歐前胡素衍生物對COPD肺泡Ⅱ型細胞活性及耐藥蛋白的影響

摘要：目的 探究歐前胡素衍生物（IMP-1）對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）肺泡Ⅱ（ATⅡ）型細胞活性及耐藥蛋白的影響。方法 ATⅡ型細胞分為空白組（常規(guī)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的生長良好的ATⅡ型細胞）、香煙煙霧提取物（CSE）組（加入2%CSE誘導培養(yǎng)）、IMP-1組（采用10 μmol/L的IMP-1干預經(jīng)CSE誘導的ATⅡ型細胞）。采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定ATⅡ型細胞24 h、48 h、72 h增殖率，Hoechst 33342染色法檢測ATⅡ型細胞凋亡率，流式細胞分析儀分析各周期細胞占比，軟瓊脂克隆形成實驗檢測ATⅡ型細胞克隆數(shù)量，Western blot法檢測多耐藥基因1（MDR1）及多藥耐藥相關蛋白1（MRP1）蛋白表達水平。結果 與空白組比較，CSE組細胞凋亡率、ATⅡ型細胞周期G0/G1期占比升高，在24 h、48 h、72 h細胞的增殖率和S、G2/M期占比降低（P＜0.05）；與CSE組比較，IMP-1組細胞增殖率和S、G2/M期占比及細胞克隆數(shù)量升高，ATⅡ型細胞周期G0/G1期占比和MDR1、MRP1蛋白降低（P＜0.05）。結論 IMP-1可能通過下調CSE誘導的ATⅡ型細胞的MDR1、MRP1蛋白表達，從而抑制細胞的異?；罨?，增加其凋亡。

關鍵詞：肺疾病，慢性阻塞性；歐前胡素衍生物；肺泡Ⅱ型上皮細胞；香煙煙霧提取物；多耐藥基因1；多藥耐藥相關蛋白1

中圖分類號：R563.9 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240581

Effects of imperatorin derivatives on the activity and drug resistance protein of alveolar type Ⅱ epithelial cells in COPD

YU Zhihong1， WANG Xiaoqin2

1 Department of Respiration， 2 Department of Geriatrics， Urumqi Fifth People's Hospital， Urumqi 830013， China

Abstract： Objective To explore effects of a derivative of imperatorin （IMP-1） on the activity and resistance proteins of alveolar type Ⅱ （ATⅡ） cells in chronic obstructive pulmonary disease （COPD）. Methods AT Ⅱ cells were divided into the blank group （well growing AT Ⅱ cells cultured in conventional medium）， the cigarette smoke extract （CSE） group （induced culture with 2% CSE added） and the IMP-1 group （intervention with 10 μ mol/L of IMP-1 on CSE induced AT Ⅱ cells）. Proliferation rates of AT Ⅱ cells at 24， 48 and 72 hours were measured using MTT method. Apoptosis of ATⅡ cells was detected by Hoechst 33342 staining. The proportion of cells in each cycle was analyzed by flow cytometry. The number of ATⅡ cell clones was detected by soft AGAR clone formation assay. Multidrug resistance gene 1（MDR1） and multidrug resistance associated protein 1 （MRP1） were detected by Western blot assay. Results Compared with the blank group， the apoptosis rate and the proportion of G0/G1 phase of ATⅡ cell cycle were increased in the CSE group， and the proliferation rate and the proportion of S， G2/M phase were decreased at 24 h， 48 h and 72 h （P＜0.05）. Compared with the CSE group， the cell proliferation rate， the proportion of S and G2/M phases and the number of cell clones were increased in the IMP-1 group， and the proportion of G0/G1 phase in ATⅡ cell cycle and the protein levels of MDR1 and MRP1 were decreased in the" IMP-1 group （P＜0.05）. Conclusion IMP-1 may downregulate the expression of MDR1 and MRP1 proteins induced by CSE in AT Ⅱ cells， inhibiting the progression of AT Ⅱ cells from S phase to G2 phase and from G2 phase to M phase， thereby inhibiting abnormal cell activation and increasing apoptosis.

