溪黃草水提物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的保護(hù)作用及機(jī)制研究

許瓊梅 李躍龍 曹后康 陳春 王剛 朱依諄 張可鋒

中圖分類號(hào) R575；R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）20-2791-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.12

摘 要 目的：研究溪黃草水提物（RWE）對(duì)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)大鼠肝纖維化（HF）的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、秋水仙堿組（0.12 mg/kg）和RWE低、中、高劑量組（4、8、16 g/kg，以生藥量計(jì)），每組10只。除正常組大鼠腹腔注射橄欖油外，其余各組大鼠均腹腔注射40% CCl4橄欖油溶液以復(fù)制HF模型。自造模第1天起，各給藥組大鼠均灌胃相應(yīng)藥物（10 mL/kg），正常組和模型組大鼠均灌胃等體積水，每天1次，連續(xù)6周。給藥結(jié)束后，采用生化法或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)大鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）的含量以及肝組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-1β的含量或活性；采用蘇木精-伊紅染色觀察大鼠肝組織病理學(xué)變化；采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠肝組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量以及肝組織中MDA、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量均顯著升高（P<0.01），肝組織中SOD、GSH-Px的活性均顯著降低（P<0.01）；肝組織纖維化明顯；肝組織中α-SMA、TGF-β1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，秋水仙堿組和RWE各劑量組大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量以及肝組織中MDA、TNF-α、IL-6的含量，秋水仙堿組和RWE中、高劑量組大鼠肝組織中IL-1β的含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），秋水仙堿組和RWE各劑量組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px的活性均顯著增強(qiáng)（P<0.05或P<0.01）；肝組織纖維化程度明顯減輕；肝組織中α-SMA、TGF-β1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：RWE對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HF模型大鼠具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕肝脂質(zhì)過氧化損傷、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎癥因子釋放及TGF-β1蛋白表達(dá)等有關(guān)。

關(guān)鍵詞 溪黃草；水提物；肝纖維化；四氯化碳；氧化應(yīng)激；炎癥因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the protective effects and the mechanism of Rabdosia serra water extract （RWE） on hepatic fibrosis （HF） induced by carbon tetrachloride （CCl4） in rats. METHODS： Sixty male SD rats were randomly divided into normal group， model group， colchicine group （0.12 mg/kg）， and RWE low-dose， medium-dose and high-dose groups （4， 8， 16 g/kg， by crude drug）， with 10 rats in each group. Except for intraperitoneal injection of olive oil for normal group， other groups were given 40% CCl4 olive oil solution intraperitoneally to induce HF model. Since the first day of modeling， each treatment group was given relevant medicine （10 mL/kg） intragastrically， while normal group and model group were given constant volume of water intragastrically， once a day， for consecutive 6 weeks. After medication， biochemical process or ELISA were used to determine the contents of ALT， AST， HA， LN， PCⅢ and Ⅳ-C in serum， the activities or contents of SOD， GSH-Px， MDA， TNF-α， IL-6 and IL-1β in liver tissue. Pathological changes of liver tissue in rats were observed by HE staining. The expression of α-SMA and TGF-β1 in liver tissue were detected by Western blot. RESULTS： Compared with normal group， the contents of ALT， AST， LN， HA， PCⅢ and Ⅳ-C in serum， the contents of MDA， TNF-α， IL-6 and IL-1β in liver tissue were all increased significantly in model group （P<0.01）； the activities of SOD and GSH-Px in liver tissue were decreased significantly （P<0.01）. Liver fibrosis was obvious， and the relative expression of α-SMA and TGF-β1 were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the contents of ALT， AST， HA， LN， PCⅢ and Ⅳ-C in serum as well as the contents of MDA， TNF-α and IL-6 in liver tissue in colchicines group and RWE groups， the contents of IL-1β in liver tissue of rats in colchicines group， RWE medium-dose and high-dose groups were all decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The activities of SOD and GSH-Px in liver tissue of rats were increased significantly in colchicines group and RWE groups （P<0.05 or P<0.01）. The fibrosis degree of liver tissue was significantly reduced， while the relative expression of α-SMA and TGF-β1 decreased significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： RWE can protect CCl4-induced HF model rats， the mechanism of which may be associated with regulating lipid metabolism， relieving liver lipid peroxidation injury and anti-oxidative stress response， inhibiting the release of inflammatory factors and the expression of TGF-β1.

