紅肉火龍果液泡轉(zhuǎn)化酶基因HpVIN1的克隆、表達(dá)和酶活性鑒定

摘""要：液泡轉(zhuǎn)化酶（vacuolar"invertase，VIN）不可逆地分解蔗糖生成葡萄糖和果糖，是可溶性糖代謝的關(guān)鍵酶，參與植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量品質(zhì)形成和抵御逆境。為探討VIN基因在紅肉火龍果（Hylocereus"polyrhizus）可溶性糖代謝中的生理功能，從果實中克隆HpVIN1基因，開展序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化、基因表達(dá)、亞細(xì)胞定位、酵母生長互補(bǔ)分析和蔗糖分解活性檢測?；赗T-PCR（reverse"transcription-polymerase"chain"reaction）擴(kuò)增獲得HpVIN1基因，其開放閱讀框（open"reading"frame，ORF）長度為1935"bp，編碼644個氨基酸。序列分析表明，HpVIN1含有轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖分解的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，且在N端含有液泡定位的相關(guān)序列。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明HpVIN1與獼猴桃、枇杷、蘋果和葡萄的VINs具有較近的親緣關(guān)系。實時熒光定量PCR檢測表明，HpVIN1在莖和果實轉(zhuǎn)色期（花后20～25"d）的表達(dá)量較高，果實成熟期（花后30"d）表達(dá)微弱。HpVIN1融合綠色熒光蛋白在擬南芥葉肉原生質(zhì)體瞬時表達(dá)表明HpVIN1定位于液泡膜和液泡。HpVIN1在蔗糖利用缺陷的酵母株系過表達(dá)，恢復(fù)酵母以蔗糖為唯一碳源的生長，證明HpVIN1具有蔗糖分解活性。酵母總蛋白的離體催化實驗表明，HpVIN1分解蔗糖產(chǎn)生葡萄糖和果糖，蔗糖分解活性在pH"4.0時最大，并隨pH的升高快速降低。研究結(jié)果表明，位于液泡內(nèi)的HpVIN1具有分解蔗糖產(chǎn)生葡萄糖和果糖的酶活性，參與紅肉火龍果莖和果實轉(zhuǎn)色期的可溶性糖代謝。

關(guān)鍵詞：火龍果；液泡轉(zhuǎn)化酶基因；蔗糖分解；亞細(xì)胞定位；酵母表達(dá)中圖分類號：S667.9""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cloning，"Expression"and"Enzyme"Activity"Identification"of"the"Vacuolar"Invertase"Gene"HpVIN1"from"Red"Pitaya

ZHENG"Qianming1，2，"YAN"Shuang1，"WANG"Honglin1，2，"XIE"Pu1，"MA"Yuhua2*

1."Guizhou"Institute"of"Pomology"Science，"Guizhou"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Guiyang，"Guizhou"550006，"China;"2."Key"Laboratory"of"Crop"Genetic"Resources"and"Germplasm"Innovation"in"Karst"Region，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs，"Guizhou"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Guiyang，"Guizhou"550006，"China

Abstract："Vacuolar"invertase"（VIN）"，"degrading"sucrose"to"produce"glucose"and"fructose"irreversibly，"is"a"key"enzyme"in"soluble"sugar"metabolism，"and"involved"in"plant"growth"and"development，"yield"and"quality"formation，"and"stress"resistance."To"investigate"the"physiological"functions"of"VIN"genes"in"soluble"sugar"metabolism"of"red"pitaya"（Hylocereus"polyrhizus），"HpVIN1"gene"was"cloned"from"the"fruit，"and"sequence"comparison，"phylogenetic"relationship，"gene"expression，"subcellular"localization，"yeast"growth"complementation"and"sucrose"degradation"activity"were"analyzed."Based"on"RT-PCR"（reverse"transcription-polymerase"chain"reaction）"amplification，"the"ORF"（open"reading"frame）"of"HpVIN1"gene"with"a"length"of"1935"bp"was"isolated，"which"encoded"644"amino"acids."Sequence"analysis"showed"that"HpVIN1"contained"key"domains"related"to"sucrose"degradation"activity"of"invertase，"as"well"as"vacuole"localization"sequences"in"the"N"terminal."Phylogenetic"analysis"suggested"that"HpVIN1"was"closely"related"to"VIN"genes"from"kiwifruit，"loquat，"apple"and"grape."Real"time"fluorescence"quantitative"PCR"detection"revealed"that"HpVIN1"was"highly"expressed"in"stems"and"fruits"during"the"veraison"stage"（20～25"days"after"flowering），"and"weakly"expressed"in"ripen"fruits"（30"days"after"flowering）."The"transient"expression"of"HpVIN1"fused"by"green"fluorescent"protein"in"Arabidopsis"thaliana"mesophyll"protoplasts"demonstrated"that"HpVIN1"protein"was"localized"in"the"tonoplast"and"vacuole."By"over-expressing"in"the"yeast"strain"with"sucrose"utilization"defects，"HpVIN1"could"restore"the"yeast"growth"using"sucrose"as"the"sole"carbon"source，"which"proved"that"HpVIN1"had"the"sucrose"degradation"activity."In"vitro"catalytic"experiment"using"the"yeast"total"protein"suggested"that"HpVIN1"could"degrade"sucrose"into"glucose"and"fructose."The"sucrose"degradation"activity"was"the"highest"at"pH"4.0，"and"rapidly"decreased"as"pH"value"increasing."The"results"show"that"HpVIN1"that"locates"in"the"vacuole，"has"the"enzyme"activity"of"degrading"sucrose"to"produce"glucose"and"fructose，"and"participates"in"sucrose"catabolism"of"stems"and"fruits"during"the"veraison"stage.

