利用ELISA與qRT-PCR技術(shù)檢測番木瓜PRSV病毒的方法研究

摘""要：番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya"ringspot"virus，"PRSV）是番木瓜生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一，其發(fā)病率高，傳播快，危害重。為及時發(fā)現(xiàn)感染PRSV的番木瓜植株，本研究建立了分別利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)和熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測番木瓜植株感染PRSV的方法，利用這2種方法檢測多株轉(zhuǎn)基因番木瓜與非轉(zhuǎn)基因番木瓜的PRSV含量，并對結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：利用PRSV多肽抗原作為標(biāo)準(zhǔn)品制備的抗體建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度較好，可用于ELISA法檢測PRSV；qRT-PCR法中選擇的內(nèi)參基因Cpa03g018830在番木瓜的不同生長階段均穩(wěn)定表達(dá)，可作為PRSV含量測定的內(nèi)參基因；ELISA法和qRT-PCR法對多株轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因番木瓜植株中PRSV含量的檢測結(jié)果基本一致，表明這2種方法均可用于番木瓜植株中PRSV含量的檢測。利用這2種檢測手段，可及時發(fā)現(xiàn)并鏟除感染了PRSV的番木瓜植株，有效預(yù)防與控制PRSV傳播。

關(guān)鍵詞：番木瓜環(huán)斑病毒；酶聯(lián)免疫吸附；熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR中圖分類號：S436.67""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Detection"of"Papaya"PRSV"Virus"Using"ELISA"and"qRT-PCR"Techniques

XIE"Xiuju1，"XIA"Qiyu1*，"HUO"Shanshan1，"DU"Xiaoxi1，"MAI"Xianjun2，"ZHANG"Yuliang1，"GUO"Anping1，"LI"Feng3，"KONG"Xiangyi2**，"ZHAO"Hui1**

1."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Hainan"Key"Laboratory"for"Biosafety"Monitoring"and"Molecular"Breeding"in"Off-Season"Reproduction"Regions，"Sanya，"Hainan"572024，"China;"2."Sanya"Academy"of"Tropicalnbsp;Agriculture，"Sanya，"Hainan"572022，"China;"3."Bellagen"Biotechnology"Co.，"Ltd.，"Jinan，"Shandong"250300，"China

Abstract："Papaya"ringspot"virus"（PRSV）"is"one"of"the"most"serious"diseases"in"papaya"production，"with"high"incidence"rate，"rapid"transmission"and"serious"harm."To"detect"papaya"plants"infected"with"PRSV"in"a"timely"manner，"this"study"established"methods"for"detecting"papaya"plants"infected"with"PRSV"using"enzyme-linkednbsp;immunosorbent"assay"（ELISA）"and"fluorescence"quantitative"reverse"transcription"PCR"（qRT-PCR）."The"two"methods"were"used"to"detect"the"PRSV"content"of"multiple"transgenic"and"non"transgenic"papaya"plants，"and"the"results"were"compared."The"results"showed"that"the"standard"curve"established"using"PRSV"peptide"antigen"as"the"standard"and"antibodies"prepared"from"it"had"good"fitting，"and"could"be"used"for"ELISA"detection"of"PRSV;"The"reference"gene"Cpa03g018830"selected"in"qRT-PCR"method"was"stably"expressed"at"different"growth"stages"of"papaya"and"could"be"used"as"a"reference"gene"for"PRSV"content"determination;"The"detection"results"of"PRSV"content"in"multiple"transgenic"and"non"transgenic"papaya"plants"using"ELISA"and"qRT-PCR"methods"were"basically"consistent，"indicating"that"both"methods"can"be"used"for"the"detection"of"PRSV"content"in"papaya"plants."By"using"thee"two"detection"methods，"papaya"plants"infected"with"PRSV"can"be"detected"and"eradicated"in"a"timely"manner，"effectively"preventing"and"controlling"the"spread"of"PRSV.

