into"ovary."48"h"after"pollination，"both"inbred"and"outbred"pollen"tubes"could"reach"the"base"of"the"style，"and"it"was"observed"that"the"outbred"pollen"tubes"could"enter"the"ovary，"but"the"growth"rate"of"the"inbred"pollen"tubes"slowed"down"until"the"growth"stopped"at"the"base"of"the"style"near"the"ovary."The"results"would"provide"a"theoretical"basis"for"the"variety"configuration"and"efficient"cultivation"of"C."hainanica.

Keywords："Camellia"hainanica;"self-pollination;"cross-pollination;"pollen"tube

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.12.011

油茶（Camellia"spp.）是山茶屬植物中種子含油率較高且有一定栽培面積樹種的統(tǒng)稱，是我國重要的食用油料樹種之一，被譽(yù)為“東方油橄欖”，與油棕（Elaeis"quineensis）、油橄欖（Olea"europaea）、椰子（Cocos"nucifera）并稱為世界四大木本油料樹種。油茶油營養(yǎng)價值高，不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上[1-2]。海南油茶（Camellia"hainanica）是獨具熱帶特色的油茶新種，俗稱“山柚”，其茶籽油稱為“山柚油”，山柚油口味醇香、品質(zhì)優(yōu)良，且已有研究表明其有效成分含量及物質(zhì)組成等方面顯著優(yōu)于內(nèi)陸地區(qū)廣泛種植的普通油茶[3-5]。

自交不親和產(chǎn)生的原因多樣，從花粉在柱頭萌發(fā)至受精卵產(chǎn)生的過程中均會發(fā)生不育現(xiàn)象，目前經(jīng)觀察確認(rèn)自交不親和的植物多為茄科、罌粟科、十字花科和報春花科等，甜菊的自交不親和可能發(fā)生在花粉對柱頭的黏附過程、柱頭對花粉的識別過程[6]。歐洲李花粉與雌蕊中的其中一個的S等位基因相同時，導(dǎo)致花粉無法識別或花粉管生長受到抑制[7]；油茶基因組中的S-RNase基因在自交不親和后期起到作用，PODs基因可能參與了油茶自交授粉后花粉管程序性死亡[8-9]。長瓣短柱茶也因為強(qiáng)自交不親和性導(dǎo)致胚珠敗育，推測是當(dāng)自交花粉落在柱頭上時，未接收到信號，使得胚珠內(nèi)無成熟胚囊，無法完成受精[10]，該自交不親和反應(yīng)發(fā)生在花柱基部，表現(xiàn)為合子前自交不親和性。威寧短柱油茶自交不親和性是其結(jié)實率低的主要原因之一，在雜交育種中應(yīng)充分考慮這一因素[11]。

油茶為雌雄同株的異花授粉植物，使得實生苗個體差異較大，性狀不穩(wěn)定，所以生產(chǎn)上多以無性繁殖為主，由此有關(guān)油茶的研究主要側(cè)重于豐產(chǎn)栽培技術(shù)方面[12]。但油茶花粉在柱頭萌發(fā)生長是受精坐果的前提，直接關(guān)系到油茶能否結(jié)實。因此開展海南油茶自交和異交授粉后花粉管生長行為的研究，對提高結(jié)實率具有一定指導(dǎo)意義。目前，國內(nèi)學(xué)者對油茶展開大量研究，明確其具有自交不親和性，但海南油茶花、果特征和生長結(jié)果習(xí)性與普通油茶存在明顯差異，仍缺乏系統(tǒng)而全面的研究。本研究以海南油茶為研究對象，從形態(tài)學(xué)的角度對其自交和異交花粉管的生長行為進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，為海南油茶良種配置和雜交育種提供理論基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

試驗地點位于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所油茶基地，選擇性狀良好的優(yōu)良品種熱研3號海南油茶為試材，異花授粉父本品種為熱研2號，年初開展撫育工作。其中供試的熱研系列油茶為椰子所從海南油茶中選育的優(yōu)良品系。

1.2""方法

1.2.1""花粉采集""取大蕾期的花朵，剝下花藥室內(nèi)陰干，收集于離心管中，低溫干燥保存[13-14]。

1.2.2""授粉及采樣""以熱研3號為母本授粉，自交和雜交組合分別為熱研3號×熱研3號、熱研3號×熱研2號。盛花期去雄，用毛筆蘸取花粉輕涂在柱頭，肉眼可見柱頭處有黃色花粉為授粉完成，采集授粉后3、6、12、24、48、72、96、120、144、168"h的雌蕊各5枚，用卡諾固定液固定，固定12～24"h后放入70%乙醇中，4"℃冰箱保存?zhèn)溆肹15-17]。