Keywords："pitaya;"vacuolar"invertase"gene;"sucrose"degradation;"subcellular"localization;"yeast"expression

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.12.004

火龍果（Hylocereus."spp）屬仙人掌科（Cacta ceae）量天尺屬（Hylocereus），近年來作為多年生果樹在我國西南和南方等省迅速發(fā)展，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益?；瘕埞仓甑娜~片退化為刺，進(jìn)行光合作用的主要源組織是肉質(zhì)化的莖。紅肉火龍果（Hylocereus"polyrhizus）果實色澤鮮艷、風(fēng)味濃郁，深受消費(fèi)者喜愛，是貴州喀斯特石漠化地區(qū)的特色經(jīng)濟(jì)作物。紅肉火龍果果實積累豐富的可溶性糖，主要包括葡萄糖、果糖和蔗糖[1]，其含量和比例是決定風(fēng)味和品質(zhì)的最關(guān)鍵指標(biāo)。研究紅肉火龍果果實可溶性糖積累的分子機(jī)制，對調(diào)控和改良果實風(fēng)味和品質(zhì)具有重要意義。

蔗糖是高等植物源組織光合作用的主要產(chǎn)物和光合產(chǎn)物在韌皮部長距離運(yùn)輸?shù)闹饕问?，運(yùn)輸?shù)礁?、花、種子或果實等庫組織的質(zhì)外體或胞質(zhì)分解，或轉(zhuǎn)運(yùn)入液泡貯藏或分解[2]。轉(zhuǎn)化酶又稱為β-呋喃果糖苷酶，屬于糖苷水解酶家族32類（glycoside"hydrolase"family"32"enzymes，GH32）或100類（GH100）[3-4]，是植物蔗糖分解酶的重要組成成員。轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖不可逆地分解為葡萄糖和果糖，可作為底物、能量或信號分子，參與植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量品質(zhì)形成和抵御逆境等[4]。根據(jù)轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖分解的適宜pH值，pH為"3.5～5.0具有最高活性的稱為酸性轉(zhuǎn)化酶（acid"invertase，AIN），pH為6.8～9.0具有最高活性的稱為中性/堿性轉(zhuǎn)化酶（alkaline/neutral"invertase，NIN）[5]。根據(jù)亞細(xì)胞定位差異，AIN可分為定位于液泡的液泡轉(zhuǎn)化酶（vacuole"invertase，VIN）和定位于細(xì)胞壁的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（cell"wall"invertase，CWIN）[4-5]。