Keywords："PRSV;"ELISA;"qRT-PCR

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.12.005

番木瓜（Carica"papaya"L.）是全球熱帶地區(qū)的重要出口水果和消費(fèi)品之一[1-2]。番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya"ringspot"virus，"PRSV）是一種世界性的番木瓜病害，其發(fā)病率高，傳播快，危害重，是番木瓜生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一。PRSV屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）Y病毒屬（Potyvirus）[3]，按寄主范圍的不同可劃分為P和W兩個株系，PRSV-P發(fā)生在大多數(shù)栽培番木瓜的熱帶、亞熱帶國家。PRSV-P感染的典型特征是在受感染的番木瓜果實(shí)上產(chǎn)生環(huán)斑癥狀[4]。除環(huán)斑外，PRSV還會產(chǎn)生一系列其他癥狀。如葉片出現(xiàn)花葉、萎黃和卷曲；葉柄和樹干上部呈現(xiàn)水浸油性條紋；幼葉變形，有時會產(chǎn)生類似于螨蟲損傷的皺縮癥狀。受PRSV感染的番木瓜植株表現(xiàn)出發(fā)育遲緩和花脫落等生理現(xiàn)象，導(dǎo)致產(chǎn)量嚴(yán)重下降。PRSV是通過蚜蟲進(jìn)行傳播，在樹間傳播速度極快，發(fā)病的植株需及早鏟除。因此，為了及時發(fā)現(xiàn)番木瓜植株是否受到PRSV感染，亟需一種簡單、快速、靈敏的檢測PRSV的方法。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是一種結(jié)合抗原抗體免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)的方法，具有快速檢測出植物RNA病毒的優(yōu)點(diǎn)。自CLARK等[5]對ELISA檢測病毒的理論方法進(jìn)行了研究和報道后，ELISA技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于植物病毒檢測。在之前的研究中，PRSV血清學(xué)檢測多以粗提病毒粒子為抗原，存在抗體制備效價低、制備繁瑣等缺點(diǎn)[6-8]，限制了PRSV病毒抗血清的應(yīng)用。近些年來，研究者利用分子生物學(xué)方法在大腸桿菌中高效表達(dá)病毒的外殼蛋白，用純化的蛋白免疫大白兔，制備專化性抗血清，為利用ELISA技術(shù)建立病毒檢測體系研究奠定了基礎(chǔ)[9]。CHEN等[10]開發(fā)了一批H7亞型特異性單克隆抗體（mAb），并建立了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（DAS-ELISA）法測定H7蛋白的含量和檢測除H7HA亞型以外的甲型流感病毒，顯示出極好的靈敏度和高特異性。MARTINEZ"VIEDMA等[11]使用蟲媒病毒特異性肽對收集的339個樣本進(jìn)行血清學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)基于多肽的多重ELISA在感染病毒后2周就可以高效識別寨卡病毒（ZIKV）抗體。

熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）因其快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于動物病毒和植物病毒檢測[12-13]。即使在中等質(zhì)量的DNA情況下，如從石蠟或福爾馬林固定組織中提取的DNA，熒光定量PCR也可以有效地用于病毒檢測[14-15]。qRT-PCR常用的2種方法有TaqMan探針法和SYBR"Green"I染料法，其中SYBR"Green"I染料法因其引物設(shè)計(jì)簡單、檢測成本低而被廣泛使用[16]。許多研究表明，qRT-PCR在量化病毒DNA方面是準(zhǔn)確有效的，HARJU等[17]開發(fā)了qRT-PCR（TaqMan）測定法，用于甜菜壞死黃脈病毒（BNYVV）的特異性檢測，發(fā)現(xiàn)TaqMan的靈敏度是常規(guī)RT-PCR測定的10"000倍。CHENG等[18]開發(fā)了基于SYBR"Green"I的實(shí)時PCR檢測方法，用于正痘病毒的檢測和定量，該方法具有很高的重現(xiàn)性和可靠性，檢測速度更快且具有更高的靈敏度。COERTSE等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與TaqMan探針法相比，SYBR"Green"I檢測的靈敏度大于95%，表明染料法在病毒檢測中同樣具有較高的靈敏度。

以往的研究中，病毒抗體的制備步驟繁瑣，而本研究采用多肽抗原制備PRSV的多克隆抗體，建立了簡單易行的ELISA檢測番木瓜植株中PRSV病毒含量的方法；并以番木瓜單拷貝基因?yàn)閮?nèi)參基因，首次建立了qRT-PCR檢測番木瓜植株P(guān)RSV病毒含量的方法，并對2種檢測方法得到的番木瓜植株中PRSV的含量進(jìn)行比較。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""植物材料""轉(zhuǎn)基因番木瓜與非轉(zhuǎn)基因番木瓜均來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院。轉(zhuǎn)基因番木瓜共18株，包括1株轉(zhuǎn)入海南PRSV的CP基因的T0代番木瓜、6株轉(zhuǎn)入海南PRSV的輔助成分-蛋白酶基因（HC-Pro）發(fā)夾結(jié)構(gòu)的T0代番木瓜苗、8株轉(zhuǎn)入海南PRSV的復(fù)制酶基因（Nib）發(fā)夾結(jié)構(gòu)的T0代番木瓜苗、3株轉(zhuǎn)入海南PRSV的CP基因全長的T1代番木瓜；非轉(zhuǎn)基因番木瓜共6株；非轉(zhuǎn)基因且無PRSV癥狀的番木瓜組培脫毒苗1株。