Key words： pulmonary disease， chronic obstructive; imperatorin derivatives; alveolar type Ⅱ epithelial cells; cigarette smoke extract; multidrug resistance gene 1; multidrug resistance associated protein 1

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）為嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，病因復雜，通常與吸煙、空氣污染或吸入有害氣體等有關［1-2］。臨床上COPD常表現(xiàn)為氣短、咳嗽、咳痰及胸悶等一系列癥狀［3］。肺泡Ⅱ（ATⅡ）型細胞是肺泡壁上的主要細胞類型之一，由脂類和蛋白質組成，主要負責分泌肺表面活性物質（SPA），可降低肺泡表面張力，防止肺泡坍塌［4］。研究發(fā)現(xiàn)，在COPD患者中ATⅡ型細胞的數(shù)量和功能可能發(fā)生改變［5］。歐前胡素為香豆素類化合物，主要存在于白芷、當歸、蛇床子等植物中，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤和調節(jié)免疫等多種生物活性，并被認為對過敏性炎癥、乳腺癌、結腸癌等具有治療效果［6］。歐前胡素的衍生物（imperatorin，IMP-1）是通過對歐前胡素分子結構進行化學修飾得到的化合物［7］。目前，有關IMP-1對COPD ATⅡ型細胞的作用研究較少。基于此，本研究通過探究IMP-1對香煙煙霧提取物（CSE）誘導的COPD ATⅡ型細胞活性及耐藥蛋白的影響，以期為COPD治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器 紅旗渠牌過濾嘴香煙（烤煙型，焦油量10 mg，煙氣煙堿量0.8 mg，煙氣一氧化碳量12 mg），由河南中煙工業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，ATⅡ型細胞（武漢益普生物科技有限公司），歐前胡素標準品（寶雞市辰光生物科技有限公司），DMEM培養(yǎng)基（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），胎牛血清（上海中喬新舟生物科技有限公司），胰蛋白酶（南京萬木春生物科技有限公司），細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液、BAC蛋白定量試劑盒（上海和元李記生物技術有限公司），多耐藥基因1（MDR1）抗體（武漢華美生物工程有限公司），多藥耐藥相關蛋白1（MRP1）抗體（上海鈺博生物科技有限公司）。酶標儀（上海信裕生物科技有限公司），CO2細胞培養(yǎng)箱（北京賽百奧科技有限公司），倒置顯微鏡（上海儀景通光學科技有限公司），凝膠成像儀（南京偉沃生物科技有限公司）。

1.2 CSE制備 將去過濾嘴香煙依次連于自制的抽吸裝置內，點燃后用負壓吸引將煙霧引入3 mL的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，制備為CSE懸液，混勻密閉，過濾除菌，分光光度儀在波長270～280 nm處測定CSE原液的光密度（OD）值。CSE原液用含10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞融合80%以上時，于37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌備用。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組 將ATⅡ型細胞在含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中以37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，待瓶中細胞融合率＞80%時消化并收集細胞，調整細胞密度1×105個/mL，接種于96孔板中，200 μL/孔。將細胞分為空白組（常規(guī)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的生長良好的ATⅡ型細胞）、CSE組（加入2%CSE誘導培養(yǎng)的ATⅡ型細胞）、IMP-1組（采用10 μmol/L的IMP-1干預經(jīng)CSE誘導的ATⅡ型細胞）。

1.4 檢測指標

1.4.1 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測ATⅡ型細胞增殖" "率 收集對數(shù)生長期的ATⅡ型細胞，調整細胞密度為5×104個/mL，接種于96孔板中，90 μL/孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，每組設3個復孔，實驗2次，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加20 μL濃度為5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)4 h。棄上清液，每孔加150 μL二甲基亞砜溶液，振蕩使結晶充分溶解。酶標儀檢測各孔490 nm處OD值。

1.4.2 Hoechst 33342染色法檢測ATⅡ型細胞凋亡率 細胞經(jīng)常規(guī)處理后棄培養(yǎng)基，加入100 μL Hoechst 33342染色液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)30 min，吸取染色液，PBS清洗，熒光顯微鏡下觀察細胞。伴隨染色質堆積、核固縮、出現(xiàn)凋亡小體等為凋亡的細胞。

1.4.3 流式細胞術檢測ATⅡ型細胞周期 消化后收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液，清洗處理，每管加入1 mL 70%乙醇，靜置1 h，1 000 r/min離心5 min，每管加1 mL PBS，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，避光靜置30 min，" " " 1 000 r/min離心5 min，取上清液，PBS洗滌，流式細胞分析儀進行避光檢測。

1.4.4 軟瓊脂克隆形成實驗 1.2%瓊脂糖和2×1640 培養(yǎng)基1∶1混合，取3 mL加入培養(yǎng)皿中，靜置凝結，將0.6%瓊脂糖及2×含不同藥物的1640培養(yǎng)基以1∶1均勻混合后，加入200 μL密度為1×104個/mL的ATⅡ型細胞懸液，搖勻處理，加入培養(yǎng)皿中，凝固，培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞克隆狀態(tài)。