高等植物VIN在細(xì)胞內(nèi)分解蔗糖形成濃度梯度，促進(jìn)蔗糖從源組織向庫組織的運(yùn)輸。研究表明，VIN酶活性與植物組織的生長發(fā)育，以及產(chǎn)量性狀密切關(guān)聯(lián)。擬南芥（Arabidopsis"thaliana）VIN1的酶活性正向調(diào)控根系的生物量[6]；不同生態(tài)型VIN1序列的多態(tài)性影響酶活性，進(jìn)而決定胚根長度[7]。水稻（Oryza"sativa"L.）OsVIN2和OsVIN3位于液泡，正向調(diào)節(jié)籽粒的糖代謝以及籽粒大小和粒重等重要性狀[8-10]。棉花（Gossypium"hirsutum）VIN酶活性與棉纖維生長、花器官和種子發(fā)育密切相關(guān)，GhVIN1表達(dá)水平?jīng)Q定纖維伸長速率[11]以及花藥和胚囊發(fā)育、授粉和種子發(fā)育[12]。高粱（Sorghum"bicolor）的VIN成員SbVIN1和SbVIN2與莖長、粗、節(jié)間數(shù)、鮮重和水溶性碳水化合物含量等性狀，以及粒重、粒寬等籽粒性狀顯著相關(guān)[13]。低溫和干旱等非生物逆境誘導(dǎo)VINs表達(dá)，表明其也參與植物抵御逆境脅迫。馬鈴薯（Solanum"tuberosum）StvacINV1受低溫誘導(dǎo)，參與低溫下塊莖蔗糖分解為還原糖的低溫糖化[14]，干涉表達(dá)，大幅降低還原糖含量[15]。茶樹（Camellia"sinensis"L.）CsINV5表達(dá)受低溫和糖誘導(dǎo)，過表達(dá)增強(qiáng)根系生長和耐寒性[16]；毛竹（Phyllostachys"edulis）PeVIN2受干旱誘導(dǎo)，促進(jìn)干旱脅迫下葡萄糖等己糖含量的增加[17]。

VIN酶活性是園藝作物果實等庫組織強(qiáng)度的標(biāo)志，直接決定果實產(chǎn)量和可溶性糖積累。干涉甜瓜（Cucumis"melo"L.）VIN基因MAI1表達(dá)，植株長勢變?nèi)?，果實變小且加速成熟，蔗糖含量增加[18]。枇杷[Eriobotrya"japonica"（Thunb.）"Lindl.]EjVIN在幼葉、幼果和成熟果實中表達(dá)，在成熟果實中的酶活性最高，過表達(dá)降低蔗糖含量[19]。桃（Prunus"persica）PpVIN2表達(dá)受到低溫誘導(dǎo)，分解蔗糖促進(jìn)還原糖積累[20]?；谝瑮棧≒hoenix"dactylifera）群體的代謝組與基因型關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，果實低蔗糖含量品種有3個串聯(lián)拷貝的VIN基因，高蔗糖含量品種有2個VIN基因發(fā)生缺失，表明蔗糖含量與VIN基因的拷貝數(shù)成反比關(guān)系[21]。

近年來對紅肉火龍果種質(zhì)資源評價以及品種選育的深入開展，推動了果實可溶性糖積累機(jī)制的研究。例如，對3個火龍果品種果實發(fā)育和成熟期間主要代謝物檢測表明，葡萄糖和果糖等可溶性糖含量隨果實成熟逐漸增加[1]。紅肉火龍果轉(zhuǎn)錄因子HpWRKY3具有轉(zhuǎn)錄激活活性，隨果實成熟上調(diào)表達(dá)，激活HpSuSy1等蔗糖代謝酶基因的表達(dá)[22]。基于火龍果果實轉(zhuǎn)錄組測序分離VIN等大量可溶性糖代謝相關(guān)基因，分析基因表達(dá)和酶活性的相關(guān)性，獲得與酶活性高度相關(guān)的候選VIN基因[23]?；诨蚪M序列分離火龍果VIN和CWIN共計11個成員，僅2個VIN基因在果實表達(dá)，表明其可能參與可溶性糖的積累[24]。前期對紅肉火龍果果實發(fā)育和成熟關(guān)鍵時期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得大量與可溶性糖積累相關(guān)的候選基因[25]。本研究擬對紅肉火龍果1個VIN候選基因開展基因克隆、基因表達(dá)、亞細(xì)胞定位和酶活性鑒定等分析，探討其在果實發(fā)育期間的生理功能。

1""材料與方法

1.1""材料

從貴州省鎮(zhèn)寧縣的火龍果種植園選取處于結(jié)果期的健壯成年植株，栽培品種為紅肉火龍果紫紅龍（Hylocereus"polyrhizus"cv."Zihonglong）。于2021年9月15日選取一批同時開花的植株標(biāo)記，采集成熟的莖組織，分別于2021年10月5日、8日、10日、12日和15日（即：花后20"d，F(xiàn)20；花后23"d，F(xiàn)23；花后25"d，F(xiàn)25；花后27"d，F(xiàn)27；花后30"d，F(xiàn)30）共計5個時期采集果實。每個時期采集15個果實，隨機(jī)分為3組，作為3次生物學(xué)重復(fù)。取莖和果肉分別切成薄片，在液氮中研磨并速凍，保存于–80"℃?zhèn)溆谩?/p>