1.1.2""試劑耗材""植物RNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；2×Q3"SYBR"qPCR"Master"Mix購自吐露港生物科技有限公司；PCR平蓋八排管購自甄選（Labselect）公司；脫脂奶粉購自國賽生物技術(shù)有限公司，96孔酶聯(lián)板購自康寧公司；TMB雙組分顯色試劑盒和Goat"Anti-Rabbit"IgG/HRP購自北京索萊寶科技有限公司。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2""方法

1.2.1""ELISA法測定番木瓜植株的PRSV含量""（1）PRSV的多克隆抗體制備。制備多克隆抗體的抗原肽的氨基酸序列為：DQVPPPTKSVHHEGC，使用的載體為血藍(lán)蛋白載體KLH，由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成抗原及抗體。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。以合成的抗原PRSV-1（93.4%"pure）為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，繪制吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。首先將標(biāo)準(zhǔn)品配制成1000"ng/mL的母液，準(zhǔn)備13只1.5"mL的離心管，編號為S1～S12、CK（對照），分別加入400"μL"coating"buffer稀釋液；吸取400"μL母液至S1管，進(jìn)行2倍稀釋，吹打10次，混勻，渦旋振蕩5"s，從S1管中吸取400"μL液體至S2管，吹打混勻，繼續(xù)以上步驟，進(jìn)行2倍梯度稀釋直至稀釋到S12。將配置好的梯度稀釋液進(jìn)行間接法ELISA實(shí)驗(yàn)，加入顯色液30"min后測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）番木瓜植株的PRSV含量測定。在常年發(fā)病（PRSV）的番木瓜果園中選擇不同生長階段的番木瓜植株樣品共24株，包括18株轉(zhuǎn)基因番木瓜（編號為：CP-1-3、H-1-6、H-1-10、H-1-22、H-2-15、H-3-4、Hc-n-35、N-1-8、N-2-21、N-2-31、N-n-17、N-n-20、N-n-23、N-n-24、N-n-26、YK-1-9、YK-2-11、YK-2-13）和6株非轉(zhuǎn)基因番木瓜（編號為：F-5、F-16、F-25、F-28、F-30、F-50）。每株均在生長期為11、13、14、18、19、21個月時采集葉片（編號為：11M、13M、14M、18M、19M、21M），每個樣品取0.3"g，其中，取0.15"g用于ELISA實(shí)驗(yàn)，剩余樣品放–80"℃保存。另取1株非轉(zhuǎn)基因且無PRSV癥狀的番木瓜組培脫毒苗的葉片作為陰性對照，以稀釋100倍的抗原作為陽性對照。所有樣品進(jìn)行間接ELISA實(shí)驗(yàn)，測定吸光度。若樣品OD值/陰性對照OD值≥2.0，則將該植株判定為PRSV陽性；若樣品OD值/陰性對照OD值lt;2.0，則將該植株判定為PRSV陰性[20]。將判定為陽性的樣品代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算出PRSV含量，并將不同時期樣本PRSV含量的數(shù)據(jù)繪制成熱圖。

1.2.2""qRT-PCR法測定番木瓜植株的PRSV的含量""（1）RNA提取和反轉(zhuǎn)錄。取1.2.1（3）中的24株番木瓜剩余的葉片提取RNA。另采集1株番木瓜組培脫毒苗的葉片0.15"g，提取RNA。以獲得的RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，–80"℃保存待用。

（2）引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證。通過DNAMAN軟件對比39株來源于海南不同地區(qū)不同PRSV株系的NIb序列[21]，選取其保守序列，使用生工生物工程（上海）股份有限公司官網(wǎng)引物設(shè)計(jì)工具進(jìn)行qRT-PCR引物設(shè)計(jì)（NIb-F：nbsp;5'-AGTGGTCAGCCT TCGACAGT-3'，"NIb-R：5'-CCTTCGTGTCGTAA CCAGCC-3'）。以番木瓜Cpa03g018830基因?yàn)閮?nèi)參基因（830-F："5'-TTCGAACGAGTCTGCA GT GG-3'，"830-R："5'-ACCACCTGAACCCAGGC TAA-"3'），并對其表達(dá)量進(jìn)行穩(wěn)定性檢測。隨機(jī)選擇3份感染PRSV的番木瓜的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證內(nèi)參基因Cpa03g018830和目的基因NIb引物的有效性。反應(yīng)體系為：2×Q3"SYBR"qPCR"Master"Mix"10"μL，引物（10"μmol/L）各0.4"μL，cDNA模板"1"μL，加無菌水至20"μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5"℃預(yù)變性30"s；95"℃"10"s，58"℃"30"s，40個循環(huán)；融解曲線為95"℃"15"s，60"℃"60"s，95"℃"15"s。反應(yīng)結(jié)束后，通過擴(kuò)增曲線及熔解曲線判定引物是否有效。