1.4.5 Western blot法檢測MDR1及MRP1蛋白表達 細胞經(jīng)裂解處理后，冰上靜置30 min，2 000 r/min離心15 min，提取上清液，BCA法檢測蛋白濃度，參照說明書常規(guī)變性、凝膠、電泳、分離蛋白及轉膜后封閉處理，加入一抗MDR1（1∶" " " " "3 000）、MRP1（1∶2 000）、" " "β-actin（1∶2 000），4 ℃過夜，TBST清洗3次，加辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000），孵育2 h，洗滌，試劑盒發(fā)光處理，以β-actin為內參，利用AlphaEaseFC軟件進行分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)采用[[x] ±s]表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組ATⅡ型細胞增殖率及凋亡率比較 與空白組比較，CSE組細胞24 h、48 h、72 h增殖率降低，細胞凋亡率升高（P＜0.05），與CSE組比較，IMP-1組細胞24 h、48 h、72 h增殖率升高，凋亡率降低（P＜0.05），見表1、圖1。

2.2 各組ATⅡ型細胞周期占比及克隆情況 與空白組比較，CSE組ATⅡ型細胞G0/G1期占比升高，S、G2/M期占比降低（P＜0.05）；與CSE組比較，IMP-1組ATⅡ型細胞周期G0/G1期占比降低，S、G2/M期占比升高（P＜0.05）。與空白組比較，CSE組ATⅡ型細胞克隆數(shù)目降低（P＜0.05）；與CSE組比較，IMP-1組ATⅡ型細胞克隆數(shù)目升高（P＜0.05），見圖2、3，表2。

2.3 各組ATⅡ型細胞中MDR1、MRP1蛋白表達水平比較 與空白組比較，CSE組ATⅡ型細胞中MDR1、MRP1蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與CSE組比較，IMP-1組ATⅡ型細胞中MDR1、MRP1蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖4、表3。

3 討論

COPD作為一種慢性炎癥性疾病主要影響呼吸道和肺組織。研究發(fā)現(xiàn)，通過增加ATⅡ型細胞數(shù)量或提高其功能可以改善COPD動物模型的肺功能和病理表現(xiàn)［8-9］。在COPD中ATⅡ型細胞減少可能是炎癥反應增加所致［10］。歐前胡素在多種藥用植物中具有較廣泛的分布［11］。歐前胡素不僅有殺菌、消炎、止痛等作用，還具有抑制多種腫瘤細胞增殖及調節(jié)藥物代謝酶活性的作用，是較為良好的天然活性物質［12］。歐前胡素衍生物能夠通過抑制受損細胞的轉錄因子、抑制細胞周期調節(jié)蛋白、調節(jié)細胞凋亡通路等，從而抑制肺癌細胞的增殖并促進其凋亡［13］。在體外和體內，歐前胡素衍生物對損傷細胞均具有抗增殖和促凋亡的作用［14］。歐前胡素可能通過調節(jié)細胞周期和凋亡途徑來影響細胞活性［15］。本研究顯示，經(jīng)CSE干預后ATⅡ型細胞的24 h、48 h、72 h增殖率和克隆數(shù)量均明顯降低，而采用IMP-1調節(jié)后細胞增殖率和克隆數(shù)量均有明顯升高。結合上述研究，筆者認為歐前胡素衍生物可能通過抑制炎癥介質的生成降低CSE干預后的炎癥反應，從而改善炎癥反應對ATⅡ型細胞的損害，臨床上可以通過戒煙、避免空氣污染和接受適當?shù)乃幬镏委焷頊p少COPD引起的ATⅡ型細胞異常減少現(xiàn)象。本研究結果還顯示，經(jīng)CSE干預后ATⅡ型細胞出現(xiàn)了明顯的核凝聚、皺縮現(xiàn)象，且Hoechst 33342染色顯著加深，ATⅡ型細胞的凋亡小體及凋亡率也明顯升高，而經(jīng)IMP-1干預后，ATⅡ型細胞皺縮和染色質凝集明顯減輕，凋亡小體也有所減少，證實了IMP-1干預的有效性。