擬南芥（Arabidopsis"thaliana）哥倫比亞型、大腸桿菌（Escherichia"coil）DH5α和釀酒酵母（Saccharomyces"cerevisiae）菌株SEY2102（MATα;"ura3-52;"leu2-3，112;"his4-519;"suc2-Δ9;"gal2）均為本實驗室保存。

1.2""方法

1.2.1""HpVIN1基因克隆""果實總RNA提取使用復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒（RN53，Aidlab，中國）。使用瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計（NanoPhotometer，IMPLEN，德國）分別檢測總RNA的質(zhì)量和濃度。合格的總RNA樣品使用PrimeScriptTM"1st"Strand"cDNA"Synthesis試劑盒（6110A，TaKaRa，中國）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。使用高保真DNA聚合酶（P515，Vazyme，中國）利用目標(biāo)基因特異引物（5′-ATATTCCAT C GTCGTAATTC-3′/5′-TTATGCATCACATACATTAC-"3′）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α，將陽性克隆后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2""序列分析""使用ORF"Finder（https：//www."ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線軟件預(yù)測ORF。使用ExPASy（https：//web.expasy.org/compute_pi/）在線軟件預(yù)測氨基酸序列理論等電點和相對分子量。使用HMMER（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/"hmmer/）在線軟件預(yù)測氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域。使用TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu."dk/service.php？TMHMM-2.0）在線軟件預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)。使用Clustal"W軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對，結(jié)果展示使用GENDOC軟件。使用MEGA"7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行1000次重復(fù)的Bootstrap值檢測。

1.2.3""實時熒光定量PCR檢測""使用Primer"Premier"5.0軟件設(shè)計目標(biāo)基因的特異擴(kuò)增引物（5′-CCGGATTTGGATGTGGGTATC-3′/5′-AATCCTCCTCCCTCTCTTATGG-3′），為確保擴(kuò)增的特異性，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物在火龍果基因組數(shù)據(jù)庫（http：//"pitayagenomic.com/）進(jìn)行BLASTn檢索。使用熒光定量PCR儀（CFX96，BIO-RAD，美國）進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增體系總體積為10.0"μL，包含cDNA模板0.5"μL，上/下游引物各0.2"μL，2×SYBR"Green"Fast"qPCR"Mix試劑（RK02001，Biomarker，中國）5"μL，無菌水4.1"μL。反應(yīng)程序：95"℃變性3"min；95"℃變性5"s，60"℃退火和延伸共30"s，40個循環(huán)。內(nèi)參基因校準(zhǔn)使用β-ACT（5′-"CTTCCATACCAATGAATGAGG-3′/5′-AACCGCCAAGAGTAGTTCTG-3′），每個反應(yīng)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量使用2–??Ct值計算，將花后30"d果實中的基因表達(dá)量設(shè)為“1”。

1.2.4""亞細(xì)胞定位""使用引物（5′-Acagccc aagcttgcatgcctgcagATGGCCTCCGTCA TTT-3′/5′-CCTCGCCCTTGCTCACCATGGATC C-"AGAATCAATTTTAAAAGGTC-3′）擴(kuò)增HpVIN1基因ORF序列，同時去除終止密碼子。使用回收試劑盒（9761，TaKaRa，日本）回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，16318-hGFP載體使用PstⅡ和BamH"Ⅰ（NEB，美國）酶切并回收，混合后利用單片段快速克隆試劑盒（C112，Vazyme，中國）連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α，經(jīng)測序確認(rèn)后提取質(zhì)粒。目標(biāo)質(zhì)粒HpVIN1-hGFP和空載體16318-hGFP分別與液泡膜Marker擬南芥VAMP711-RFP質(zhì)粒[26]混合。利用PEG介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)化至擬南芥葉肉原生質(zhì)體，具體步驟參考文獻(xiàn)[27]，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。