（3）內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性檢測。采用熒光定量PCR對不同生長階段番木瓜葉片Cpa03g-"018830基因的表達(dá)量進(jìn)行穩(wěn)定性測定，以CT值的波動情況評價其是否能應(yīng)用于本研究的內(nèi)參基因。熒光定量PCR反應(yīng)體系和程序同1.2.2（2）。

（4）番木瓜植株的PRSV含量測定。以番木瓜組培脫毒苗為參照，使用qRT-PCR測定24個轉(zhuǎn)基因番木瓜和非轉(zhuǎn)基因番木瓜的不同生長階段樣品中的PRSV含量。以CPa03g018830為內(nèi)參基因，以PRSV的NIb基因?yàn)槟康幕?，進(jìn)行qRT-"PCR擴(kuò)增，每個樣品3次重復(fù)，反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同1.2.2（2）。得出每個樣品的CT值后，利用2–ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析，計(jì)算每個樣品PRSV的相對含量，并將不同時期樣品的數(shù)據(jù)繪制成熱圖。并與ELISA法測定的PRSV含量進(jìn)行比較分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""ELISA法測定PRSV的含量

2.1.1""標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制""依據(jù)ELISA實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度與濃度的結(jié)果（表1）繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為"（R2=0.9998）。此公式R2值大于0.99，表明線性公式擬合較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)樣品的PRSV含量計(jì)算。

2.1.2""番木瓜植株的PRSV含量測定""各個時期轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株樣品的PRSV的含量如圖2所示，非轉(zhuǎn)基因番木瓜在11個月的時候就能檢測到少量的PRSV，在14個月的時候，非轉(zhuǎn)基因番木瓜的病毒含量達(dá)到較高的水平，隨后，PRSV含量持續(xù)升高。大部分轉(zhuǎn)基因植株感染前期只能檢測到少量的PRSV，隨著感染時間的推移，病毒含量也開始升高，在18個月的時候病毒含量達(dá)到較高的水平，部分植株的PRSV含量仍然在較低的水平，個別植株的病毒含量在后期反而降低。

2.2""qRT-PCR法測定番木瓜植株中PRSV的含量

2.2.1""引物驗(yàn)證""隨機(jī)選擇3份感染PRSV的番木瓜葉片樣品對引物進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果（圖3）表明，利用內(nèi)參基因Cpa03g018830和目的基因NIb的引物擴(kuò)增后，均有明顯的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線均具有唯一的吸收峰，因此這2對引物可用于qRT-PCR法檢測番木瓜的PRSV含量。

2.2.2""Cpa03g018830基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證""qRT-"PCR分析中的定量循環(huán)值（CT）反映目的基因的表達(dá)量，CT值越低，目的基因的表達(dá)量越高。對不同階段的番木瓜葉片Cpa03g018830基因的qRT-PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，番木瓜植株各生長期該基因的CT值在23.37～23.72之間（圖4）。這表明各生長期的番木瓜植株Cpa03g018830基因的表達(dá)量較穩(wěn)定。為了進(jìn)一步綜合評估Cpa03g 018830基因在番木瓜不同生長時期的穩(wěn)定性，將熒光定量實(shí)驗(yàn)得到的CT值進(jìn)行校正，綜合geNorm進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)。geNorm分析原理是將候選內(nèi)參基因的CT值轉(zhuǎn)換成相對表達(dá)量（M），M值較小時，表示基因的穩(wěn)定程度較高，如果Mgt;1.5，則表示此基因并不適宜用作內(nèi)參基因[22]。Cpa03g018830基因的geNorm分析如圖5所示，各生長期Cpa03g 018830基因的M值都在1.5以下，說明Cpa03g018830基因在番木瓜的不同生長階段均穩(wěn)定表達(dá)，因此可作為PRSV含量測定的內(nèi)參基因。