1.2.3""熒光顯微觀察""參考袁德義等[18]的方法，將油茶花柱經(jīng)各級酒精復(fù)水（50%酒精→30%酒精→蒸餾水），在8"mol/L的NaOH中浸泡2"h軟化，蒸餾水洗凈后在0.2%的水溶性苯胺藍(lán)染液中染色6"h以上，制作臨時切片，在熒光顯微鏡下觀察。

2""結(jié)果與分析

2.1""海南油茶花器官結(jié)構(gòu)

柱頭數(shù)多為3～4個，少數(shù)為5個，柱頭前端彎曲，被雄蕊包裹（圖1）。不同品種花柱長度、柱頭彎曲程度等均有差異，熱研2號雌蕊最短，熱研3號最長。熱研3號油茶雄蕊數(shù)量為102（表1），在3個品種中最多，雄蕊長度也最長，為15.06"mm，雖單枚花藥花粉量低于熱研2號，但在3個品種中，單花花粉量最多，花形也最大。供試的3個品種雌雄蕊相對長度多為雌長雄短或雌雄等長，熱研1號約84%的花為雌長雄短，熱研3號雌雄蕊空間位置最接近，約74%的花為雌雄等長。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，雄蕊長度和雌蕊長度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為0.788（表2）；雄蕊數(shù)量和雄蕊、雌蕊長度均呈顯著正相關(guān)。因此，柱頭越長的海南油茶品系，雄蕊數(shù)量也越多，雄蕊長度也越長，一定程度上降低了自交的成功率。此外，熱研3號海南油茶的柱頭彎曲程度也最小，這是否由于雄、雌蕊之間的空間位置決定的，還有待進(jìn)一步研究。

2.2""海南油茶花期物候和柱頭可授性

海南油茶單花開放從花朵露白至花瓣脫落、雄蕊掉落為止經(jīng)歷約5～8"d（圖2）。但油茶群體花期和單花花期長短均與天氣有很大關(guān)系，溫度較高開花提前，溫度較低開花則推遲；海南油茶單花遇高溫時會加快枯萎，大風(fēng)雨水天則難以開放。

2022、2023年對試驗地的熱研系列油茶進(jìn)行花期物候觀察記錄，熱研1號11月中旬開始開放，11月末達(dá)到盛花期；熱研2號11月上旬開始開放，11月中旬盛花期，花期較熱研1號長，約40"d；熱研3號11月中旬開始開放，11月下旬開始盛花期；熱研2號和熱研3號2個品種間花期重疊時間較長。

觀察表明，海南油茶花開放時，花藥開裂，花粉散出，至開花第3天時，花粉基本散畢。此時，柱頭可授性也最強(qiáng)，從第4天起，柱頭可授性開始下降，至第6天開始基本消失（表3）。供試品系的雌、雄蕊成熟時間基本重疊，與前人研究一致，由此推斷，海南油茶自交不親和的主要原因不表現(xiàn)為雌雄異熟。

2.3""自交與異交花粉管生長情況

由試驗結(jié)果看出，經(jīng)過水溶性苯胺藍(lán)染色后，自交和異交能夠正常萌發(fā)的花粉管呈現(xiàn)強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光反應(yīng)。由圖3可見，自花授粉后12"h，大量花粉管生長至花柱1/3處；授粉后48"h，花粉管已經(jīng)生長至花柱基部，之后花粉管生長緩慢或停滯，到達(dá)子房上端后，在熒光顯微鏡下難以觀察到。在異花授粉過程中，授粉后12"h，花粉管生長至花柱1/3處（圖4），授粉后24"h，有少量花粉管達(dá)到花柱1/2處，授粉后48"h，已能觀察到部分花粉管穿過花柱基部，進(jìn)入子房。

研究表明，海南油茶的自交傳粉后，未在一開始發(fā)生花粉排斥，花粉在柱頭萌發(fā)和花粉管生長未受到抑制，但最后仍自交敗育，可能與其生殖特性相關(guān)。

2.4""自交與異交花粉管生長情況比較

熱研系列油茶自交和異交花粉管不同時間段的平均生長速度具有明顯差異，總體呈現(xiàn)先加快后緩慢的趨勢。由圖5可見，在24"h之前自交和異交花粉管的生長特性無明顯差異，在相同時間內(nèi)，自交花粉管能達(dá)到異交花粉管同樣的長度，數(shù)量也無明顯減少。但在48"h左右，自交與異交花粉管的生長開始產(chǎn)生差異。自交花粉管在24～48"h間生長速度開始減慢，而異交花粉管則順利到達(dá)花柱基部，說明自交花粉管可能受到抑制。