1.2.5""酵母表達(dá)載體構(gòu)建和酵母轉(zhuǎn)化""PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因的ORF序列，使用特異引物（5′-"GTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCATGGC-CTCCGTCATTTTCC-3′/5′-AATTGGGTACCGGG-CCCCCCCTCGAGTCAAGAATCAATTTTAAAA-3′）回收并純化擴(kuò)增產(chǎn)物，酵母表達(dá)載體pDR196使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ（NEB，美國）酶切后回收純化。將PCR片段插入至載體多克隆位點后測序，提取質(zhì)粒備用。酵母利用液體YPDA培養(yǎng)基（以葡萄糖為碳源）培養(yǎng)至對數(shù)期，使用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（SK2400，酷來搏，中國）分別轉(zhuǎn)化HpVIN1-pDR196和載體pDR196，涂布在SC/-ura固體篩選培養(yǎng)基（葡萄糖為碳源）上，30"℃倒置培養(yǎng)48"h，挑選單克隆振蕩培養(yǎng)并進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.2.6""酵母生長互補(bǔ)檢測""分別選取含有HpVIN1-"pDR196和pDR196的酵母單克隆，接種于液體SC/-ura培養(yǎng)基（以葡萄糖為碳源），30"℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600=0.6～1.0）。離心收集酵母細(xì)胞，使用無菌水重懸，離心去上清，重復(fù)1次，并以無菌水調(diào)節(jié)OD600值至1.0。使用無菌水10倍梯度依次稀釋，將OD600值分別調(diào)節(jié)至10–1、10–2和10–3。分別取1.0"μL上述酵母液，接種于SC/-ura固體培養(yǎng)基（葡萄糖或蔗糖為碳源），30"℃倒置培養(yǎng)，定期觀察并拍照。目的基因或載體對照均選取至少4個獨立的單克隆，選取代表性的單克隆菌落拍照。同時收集上述對數(shù)期的酵母細(xì)胞2"mL，使用無菌水清洗2次，使用25"mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH"5.0）450"μL重懸，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的蔗糖溶液50"μL，30"℃振蕩培養(yǎng)12"h，離心取上清200"μL，加入二硝基水楊酸（3，5-"Dinitro-2-hydroxybenzoic"acid，DNS）150"μL，80"℃水浴5nbsp;min，冷卻后利用酶標(biāo)儀（Multiskan"GO，Thermo"Fisher，美國）檢測540"nm下的吸光值。

1.2.7""重組蛋白提取和酶活性檢測""收集上述培養(yǎng)至對數(shù)期的酵母細(xì)胞，使用25"mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH"5.0）清洗2次。利用鋼珠渦流破碎酵母細(xì)胞，采用Bradford法測定試劑盒（PC0010，Solarbio，中國）檢測酵母總蛋白濃度。利用高效液相色譜（high"performance"liquid"chromatography，HPLC）檢測，反應(yīng)體系總體積為200"μL，蔗糖終濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，20"μL酵母總蛋白溶液（約1.0"μg總蛋白）。37"℃水浴12"h，80"℃水浴5"min終止，離心取上清。利用HPLC（Agilent-"1200，美國）檢測反應(yīng)產(chǎn)物，色譜柱為糖分析柱（Zorbax"Carbohydrate，Agilent，美國）。檢測條件：柱溫40"℃，流動相70%乙腈，檢測器為示差折光檢測器，溫度35"℃。分別以葡萄糖、果糖和蔗糖為標(biāo)準(zhǔn)品確定保留時間和鑒定產(chǎn)物類別。分別使用不同pH（3.0～8.0）的磷酸鹽緩沖液檢測不同pH值下HpVIN1重組蛋白的酶活性。反應(yīng)總體積500"μL，蔗糖終濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，酵母總蛋白為1.0"μg。37"℃水浴1"h，80"℃水浴5"min終止，離心取上清，使用DNS法檢測葡萄糖含量。

1.3""數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft"Excel"2007軟件作圖，利用SPSS軟件采用Duncan’s法對不同樣本之間的差異進(jìn)行顯著性分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""HpVIN1基因克隆和序列分析

以紅肉火龍果果實cDNA為模板，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的VIN相關(guān)轉(zhuǎn)錄本，RT-PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物長度約2"kb。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過回收、克隆和測序，獲得目的片段的ORF長度為1935"bp，命名為HpVIN1。HpVIN1編碼644個氨基酸殘基，預(yù)測相對分子量為71.12"kDa，理論等電點為5.82。