MDR1作為一種跨膜轉運蛋白常參與藥物的排泄過程。有研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者肺部MDR1的表達水平增加［16］。MRP1與MDR1類似，COPD患者肺部MRP1表達水平增加也可提高部分藥物的耐藥性［17］。在一項針對非小細胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，某種歐前胡素衍生物能通過降低MDR1、MRP1的表達，逆轉藥物耐藥性并促進化療藥物的療效，增加化療藥物對腫瘤細胞的敏感性［18］。細胞周期異常改變不僅能夠造成細胞增殖、凋亡，而且可導致參與細胞周期的相關蛋白表達異常［19-20］。本研究結果亦顯示，與空白組相比CSE組ATⅡ型細胞中的MDR1、MRP1蛋白顯著升高，而經(jīng)IMP-1干預后的ATⅡ型細胞中MDR1、MRP1蛋白均有所降低，細胞周期G0/G1期細胞數(shù)降低，S、G2/M期細胞數(shù)升高，表明IMP-1可能對細胞周期的調控具有一定影響，提示IMP-1可能通過下調MDR1、MRP1的表達來抑制細胞的異?；罨?。分析可能原因為，MDR1、MRP1蛋白均為細胞周期的相關調節(jié)因子，MDR1、MRP1下降改善了ATⅡ型細胞的活性，但不排除同時與其他因子協(xié)同調節(jié)有關。因此，MDR1、MRP1降低可能抑制了ATⅡ型細胞從S期進展到G2期以及G2期進展至M期。

綜上所述，IMP-1可能通過下調CSE誘導的ATⅡ型細胞的MDR1、MRP1蛋白的表達，抑制了ATⅡ型細胞從S期進展到G2期以及G2期進展至M期，從而抑制細胞的異?；罨黾悠涞蛲?。

參考文獻

［1］ 侯萬舉，曹潔，王娟. 血清窖蛋白-1在慢性阻塞性肺疾病相關肺動脈高壓患者中的表達及意義［J］. 天津醫(yī)藥，2019，47（2）：155-158. HOU W J，CAO J，WANG J，et al. Expression and significance of serum cellarin-1 in patients with pulmonary hypertension associated with chronic obstructive pulmonary disease［J］. Tianjin Med J，2019，47（2）：155-158. doi：10.11958/20181303.

［2］MADDAH S A ， BARZEGARI A .The effect of albuterol spray on hypoxia and bronchospasm in patients with chronic obstructive pulmonary disease （COPD） under general anesthesia：a bouble-blind randomized clinical trial[J].Ethiopian J Health Sci，2023，33（3）：491-498. doi：10.4314/ejhs.v33i3.12.

［3］ FIROOZI Z ， SHAHI A ， MOHAMMADISOLEIMANI E ，et al.Circrna-associated cerna networks （circcenets） in chronic obstructive pulmonary disease （COPD）[J].Life Sci，2024，349：122715. doi：10.1016/j.lfs.2024.122715.

［4］ CHENG Y，LIU B，QIAN H，et al. BAY11-7082 inhibits the expression of tissue factor and plasminogen activator inhibitor-1 in type-Ⅱ alveolar epithelial cells following TNF-α stimulation via the NF-κB pathway［J］. Exp Ther Med，2021，21（2）：177. doi：10.3892/etm.2020.9608.

［5］ CLEMENTS D，MILLER S，BABAEI-JADIDI R，et al. Cross talk between LAM cells and fibroblasts may influence alveolar epithelial cell behavior in lymphangioleiomyomatosis［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2022，322（2）：L283-L293. doi：10.1152/ajplung.00351.2021.

［6］ 李慧，張吳霞，熊燁. 歐前胡素調節(jié)MAPK/mTOR/p70S6K信號通路對急性髓系白血病細胞惡性生物學行為的影響［J］. 河北醫(yī)藥，2023，45（13）：1941-1945. LI H，ZHANG W X，XUN Y. Influences of imperatorin on the malignant biological behaviors of acute myeloid leukemia cells by regulating the MAPK/mTOR/p70S6K signaling pathway［J］. Hebei Medical Journal，2023，45（13）：1941-1945. doi：10.3969/j.issn.1002-7386.2023.13.004.

［7］ ZHENG X X，LIU J H，LIU M H，et al. Antidepressant effect and mechanism of imperatorin［J］. Molecules，2022，27（4）：1179. doi：10.3390/molecules27041179.

［8］ NIKOLAOU V，MASSARO S，GARN W，et al. Fast decliner phenotype of chronic obstructive pulmonary disease （COPD）：applying machine learning for predicting lung function loss［J］. BMJ Open Respir Res，2021，8（1）：e000980. doi：10.1136/bmjresp-2021-000980.