自交和異交在授粉后12～24"h，生長速度達(dá)到最大，分別為0.48"mm/h和0.44"mm/h。觀察到的自交和異交的花粉管，隨著授粉時間延長，花柱尖端肉眼可見有干枯，在熒光顯微鏡下熒光較弱，但越靠近花柱基部，熒光越強(qiáng)。

3""討論

本研究對海南油茶熱研花粉萌發(fā)和花粉管生長的觀察表明，其自交和異交授粉花粉管都能于48"h達(dá)到花柱基部，整個過程中平均生長速度相差不大，但不同時間段的花粉管生長速度不一樣，自交花粉管在24"h內(nèi)生長速度快，超過異交花粉管，但隨后生長速度下降直至停止。異交花粉管則能一直保持生長，72"h時已生長進(jìn)子房。此外，花粉管白天生長速度比夜晚快，可能是由于夜晚溫度較低且沒有光照，由此推斷溫度和光照也是影響海南油茶花粉管生長的重要因子之一[19]。

試驗中觀察到的油茶自交不親和現(xiàn)象與陳雅等[20]、高超等[21-22]的研究結(jié)論一致，海南油茶授粉后花粉管于48"h達(dá)到花柱基部，這與湘林1號、攸縣油茶、華碩系列油茶授粉后花粉管生長速度不一致，推測產(chǎn)生這種差異的原因可能與海南氣候、物種特性有關(guān)[23-25]，也可能和植株的自身營養(yǎng)狀況有關(guān)，使花粉管生長受限導(dǎo)致坐果率低，產(chǎn)生大小年現(xiàn)象。

多數(shù)植物的自交不親和性是由S位點控制，從形態(tài)上主要表現(xiàn)為雌雄異熟和雌雄異位。雌雄蕊的長度和雌雄蕊成熟度的差異均能影響植物的自交親和性[26-28]。在油茶中，雌、雄蕊的成熟期重疊，且未產(chǎn)生空間上的位置變化，高超等[21]也發(fā)現(xiàn)，油茶自交受限制的情況和遺傳學(xué)上配子體、孢子體自交不親和不同，其敗育發(fā)生在子房處，也就是合子形成以前。在授粉過程中，油茶花粉或花粉管細(xì)胞攜帶自身信息，不斷感知來自柱頭或花柱道細(xì)胞的外部信號，通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，順利完成異花受精過程。已有研究表明，油茶基因組中的S-RNase基因在自交不親和后期起到作用，PODs基因也可能參與了油茶自交授粉后花粉管程序性死亡，因此油茶自交不親和過程包含了一個復(fù)雜的生理響應(yīng)和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在這一進(jìn)程中，還有哪些關(guān)鍵因子參與其中，還有待進(jìn)一步研究[29]。但是隨著研究的深入，在十字花科和茄科植物中發(fā)現(xiàn)，S-RNase的缺失和功能障礙引起花粉S因子的平行突變，使得該物種從自交不親和轉(zhuǎn)變?yōu)樽越挥H和，在油茶品種中，是否也存在自交親和的類型[30]。

除了自交不親和之外，花期的氣候環(huán)境條件也影響花粉萌發(fā)和花粉管生長行為[31-32]。油茶的花粉萌發(fā)和花粉管的生長受內(nèi)外部因素的共同調(diào)控。連續(xù)低溫會導(dǎo)致花粉管生長異常，產(chǎn)生嚴(yán)重落花落果現(xiàn)象，坐果率降低。油茶的花粉管萌發(fā)和天氣關(guān)系密切，花粉萌發(fā)需要適宜溫度，多次授粉結(jié)果表明，在授粉前后天氣晴朗時，能在花柱內(nèi)觀察到的花粉管數(shù)量遠(yuǎn)多于授粉后降雨的時期，證明天氣是授粉中重要因素之一。在自然條件下觀察到，各品種坐果率存在一定差異，表明品種間的自交不親和程度可能存在差別，如能繼續(xù)深入探究不同品種間的不親和強(qiáng)度，配合輔助授粉技術(shù)，則可進(jìn)一步明確油茶自交不親和的作用機(jī)理，為海南油茶品種配置和高產(chǎn)栽培提供理論基礎(chǔ)。

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