序列比對表明（圖1），HpVIN1的氨基酸序列與擬南芥AtvacINV1類似，含有復(fù)雜的N端前體肽（N-terminal"propeptide，NTPP）區(qū)域，包含酸性的二亮氨酸（Di-leucine）區(qū)域、基礎(chǔ)區(qū)域（basic"region，BR）和跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane"domain，TMD）。保守結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，HpVIN1的氨基酸序列含有β-呋喃果糖苷酶的N末端結(jié)構(gòu)域（INV_N，PF11837.11），位于14～115"aa；GH32家族的N端結(jié)構(gòu)域Glyco_hydro_32N（GH32N，PF00251.23），位于123～440"aa；GH32家族的C端結(jié)構(gòu)域Glyco_hydro_32C（GH32C，PF08244.15），位于443～631"aa。進(jìn)一步比對，查找轉(zhuǎn)化酶活性直接相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，HpVIN1含有典型的β-呋喃果糖苷酶結(jié)構(gòu)域NDPDG、催化結(jié)構(gòu)域WECVD以及RDP結(jié)構(gòu)域。

將HpVIN1與擬南芥、毛果楊（Populus"trich ocarpa）、水稻、葡萄（Vitis"vinifera）、枇杷、蘋果（Malus"domestica）和獼猴桃（Actinidia"chinensis）等的VINs，以及擬南芥AtcwINVs進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。HpVIN1與上述物種的VINs聚為一類，與擬南芥CWINs明顯分開。同時，VINs明顯分為2組，HpVIN1與獼猴桃AcVIN、枇杷EjVIN、蘋果MdVIN和葡萄VvVIN聚為一組，與擬南芥和水稻的VINs明顯分開。

2.2""HpVIN1基因的表達(dá)分析

實時熒光定量PCR檢測HpVIN1基因在紅肉火龍果的莖（源組織）和果實（庫組織）的表達(dá)模式（圖3）發(fā)現(xiàn)，相比花后20"d的果實，HpVIN1的表達(dá)量在23"d明顯升高且達(dá)到最大值。此后不同小寫字母表示差異顯著（Plt;0.05）。Different"lowercase"letters"indicate"significant"difference"（Plt;0.05）.

HpVIN1的表達(dá)量隨果實發(fā)育明顯下降，在花后27"d和30"d果實中的表達(dá)量微弱。HpVIN1在莖中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于花后27"d和30"d果實，約為花后23"d果實的0.3倍。因此，HpVIN1主要在莖和花后20～25"d的果實表達(dá)，隨果實發(fā)育迅速下降，果實成熟時（30"d）的表達(dá)極其微弱。

2.3""HpVIN1蛋白的亞細(xì)胞定位

將GFP對照、融合表達(dá)載體HpVIN1-GFP分別與液泡膜Marker基因融合表達(dá)載體AtVAMP711-"RFP在擬南芥葉肉原生質(zhì)體共表達(dá)，顯微觀察結(jié)果如圖4所示。未融合HpVIN1的GFP綠色熒光廣泛分布于胞質(zhì)，與AtVAMP711的RFP紅色熒光僅在液泡膜有重疊。融合HpVIN1的GFP綠色熒光主要在細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)狀，與AtVAMP711的RFP紅色熒光標(biāo)識的液泡膜完全重疊，產(chǎn)生明顯的黃色熒光。同時，液泡內(nèi)存在若干集中分布形成的點狀，以及大范圍彌散分布的綠色熒光。因

此，亞細(xì)胞定位結(jié)果證明HpVIN1蛋白定位于液泡膜和液泡內(nèi)。

2.4""HpVIN1互補(bǔ)酵母生長檢測

HpVIN1在蔗糖利用缺陷的酵母株系SEY2102中表達(dá)，觀察酵母以蔗糖或葡萄糖為唯一碳源的生長情況（圖5）。以葡萄糖為唯一碳源，表達(dá)載體對照pDR196或HpVIN1的酵母均能正常生長。以蔗糖為唯一碳源，表達(dá)pDR196的酵母生長微弱，表達(dá)HpVIN1的酵母生長明顯。進(jìn)一步利用酵母活體細(xì)胞在含有蔗糖的緩沖液中孵育，取上清液利用DNS顯色檢測是否生成葡萄糖。表達(dá)HpVIN1的上清液與葡萄糖溶液類似，反應(yīng)后呈現(xiàn)棕紅色，載體對照無顏色變化（結(jié)果未展示）。表達(dá)HpVIN1的上清液A540值顯著高于載體對照（圖6）。因此，HpVIN1在酵母蔗糖利用缺陷株系SEY2102表達(dá)，可介導(dǎo)細(xì)胞外蔗糖分解為葡萄糖等單糖，恢復(fù)酵母的生長。