［9］ KAHNERT K，J?RRES RA，BEHR J，et al. The diagnosis and treatment of COPD and its comorbidities［J］. Dtsch Arztebl Int，2023，120（25）：434-444. doi：10.3238/arztebl.m2023.027.

［10］ RABE K F，RENNARD S，MARTINEZ F J，et al. Targeting type 2 inflammation and epithelial alarmins in chronic obstructive pulmonary disease a biologics outlook［J］. Am J Respir Crit Care Med，2023，208（4）：395-405. doi：10.1164/rccm.202303-0455CI.

［11］ 于定榮，翁小剛，王本曉，等. 延胡索、白芷炮制配伍對元胡止痛方中延胡索乙素、歐前胡素含量以及鎮(zhèn)痛作用的影響［J］. 中草藥，2021，52（8）：2306-2312. YU D R，WENG X G，WANG B X，et al. Effect of processing and compatibility of Corydalis Rhizoma and Angelicae Dahuricae Radix on contents of tetrahydropalmatine and imperatorin in Yuanhu Zhitong Recipe and its analgesic effect［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs，2021，52（8）：2306-2312. doi：10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.013.

［12］ 王紹展，朱青霞，陳井霞，等. 異歐前胡素通過NF-κB和JAK1/STAT1信號通路抑制巨噬細胞M1極化發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用［J］. 中南藥學，2023，21（8）：1985-1990. WANG S Z，ZHU Q X，CHENG J X，et al. Anti-inflammation and analgesic effect of isoimperatorin on the polarization of macrophage M1 via NF-κB and JAK1/STAT1 signaling pathway［J］. Central South Pharmacy，2023，21（8）：1985-1990. doi：10.7539/j.issn.1672-2981.2023.08.002.

［13］ AMINI P，NODOOSHAN S J，ASHRAFIZADEH M，et al. Imperatorin attenuates the proliferation of MCF-7 cells in combination with radiotherapy or hyperthermia［J］. Curr Radiopharm，2022，15（3）：236-241. doi：10.2174/1874471015666220318122202.

［14］ 劉明娟，韓瑞霞，李鐵，等. 歐前胡素對人前列腺癌PC3細胞增殖凋亡及RhoA/ROCK1信號通路的影響［J］. 河北醫(yī)學，2021，27（3）：362-367. LIU M J，HAN R X，LI T. Effects of imperatorin on proliferation，apoptosis and RhoA/ROCK1 signaling pathway in human prostate cancer PC3 cells［J］. Hebei Medicine，2021，27（3）：362-367.doi：10.3969/j.issn.1006-6233.2021.03.003.

［15］ 王雅嫻，楊全軍，郭澄. 歐前胡素抗腫瘤作用機制及治療的研究進展［J］. 中國醫(yī)院藥學雜志，2022，42（22）：2425-2429.WANG Y X， YANG Q J， GUO C. Progress in antitumor research of imperatorin［J］. Chinese Journal of Hospital Pharmacy，2022，42（22）：2425-2429. doi：10.13286/j.1001-5213.2022.22.20.

［16］ MAJA M，NENA M，JELENA R，et al. MDR1 gene polymorphisms and p-glycoprotein expression in respiratory diseases［J］. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2015，159（3）：341-346. doi：10.5507/bp.2014.032.

［17］ TAGUCHI M，OYAMA R，KANESO M，et al. Hybrid QM/MM free-energy evaluation of drug-resistant mutational effect on the binding of an inhibitor indinavir to HIV-1 protease［J］. J Chem Inf Model，2022，62（5）：1328-1344. doi：10.1021/acs.jcim.1c01193.

［18］ CHEN X Y，YANG Y，WANG J Q，et al. Overexpression of ABCC1 confers drug resistance to betulin［J］. Front Oncol，2021，11：640-656. doi：10.3389/fonc.2021.640656.

［19］ MüHLFELD C，WREDE C，MOLNáR V，et al. The plate body：3D ultrastructure of a facultative organelle of alveolar epithelial type Ⅱ cells involved in SP-A trafficking［J］. Histochem Cell Biol，2021，155（2）：261-269. doi：10.1007/s00418-020-01912-7.

［20］ KRZYZANOWSKI D，KRUSZEWSKI M，GRZELAK A，et al. Differential action of silver nanoparticles on ABCB1（MDR1） and ABCC1（MRP1） activity in mammalian cell lines［J］. Materials（Basel），2021，14（12）：3383. doi：10.3390/ma14123383.

（2024-05-14收稿 2024-06-20修回）

（本文編輯 陸榮展）