KEYWORDS Rabdosia serra； Water extract； Hepatic fibrosis； Carbon tetrachloride； Oxidative stress； Inflammatory factor； TGF-β1； Rats

肝纖維化（HF）是多數(shù)慢性肝病共同的病理特征，隨著對(duì)HF發(fā)病機(jī)制研究的深入，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，延緩或逆轉(zhuǎn)HF的發(fā)生是大多數(shù)慢性肝病治愈的關(guān)鍵[1]。肝星狀細(xì)胞（HSC）在正常情況下為靜止型，但當(dāng)其受到遺傳異常、膽汁淤積、病毒感染、酒精攝入等內(nèi)外因素的長(zhǎng)期刺激時(shí)，可被激活并轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞（MFB），進(jìn)而造成細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成與降解的失衡，導(dǎo)致大量ECM異常沉積，從而引發(fā)或加速HF[2]。

研究表明，秋水仙堿能通過促進(jìn)膠原酶降解、抑制炎癥反應(yīng)等途徑來修復(fù)肝細(xì)胞，從而發(fā)揮抗HF的作用，臨床上已將其廣泛應(yīng)用于HF的治療，但由于該藥對(duì)不同病因所致HF的治療效果不一且副作用較多，使得其臨床應(yīng)用受限，而目前尚無針對(duì)HF的特效藥[3]。我國(guó)中藥資源豐富，其應(yīng)用也十分普遍。中藥治療具有多層次、多靶點(diǎn)、副作用小的特點(diǎn)，對(duì)于HF等慢性疾病的防治具有顯著優(yōu)勢(shì)[4]。溪黃草[Rabdosia serra （Maxim.） Hara]為唇形科植物線紋香茶菜[R. lophanthoides （Buch.-Ham. ex D. Don） Hara]干燥全草的地上部分，又名山熊膽、風(fēng)血草，主產(chǎn)于長(zhǎng)江以南的云南、廣東、廣西等地區(qū)，具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀之功效，民間主要用于治療黃疸型肝炎[5]。已有研究證實(shí)，溪黃草水煎劑對(duì)肝損傷具有明顯的防治作用[6]，但有關(guān)其抗HF的作用及機(jī)制卻鮮有報(bào)道。為此，本研究以秋水仙堿為陽(yáng)性對(duì)照藥物，通過四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)復(fù)制大鼠HF模型，初步探討溪黃草水提物（RWE）對(duì)大鼠HF的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為溪黃草抗HF藥物的研制及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AUW220D型半微量電子天平（日本Shimadzu公司）；Epoch型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；BX51型正置顯微鏡（日本Olympus公司）；H2050R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)廠，離心半徑：6 cm）；Tanon 5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 藥材

溪黃草藥材（批號(hào)：20170216）購(gòu)自廣西桂林市七星區(qū)六合路中藥材市場(chǎng)，由桂林醫(yī)學(xué)院張可鋒副教授鑒定為唇形科植物線紋香茶菜[R. lophanthoides （Buch.-Ham. ex D. Don） Hara]干燥全草的地上部分。

1.3 藥品與試劑

秋水仙堿對(duì)照品（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170214，純度：≥99.0%）；蘇木精-伊紅（HE）染色液以及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為HE20161228、20170801、20170601、20170728、20171221、20171022）；透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-1β檢測(cè)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為N20012900、AK0017AUG30010、AK0017AUG30008、AK0017AUG30009、AK0017FEB2011、AK0017FEB22012、AK0016APR16014）；蛋白酶抑制劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液、RIPA裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（南通市碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)分別為20170513、20170804、p0008、p0012）；兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、兔抗鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為GR121504-3、GR105729-1）；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（無錫傲銳東源生物科技有限公司，批號(hào)：17AV0305）；山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為112438、133599）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)Millipore公司，批號(hào)：K2JA4078IK）；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20170624）；CCl4等試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.4 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，由桂林醫(yī)學(xué)院SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2013-0001]。所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 RWE的制備

取溪黃草藥材2.7 kg，加水32.4 L浸泡1 h后，加熱至沸騰，保持微沸狀態(tài)，提取1.5 h；同法提取2次，經(jīng)雙層紗布濾過后，合并濾液，濃縮得質(zhì)量濃度為1.6 g/mL（以生藥量計(jì)）的藥液，置于4 ℃冰箱中密封保存，臨用前用水稀釋至相應(yīng)濃度。