2.2.3""qRT-PCR法測定番木瓜植株的PRSV含量""各個生長時期的轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株對照樣本中PRSV的積累量如圖6所示，6棵非轉(zhuǎn)基因番木瓜植株中，隨著時間的推移，PRSV含量逐漸升高，在18個月的時候，病毒含量均急劇升高至較高的水平；轉(zhuǎn)基因番木瓜植株中，在受到PRSV侵染前期，大部分轉(zhuǎn)基因番木瓜植株的PRSV含量都較低，隨著病毒侵染時間的推移，大部分轉(zhuǎn)基因植株中的PRSV含量都開始上升，但一些植株的PRSV含量仍在較低的水平，少數(shù)植株中的PRSV含量上升至較高的水平后又逐漸減低。

3""討論

PRSV作為一種世界性的番木瓜病毒，番木瓜被其侵染后無法得到有效防治，嚴(yán)重影響番木瓜的產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，PRSV感染番木瓜后的早期檢測至關(guān)重要，一旦發(fā)現(xiàn)感染植株，應(yīng)立即將其連根拔除并銷毀，可有效延緩PRSV的傳播速度，降低發(fā)病率。

常用的檢測病毒的方法有qRT-PCR法和ELISA法。BRUISSO等[23]開發(fā)了多重TaqMan的qRT-PCR分析方法，用于檢測9種不同的病毒，并與ELISA法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)大部分情況下，2種實(shí)驗(yàn)方法可獲得相同的結(jié)果，但在某些情況下，僅可通過2種技術(shù)之一檢測到病毒。TORRE等[24]基于TaqMan技術(shù)建立了qRT-PCR方法，用來檢測3種在葫蘆中傳播的種子病毒，并將這些檢測方法與DAS（雙抗夾心）-ELISA進(jìn)行了比較，其靈敏度分別是DAS-ELISA法測定的南瓜花葉病毒（SqMV）和黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）的1000倍和10"000倍，說明qRT-PCR分析方法較DAS-ELISA靈敏度更高。然而，RNA檢測具有許多局限性，如時間久、成本高昂，且必須在專門的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。XIANG等[25]通過酶ELISA和金免疫層析測定（GICA）對血液進(jìn)行SARS-"CoV-2"IgG/IgM檢測，在候選血液指標(biāo)中，與標(biāo)準(zhǔn)的RNA檢測相比，通過ELISA檢測的血清IgG和IgM具有最佳的一致性和有效性，表明該方法可用于初步的病毒篩選，以滿足沒有RNA檢測能力的實(shí)驗(yàn)室的檢測需求，或作為RNA檢測的補(bǔ)充。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，抗體制備技術(shù)不斷完善。為了建立更好的番木瓜植株中的PRSV檢測方法，本研究以直接合成的多肽抗原制備PRSV的多克隆抗體，建立了ELISA檢測PRSV病毒的方法，無需病毒的提取制備或原核表達(dá)等繁瑣的步驟，極大地簡化了抗體制備的步驟，縮短了實(shí)驗(yàn)時間。此外，本研究以番木瓜中穩(wěn)定表達(dá)的基因Cpa03g018830為內(nèi)參基因，首次建立了番木瓜植株中PRSV含量的qRT-PCR的相對定量檢測方法，該方法無需制備PRSV的標(biāo)準(zhǔn)品及建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，適合大批量的樣品檢測。

采用以上2種方法對24株轉(zhuǎn)基因番木瓜及非轉(zhuǎn)基因番木瓜的不同生長階段的樣品進(jìn)行了PRSV病毒的檢測，并對檢測得到的PRSV的含量進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同的樣品用2種方法測定的病毒含量大部分都較為一致，少數(shù)結(jié)果不一致的可能為樣品采樣誤差導(dǎo)致。從整體變化趨勢可以看出，非轉(zhuǎn)基因番木瓜從開始感染PRSV到發(fā)病，PRSV含量持續(xù)升高，一旦病毒侵襲，則毫無抵抗能力，直至減產(chǎn)死亡。而大部分轉(zhuǎn)基因番木瓜株系則表現(xiàn)出對PRSV較好的抗性，即使初期受到病毒侵襲，PRSV含量開始上升，但隨著small"RNA的基因沉默開始發(fā)揮作用，病毒含量又開始降低。然而，部分轉(zhuǎn)基因番木瓜株系在感染PRSV后含量持續(xù)增加，可能是由于插入位點(diǎn)干擾了番木瓜代謝過程，從而影響RNAi對抗病毒的作用；或者是由于不同株系在田間自然發(fā)病時期存在差異，導(dǎo)致small"RNA尚未開始發(fā)揮抗病作用。

綜上所述，本研究建立的檢測PRSV的ELISA法與qRT-PCR法可以共同使用，提高番木瓜植株早期感染PRSV的檢出率，可為PRSV的實(shí)驗(yàn)室診斷、含量測定提供支持，提高檢測效率，減少工作量。

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