人參皂苷Rg1在IL-6誘導的大鼠神經(jīng)元鐵死亡中的作用

摘要：目的 探究人參皂苷Rg1（G-Rg1）通過調(diào)節(jié)Janus激活激酶（JAK）/信號傳導及轉錄激活因子3（STAT3）信號通路對白細胞介素-6（IL-6）誘導的大鼠神經(jīng)元損傷的保護作用和機制。方法 大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)后，分為對照組（正常培養(yǎng)）、IL-6模型組（采用50 μg/L IL-6處理大鼠海馬神經(jīng)元18 h模擬腦內(nèi)炎性環(huán)境）、G-Rg1低（10 μmol/L）劑量組、G-Rg1高（40 μmol/L）劑量組。培養(yǎng)48 h后，MTT法測定海馬神經(jīng)元存活率；分光光度法檢測神經(jīng)元總鐵載量，并檢測鐵死亡標志物谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）水平；qRT-PCR法檢測海馬神經(jīng)元中膜鐵轉運蛋白1（FPN1）mRNA表達水平；蛋白免疫印跡法檢測神經(jīng)元JAK/STAT3信號通路相關蛋白表達。結果 與對照組比較，IL-6模型組神經(jīng)元存活率、GSH含量、GPX4含量、FPN1 mRNA表達水平均降低，總鐵載量、p-JAK和p-STAT3蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與IL-6模型組比較，G-Rg1低、高劑量組神經(jīng)元存活率、GSH含量、GPX4含量、FPN1 mRNA表達水平均升高，總鐵載量、p-JAK和p-STAT3蛋白表達水平降低（P＜0.05），且G-Rg1高劑量組上述各指標變化較G-Rg1低劑量組顯著（P＜0.05）。結論 G-Rg1緩解大鼠海馬神經(jīng)元鐵死亡的作用機制可能與抑制IL-6/JAK/STAT3信號通路、上調(diào)FPN1表達、防止鐵超載相關。

關鍵詞：人參皂苷Rg1；神經(jīng)元；鐵死亡；白細胞介素6

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20231989

Study on the role of ginsenoside Rg1 in IL-6-induced neuronal ferroptosis in rats

HUANG Xiaolei， GE Tingting， ZHAO Junsong， NI Zhihua△

Department of Radiology， Baoshan Hospital of Traditional Chinese Medicine and Western Medicine， Shanghai 201900， China

△Corresponding Author E-mail： 19713115@qq.com

Abstract： Objective To investigate the protective effect and mechanism of ginsenoside Rg1 （G-Rg1） on interleukin-6 （IL-6）-induced neuronal injury in rats by regulating Janus activated kinase （JAK）/signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） signaling pathway. Methods After culture， rat hippocampal neurons were divided into the control group （normal culture）， the IL-6 model group （50 μg/L IL-6 was used to treat rat hippocampal neurons for 18 h to simulate the inflammatory environment in brain）， the G-Rg1 low dose （10 μmol/L） group and the G-Rg1 high dose （40 μmol/L） group. After 48 h of normal culture， the survival rate of hippocampal neurons was determined by MTT method. The total iron load of neurons was detected by spectrophotometry， and levels of ferroptosis markers glutathione （GSH） and glutathione peroxidase 4 （GPX4） were detected. The mRNA expression level of ferroportin 1 （FPN1） in hippocampal neurons was detected by qRT-PCR. The expression of proteins related to the neuronal JAK/STAT3 signaling pathway was detected by Western blot assay.Results Compared with the CON group， the neuronal survival rate， GSH content， GPX4 content and FPN1 mRNA expression level were decreased in the IL-6 model group， and the total iron load， p-JAK and p-STAT3 protein expression levels were increased （P＜0.05）. Compared with the IL-6 model group， the neuronal survival rate， GSH content， GPX4 content and FPN1 mRNA expression level were increased in the low-dose and high-dose G-Rg1 groups， and the total iron load， p-JAK and p-STAT3 protein expression levels were decreased （P＜0.05）. Changes of the above indicators were more significant in the high-dose G-Rg1 group than those in the low-dose G-Rg1 group （P＜0.05）. Conclusion The mechanism of G-Rg1 alleviating ferroptosis of hippocampal neurons in rats may be related to the inhibition of IL-6/JAK/STAT3 signaling pathway， up-regulation of FPN1 expression， and prevention of iron overload.