2.5""HpVIN1重組蛋白酶活性檢測

以表達(dá)HpVIN1的酵母總蛋白孵育蔗糖，利用HPLC檢測反應(yīng)產(chǎn)物。使用載體對照pDR196的酵母總蛋白孵育，僅檢測到蔗糖，未檢測到葡萄糖和果糖。使用HpVIN1重組蛋白孵育后蔗糖含量明顯降低，且生成葡萄糖和果糖（圖7）。在pH"3.0～8.0范圍內(nèi)，HpVIN1重組蛋白的蔗糖分解活性在pH"4.0最高（圖8）。蔗糖分解活性隨緩沖液pH的增加快速下降，在pH≥7.0時的酶活性極低。

3""討論

植物細(xì)胞的成熟液泡是多功能細(xì)胞器，在植物生長發(fā)育、果實品質(zhì)形成和抵御逆境脅迫中具有重要作用[28]。成熟液泡占據(jù)植物細(xì)胞體積的90%以上，是可溶性糖和有機(jī)酸等重要代謝物的主要貯藏場所，在園藝作物果實的風(fēng)味形成過程中起重要作用[29]。VIN介導(dǎo)液泡蔗糖分解為葡萄糖和果糖，對果實可溶性糖積累有決定性的作用[18-21]。本研究對紅肉火龍果HpVIN1基因開展基因表達(dá)、亞細(xì)胞定位和酶活性鑒定分析，探討其在果實發(fā)育期間可溶性糖積累過程中的生理功能。

HpVIN1含有保守的INV_N、GH32N和GH32C結(jié)構(gòu)域，與獼猴桃、枇杷、蘋果和葡萄的VINs聚為一組，說明HpVIN1是屬于GH32家族的VIN成員。VIN的亞細(xì)胞定位決定其生理功能，目前僅報道了擬南芥和水稻若干成員的亞細(xì)胞定位[9，"30]。擬南芥AtVI2（即AtvacINV2）通過“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-液泡”途徑定位于液泡，首先由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的囊泡攜帶并插入到液泡膜，然后由液泡蛋白酶介導(dǎo)完成N末端加工，最后釋放成熟的AtVI2至液泡[30]。AtVI2的N端含有復(fù)雜的NTPP區(qū)域，包含Di-leucine、BR和TMD結(jié)構(gòu)域，決定蛋白正確定位至液泡。序列比對表明，HpVIN1蛋白含有上述Di-leucine、BR和TMD結(jié)構(gòu)域，推測其與擬南芥AtVI2和水稻OsVIN2類似[9，"30]，具有液泡定位的特性。在擬南芥葉肉原生質(zhì)體瞬時表達(dá)的HpVIN1蛋白大部分定位于液泡膜，推測是擬南芥液泡蛋白酶對HpVIN1蛋白的N末端加工不徹底導(dǎo)致其聚集在液泡膜。盡管僅有少量熒光信號分布于液泡內(nèi)，仍證明HpVIN1蛋白定位于液泡內(nèi)。

研究報道表明，NDPDG、RDP和WECVD結(jié)構(gòu)域在VIN家族高度保守，NDPDG和RDP上的天冬氨酸殘基（aspartate，D）、WECVD的谷氨酸殘基（glutamate，E）和半胱氨酸殘基（cysteine，C）是催化蔗糖分解的關(guān)鍵位點[31-32]。序列比對表明HpVIN1含有上述結(jié)構(gòu)域且關(guān)鍵氨基酸殘基保持一致，推測其可能具有蔗糖分解活性，需進(jìn)一步驗證其酶活性。釀酒酵母內(nèi)源轉(zhuǎn)化酶缺陷株系SEY2102或SEY6210是普遍使用的表達(dá)宿主，可通過酵母生長互補(bǔ)或提取總蛋白離體催化驗證候選VIN的蔗糖分解活性。如，辣椒（Capsicum"annuum"L.）CaVINV1和甘薯[Ipomoea"batatas"（L.）"Lam.]"Ibβfruct2均能互補(bǔ)酵母SEY2102或SEY6210株系以蔗糖為唯一碳源的生長[33-34]。進(jìn)一步提取總蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，CaVINV1催化蔗糖分解的最適宜pH為4.5[33]。HpVIN1互補(bǔ)酵母SEY2102株系以蔗糖為唯一碳源生長，經(jīng)酵母細(xì)胞孵育后檢測到葡萄糖等還原糖的生成。進(jìn)一步利用酵母總蛋白離體孵育蔗糖和HPLC檢測，證明HpVIN1具有將蔗糖分解為葡萄糖和果糖的酶活性。HpVIN1的蔗糖分解活性在pH"4.0時最高，在pH≥7.0時的酶活性極低，與VINs的特性一致[13，"33]。因此，HpVIN1是典型的酸性轉(zhuǎn)化酶，具有分解蔗糖生成葡萄糖和果糖的酶活性。