2.2 分組、造模與給藥

將60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為正常組、模型組、秋水仙堿組（陽(yáng)性對(duì)照，0.12 mg/kg）和RWE低、中、高劑量組（4、8、16 g/kg，以生藥量計(jì)），每組10只。秋水仙堿組大鼠用藥劑量參考文獻(xiàn)[7]確定；RWE各劑量組參考溪黃草成人臨床用藥劑量（40 g），通過成人與大鼠等效劑量折算系數(shù)（0.02）換算最低劑量，并按常用倍數(shù)（2、4倍）設(shè)置[5，8]。實(shí)驗(yàn)室溫度維持在（20±2）℃，所有大鼠均自由進(jìn)食、飲水。除正常組大鼠腹腔注射橄欖油（1 mL/kg）外，其余5組大鼠均腹腔注射40% CCl4橄欖油溶液（1 mL/kg）復(fù)制HF模型，每周2次，連續(xù)6周[8]。自造模第1天起，各給藥組大鼠均灌胃相應(yīng)藥物（10 mL/kg），正常組和模型組大鼠均灌胃等體積水，每天1次，連續(xù)6周。

2.3 血清中相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

各組大鼠于末次給藥后禁食、不禁水16 h，摘除大鼠眼球取血，于4 ℃下以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，分離血清，采用生化法檢測(cè)血清中ALT、AST的含量，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量。上述指標(biāo)均使用酶標(biāo)儀檢測(cè)，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說明書操作。

2.4 肝組織中相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

采血后處死各組大鼠，取其相同部位肝組織100 mg，加入生理鹽水1 mL，研磨，制成10%（m/V）肝組織勻漿，于4 ℃下以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，取上清液，置于-20 ℃貯存，待用。采用生化法檢測(cè)肝組織中MDA、SOD、GSH-Px的含量或活性，采用ELISA法檢測(cè)肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量。上述指標(biāo)均使用酶標(biāo)儀檢測(cè)，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說明書操作。

2.5 肝組織病理學(xué)觀察

切取各組大鼠肝組織適量，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片（厚度約為4 μm），經(jīng)脫蠟、封片后，行常規(guī)HE染色，于正置顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

2.6 蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)肝組織中α-SMA、TGF-β1蛋白的表達(dá)情況。切取各組大鼠肝組織50 mg，置于玻璃勻漿器中，加入含蛋白酶抑制劑（體積分?jǐn)?shù)為1%）的RIPA裂解液1 mL，于4 ℃下研磨，制成勻漿，并于4 ℃下以轉(zhuǎn)速14 000 r/min離心5 min，取上清液，參照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書步驟測(cè)定蛋白含量。蛋白定量后，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液適量，于95 ℃水浴中加熱5 min變性。將變性后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，并于恒流200 mA的條件下轉(zhuǎn)膜2.5 h至PVDF膜上，以5%脫脂牛奶封閉2 h，用TBST溶液清洗3次，每次10 min。然后分別加入α-SMA抗體（1 ∶ 1 000）、TGF-β1抗體（1 ∶ 1 000）和β-actin抗體（1 ∶ 1 000），于4 ℃下孵育過夜，隨后加入二抗（α-SMA、TGF-β1：山羊抗兔IgG二抗，β-actin：山羊抗鼠IgG二抗；加入量均為1 ∶ 5 000），于室溫下孵育2 h。采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像，使用Quantity One 4.6軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算α-SMA、TGF-β1蛋白的相對(duì)表達(dá)量[9]。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 RWE對(duì)HF模型大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組和RWE各劑量組大鼠血清中上述指標(biāo)的含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 RWE對(duì)HF模型大鼠肝組織中MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6、IL-1β含量或活性的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中MDA、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量均顯著升高，SOD、GSH-Px的活性均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組大鼠肝組織中MDA、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量，RWE各劑量組大鼠肝組織中MDA、TNF-α、IL-6的含量以及RWE中、高劑量組大鼠肝組織中IL-1β的含量均顯著降低，秋水仙堿組和RWE各劑量組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px的活性均顯著增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.3 RWE對(duì)HF模型大鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)周圍未見小膽管及纖維組織增生，細(xì)胞排列整齊。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，小葉內(nèi)細(xì)胞水腫，局灶肝細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及充血現(xiàn)象，纖維化明顯。秋水仙堿組和RWE各劑量組大鼠肝組織中大部分肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝組織病變、炎癥壞死及纖維化程度均有所減輕，且以秋水仙堿組和RWE高量劑組改善效果更為明顯，詳見圖1。