Key words： ginsenoside Rg1; neurons; ferroptosis; interleukin-6

卒中是世界范圍內(nèi)致死致殘的主要原因之一［1］。神經(jīng)元損傷且不可再生是中風后多種并發(fā)癥發(fā)生的重要因素［2］。腦組織中神經(jīng)元具有耗氧量高、抗氧化能力差、不飽和脂肪酸含量高的特點，使其極易受鐵死亡影響。因此，可通過調(diào)節(jié)鐵死亡相關重要因子抑制細胞死亡來有效保護神經(jīng)元，從而降低卒中后并發(fā)癥的發(fā)生率［3］。有研究顯示，腦梗死發(fā)生后血清及腦組織中白細胞介素-6（IL-6）水平明顯升高，IL-6/Janus激活激酶（JAK）/信號傳導及轉錄激活因子3（STAT3）信號通路是影響鐵代謝的關鍵信號通路，靶向該信號通路改善鐵代謝可能是抑制神經(jīng)元鐵死亡的潛在靶點［4］。人參在改善心腦血管疾病和神經(jīng)機能方面效果良好，應用廣泛。人參皂苷Rg1（G-Rg1）是人參的重要成分之一，其對腦梗死的藥理作用和改善微環(huán)境的機制主要涉及抗氧化抑制細胞凋亡、改善能量代謝和氨基酸代謝、抗炎作用等，是一種潛在的保護神經(jīng)元的中藥活性物質(zhì)［5］。有研究顯示G-Rg1對IL-6具有顯著下調(diào)作用［6］。G-Rg1是否通過調(diào)節(jié)IL-6介導的JAK-STAT3信號通路影響大鼠海馬神經(jīng)元鐵死亡目前尚未明確。本研究旨在探討G-Rg1對大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠海馬神經(jīng)元購自上海賓穗生物科技有限公司。谷胱甘肽（GSH）含量檢測試劑盒、組織鐵含量檢測試劑盒購自Sigma-Aldrich公司；谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）比色法測試盒購自Elabscience公司；膜鐵轉運蛋白1（FPN1）兔多克隆抗體購自英國Abcam公司；G-Rg1購自上海鈺博生物科技有限公司；MTT檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；所用引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自上海力申科學儀器有限公司；多功能酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 將大鼠海馬神經(jīng)元細胞凍存管從液氮中取出立即放入36～37 ℃水浴復蘇，然后將其放在含10%胎牛血清DME/F12培養(yǎng)基中于37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)4 h后，再換成神經(jīng)元專用無血清培養(yǎng)基（含2%的B27）持續(xù)培養(yǎng)［7］。大鼠海馬神經(jīng)元經(jīng)過消化傳代后，以5×103個/孔接種至96孔培養(yǎng)板，分為對照組、IL-6模型組、G-Rg1低劑量組（10 μmol/L）和G-Rg1高劑量組（40 μmol/L）。除對照組正常培養(yǎng)外，其余組采用50 μg/L的IL-6處理大鼠海馬神經(jīng)元18 h模擬腦內(nèi)炎性環(huán)境；之后IL-6模型組更換為完全培養(yǎng)基，G-Rg1低、高劑量組更換為含10、40 μmol/L G-Rg1的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。

1.2.2 MTT法測定海馬神經(jīng)元存活率 將大鼠海馬神經(jīng)元以5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL培養(yǎng)基。各組細胞處理完成后，每孔加入10 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h后棄去MTT溶液，加入二甲基亞砜，使用多功能酶標儀在490 nm波長處檢測各孔光密度（OD）值。細胞存活率（%）=（OD實驗孔-OD空白孔）/（OD對照孔-OD空白孔）×100%，每組隨機讀取3個OD值，取平均值。

1.2.3 分光光度法檢測海馬神經(jīng)元總鐵載量 將細胞接種于20 mm共聚焦培養(yǎng)皿中，對照組、IL-6模型組按照1.2.1實驗分組進行加藥，去除上層細胞培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液洗滌3次，采用組織鐵含量檢測試劑盒，按照說明書配制液體后混勻，置于沸水浴5 min，自來水冷卻，充分震蕩混勻后室溫10 000 r/min離心10 min，吸收上層無機相200 μL置于96孔板中，酶標儀于520 nm波長下測定OD值。每組隨機讀取3個OD值，取平均值。