植物VIN基因家族成員的規(guī)模較小，成員間的表達(dá)模式存在較大差異。如辣椒和馬鈴薯VIN家族均含有2個成員，辣椒CaVINV1和馬鈴薯StVINV在根、莖、葉、芽、花和果實等組織均表達(dá)，CaVINV1表達(dá)隨果實發(fā)育和成熟顯著增加；CaVINV2和StINV1僅在花芽、花和果實發(fā)育早期表達(dá)[33，"35]。枳（Poncirus"trifoliata）VIN家族也含有2個成員，PtrVINV1在根、莖、葉、花和果實中均有較高的表達(dá)，PtrVINV2表達(dá)微弱[36]。砂梨VIN家族均有8個成員，PbrvacInv1和PbrvacInv4在果實發(fā)育早期表達(dá)，PbrvacInv6和PbrvacInv8在果實成熟前表達(dá)，在果實中瞬時過表達(dá)PbrvacInv1改變可溶性糖構(gòu)成和含量[37]。因此，植物VIN家族不同成員間的功能發(fā)生分化，其差異表達(dá)模式表明它們在不同的組織或發(fā)育時期發(fā)揮作用。目前分離的火龍果VIN基因家族可能含有3～4個成員，其不同成員也表現(xiàn)出差異表達(dá)模式。如受HpWRKY3轉(zhuǎn)錄激活的VIN基因HpINV2，其表達(dá)隨果實可溶性糖積累逐漸上調(diào)[22]，說明與HpVIN1為不同的基因?；诠麑嵽D(zhuǎn)錄組測序獲得的HpVAI1～3，其中HpVAI1隨果實可溶性糖積累上調(diào)表達(dá)，HpVAI2和HpVAI3均在可溶性糖未明顯積累時表達(dá)，在果實成熟時表達(dá)微弱[23]?；谌蚪M分離火龍果VIN基因家族，其中2個成員在果實不表達(dá)，僅HuAI07在花后23"d的果實表達(dá)，果實成熟時未檢測到[24]。序列比對結(jié)果表明HuAI7、HpVAI3和HpVIN1為同一基因，均在果實轉(zhuǎn)色期（約花后20～25"d）大量表達(dá)。葡萄糖和果糖在紅肉火龍果的果實轉(zhuǎn)色期少量積累，此后隨果實發(fā)育和成熟快速積累，蔗糖含量較低且未發(fā)生明顯變化[1]。HpVIN1表達(dá)隨果實葡萄糖和果糖的快速積累而逐漸降低，而HpVAI1和（或）HpINV2的表達(dá)呈現(xiàn)顯著增加的趨勢[22-23]。因此推測，HpVIN1和HpVAI1分別在紅肉火龍果果實的不同發(fā)育時期發(fā)揮作用。在果實轉(zhuǎn)色期，HpVIN1的大量表達(dá)促進(jìn)蔗糖分解產(chǎn)生葡萄糖和果糖并輸出液泡，可能參與轉(zhuǎn)色期的甜菜苷色素和黃酮類等代謝[1]；隨著果實的成熟，HpINV2的上調(diào)表達(dá)促進(jìn)葡萄糖和果糖的快速積累[22]。下一步需要分析HpVIN1在紅肉火龍果果實不同部位的表達(dá)模式，并通過過表達(dá)或干涉表達(dá)闡明其在果實發(fā)育和成熟中的作用，深入探討HpVIN1的生理功能。

本研究分離紅肉火龍果VIN基因HpVIN1，其蛋白定位于液泡，具有分解蔗糖產(chǎn)生葡萄糖和果糖的酶活性。HpVIN1主要在莖和花后20～25"d的果實中表達(dá)，參與莖和果實轉(zhuǎn)色期的可溶性糖代謝。

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