1.2.4 海馬神經(jīng)元鐵死亡指標GSH、GPX4水平檢測 （1）GSH。采用GSH含量檢測試劑盒進行檢測，按照1.2.1分組進行加藥，取1×106個神經(jīng)元，加入1 mL試劑后超聲提取，8 000×g離心10 min，酶標儀檢測96孔板樣本412 nm波長處OD值。（2）GPX4。采用GPX4比色法測試盒進行檢測，按照1.2.1分組進行加藥，取2×106個神經(jīng)元，加入91 μL生理鹽水和9 μL穩(wěn)定劑，4 ℃、10 000×g離心10 min，酶標儀檢測96孔板樣本340 nm波長處OD值。每組隨機讀取3個OD值，取平均值。

1.2.5 qRT-PCR法檢測海馬神經(jīng)元FPN1 mRNA表達 按照1.2.1分組進行處理，TRIzol法提取各組海馬神經(jīng)元總RNA，使用SYBR One-Step qRT-PCR試劑盒進行qRT-PCR反應，引物序列見表1。反應體系（20 μL）：2×StarScript Ⅱ Green One Step qRT-PCR Buffer 10 μL，StarScript Ⅱ One Step Enzyme Mix 2.0 μL，ROX Reference Dy 0.4 μL，RNA模板2.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 4.8 μL。反應條件：50 ℃反轉錄10 min，94 ℃預變性2 min；94 ℃變性15 s，57 ℃退火15 s，70 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。根據(jù)實時熒光定量擴增曲線測定目的基因和內(nèi)參基因Ct值，以β-actin為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計算目的基因表達水平，實驗重復3次。

1.2.6 蛋白免疫印跡法檢測JAK/STAT3信號通路相關蛋白表達 使用RIPA裂解液提取總蛋白，然后BCA進行蛋白定量。將適量蛋白在凝膠上進行電泳，而后轉移到PVDF膜上，室溫封閉1 h后TBST洗滌，加入兔抗JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3一抗（稀釋比1∶1 000）4 ℃孵育過夜，隨后將與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫下孵育2 h，用發(fā)光液顯影。用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白質(zhì)條帶灰度，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差[（[x] ±s）]表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 G-Rg1對IL-6處理神經(jīng)元存活率、總鐵載量及鐵死亡相關基因水平的影響 與對照組比較，IL-6模型組神經(jīng)元存活率、GSH含量、GPX4含量、FPN1 mRNA表達水平均降低，總鐵載量升高（P＜0.05）；與IL-6模型組比較，G-Rg1低劑量組和G-Rg1高劑量組神經(jīng)元存活率、GSH含量、GPX4含量、FPN1 mRNA表達水平均升高，總鐵載量降低（P＜0.05）；且G-Rg1高劑量組上述各指標變化較G-Rg1低劑量組顯著（P＜0.05），見表2。

2.2 G-Rg1對IL-6處理神經(jīng)元鐵死亡相關蛋白表達的影響 與對照組比較，IL-6模型組p-JAK、p-STAT3蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與IL-6模型組比較，G-Rg1低、高劑量組p-JAK、p-STAT3蛋白表達水平降低，且G-Rg1高劑量組p-JAK、p-STAT3蛋白表達水平更低（P＜0.05），見圖1、表3。

3 討論

鐵死亡廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，是一種鐵依賴性細胞死亡，其特征是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和致死性活性氧（ROS）的細胞積累，最終導致氧化應激和細胞死亡［8］。近年來，以鐵死亡相關重要因子作為研究靶點進行治療效果顯著，為臨床前研究帶來了新思路［9］。腦梗死后的缺血缺氧狀態(tài)導致腦細胞大量死亡，進而釋放大量炎性介質(zhì)，隨后激活小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞及巨噬細胞等；病理環(huán)境下，活化的小膠質(zhì)細胞過量表達脂多糖介導生成的IL-6［10］，IL-6可能參與血清鐵蛋白表達水平升高，進而引發(fā)細胞鐵死亡。IL-6/JAK/STAT3信號通路是影響鐵調(diào)素表達、調(diào)控鐵代謝的關鍵信號通路，促炎細胞因子IL-6是通過激活JAK/STAT3通路來調(diào)節(jié)鐵調(diào)素（HAMP） mRNA表達的最強正調(diào)節(jié)因子之一［11］。本研究采用50 μg/L IL-6誘導大鼠海馬神經(jīng)元損傷模擬腦內(nèi)炎性環(huán)境，進一步補充G-Rg1干預IL-6誘導的大鼠海馬神經(jīng)元損傷，探討G-Rg1對IL-6誘導大鼠海馬神經(jīng)元鐵死亡的保護作用。

GSH和GPX4均是反映鐵死亡水平的重要生物標志物［12］。GPX4是鐵死亡的核心負調(diào)控蛋白，其失活將引發(fā)脂質(zhì)過氧化物積累，對防止神經(jīng)元鐵死亡至關重要。GSH作為GPX4的輔助因子發(fā)揮對鐵死亡的保護作用。GPX4利用GSH來減少過氧化物的產(chǎn)生。本研究結果顯示，與對照組比較，IL-6模型組細胞存活率降低，JAK、STAT3磷酸化水平升高，細胞總鐵載量升高，海馬神經(jīng)元鐵死亡重要指標GSH、GPX4水平降低，提示高水平IL-6模擬的腦內(nèi)炎性環(huán)境下神經(jīng)元抗氧化能力下降、脂質(zhì)過氧化水平增高，出現(xiàn)鐵死亡現(xiàn)象。

G-Rg1是人參的主要藥理活性成分，能夠改善腦梗死大鼠的神經(jīng)損傷及血腦屏障通透性等，其機制可能與抑制氧化應激和神經(jīng)炎癥觸發(fā)的細胞凋亡相關［13］。G-Rg1對IL-6有明顯下調(diào)作用，本研究結果顯示，與IL-6模型組比較，G-Rg1低、高劑量組細胞存活率升高，JAK、STAT3磷酸化水平降低，細胞總鐵載量減低，海馬神經(jīng)元鐵死亡重要指標GSH、GPX4水平升高，提示G-Rg1能夠緩解IL-6引起的腦內(nèi)炎性環(huán)境下的氧化應激反應，緩解神經(jīng)元鐵死亡趨勢。Xu等［14］研究發(fā)現(xiàn)，G-Rg1可能通過抑制ROS-核因子（NF）-κB通路減弱二價金屬離子轉運蛋白1人需肌醇酶陰性型（DMT1-ⅠRE）上調(diào)來保護1-甲基-4苯基吡啶離子處理的MES23.5細胞，DMT1-ⅠRE表達下調(diào)抑制了鐵內(nèi)流和鐵誘導的氧化應激。另外，胡凱超等［15］研究顯示，G-Rg1可促進氧糖剝奪/復氧細胞模型GPX4、胱氨酸/谷氨酸反向轉運系統(tǒng)（xCT）和核因子-紅系2相關因子2（Nrf2）蛋白的表達，通過促進Nrf2/xCT/GPX4通路抑制缺血性腦卒中神經(jīng)元鐵死亡。以上研究提示IL-6介導的JAK/STAT3信號通路可能是G-Rg1抑制神經(jīng)元鐵死亡的潛在作用靶點。

FPN1是近年來新發(fā)現(xiàn)的維持鐵穩(wěn)態(tài)的蛋白，在腦鐵代謝中具有重要的生理作用。FPN1是已知的細胞膜上唯一鐵輸出蛋白，是鐵調(diào)素的“閥門”，鐵調(diào)素與FPN1結合使細胞膜上的FPN1內(nèi)吞和降解，抑制神經(jīng)元內(nèi)鐵輸出，引起鐵超載，誘發(fā)鐵死亡，加重腦損傷［16］。本研究結果顯示，與對照組比較，IL-6模型組FPN1 mRNA表達水平明顯降低，而G-Rg1低、高劑量組可顯著上調(diào)FPN1 mRNA表達水平，提示G-Rg1可能通過抑制IL-6/JAK/STAT3信號通路，進而上調(diào)FPN1表達，防止鐵超載，降低GSH、GPX4的表達，抑制鐵死亡，從而發(fā)揮神經(jīng)元保護作用，為明確G-Rg1的作用機制提供了新視角。

綜上所述，G-Rg1緩解大鼠海馬神經(jīng)元鐵死亡的作用機制可能與抑制IL-6/JAK/STAT3信號通路、改善神經(jīng)元鐵死亡相關。本研究為G-Rg1臨床用于腦梗死預后的神經(jīng)元保護提了供理論支持，同時為鐵死亡相關神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治提供了新靶點和新策略。但本研究僅是對G-Rg1抑制IL-6損傷海馬神經(jīng)元鐵死亡后可能的JAK/STAT3信號通路及FPN1蛋白進行了檢測，關于阻斷該信號通路后G-Rg1是否仍能發(fā)揮抑制鐵死亡的作用尚需研究驗證。

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（2024-01-02收稿 2024-05-24修回）

（本文編輯 陳麗潔）