3.4 RWE對(duì)HF模型大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組和RWE各劑量組大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見圖2、表3。

4 討論

CCl4是經(jīng)典的HF誘導(dǎo)劑，通過CCl4誘導(dǎo)建立的HF動(dòng)物模型，其肝組織在形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)等方面與人類相似[10]。CCl4被機(jī)體吸收后可引起肝細(xì)胞損傷，使細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)ALT、AST滲出進(jìn)入血液，使其血液濃度明顯升高[11]；與此同時(shí)，上述過程伴有HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C水平的明顯升高，這四者是參與ECM合成的重要成分，能導(dǎo)致肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，可準(zhǔn)確、靈敏地反映肝內(nèi)纖維產(chǎn)生及肝細(xì)胞受損的情況，是臨床診斷HF的敏感指標(biāo)[12-13]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且肝細(xì)胞病變、壞死和纖維化程度明顯，提示HF模型復(fù)制成功。與模型組比較，秋水仙堿組和RWE各劑量組大鼠血清中上述指標(biāo)的含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且肝細(xì)胞病變、壞死和纖維化程度均明顯減輕，提示RWE能改善HF，對(duì)HF模型大鼠具有一定的保護(hù)作用。

MDA為自由基參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其異常表達(dá)可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死[14]。在正常情況下，機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)可以通過抑制自由基產(chǎn)生、清除自由基、修復(fù)損傷及誘導(dǎo)抗氧化酶來發(fā)揮保護(hù)作用，其中SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶，能夠有效清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)物形成[15]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織中MDA的含量顯著上升，SOD、GSH-Px的活性均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示其機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，抗氧化能力減弱。與模型組比較，秋水仙堿組和RWE各劑量組大鼠肝組織中MDA的含量均顯著降低，SOD、GSH-Px的活性均顯著增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示RWE具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕肝脂質(zhì)過氧化損傷以及增強(qiáng)抗氧化酶活性的作用。

有研究表明，幾乎在所有肝病的發(fā)展過程中都伴有不同程度的氧化應(yīng)激（OS）反應(yīng)[16]。OS反應(yīng)相關(guān)產(chǎn)物能夠直接或間接作用于肝細(xì)胞，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子變性，破壞其細(xì)胞膜和亞細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，造成持續(xù)性氧化損傷，并激活枯否細(xì)胞（KC），活化的KC會(huì)分泌大量的炎癥因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β等），這些炎癥因子通常以自分泌或旁分泌的形式釋放，并直接刺激HSC的活化與增殖[17-18]；而活化后的HSC本身也會(huì)產(chǎn)生促HF因子，通過反饋性調(diào)節(jié)自身或周圍HSC細(xì)胞群落，維持和增強(qiáng)其纖維化狀態(tài)，故炎癥因子的釋放程度可以反映肝內(nèi)OS水平[19]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示HF可引發(fā)炎癥反應(yīng)。與模型組比較，秋水仙堿組和RWE各劑量組大鼠肝組織中TNF-α、IL-6的含量，秋水仙堿組和RWE中、高劑量組大鼠肝組織中IL-1β的含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示RWE抗HF的作用機(jī)制可能與減少TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的釋放有關(guān)。

TGF-β1是公認(rèn)最具代表性的促HF因子，在HSC的激活和HF維持過程中起著關(guān)鍵作用[20]。在HF發(fā)展進(jìn)程中，TGF-β1釋放的纖溶酶與其他蛋白酶可進(jìn)一步通過自身調(diào)節(jié)機(jī)制增加TGF-β1的表達(dá)[20]。高水平的TGF-β1可調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，并刺激靜止型HSC分化成以α-SMA高表達(dá)為特征的MFB，引起ECM異常沉積，引發(fā)或加速HF進(jìn)程，因此抑制TGF-β1產(chǎn)生也是阻止HF形成的重要途徑之一[2，21]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示HF模型復(fù)制成功。與模型組比較，秋水仙堿組和RWE各劑量組大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示RWE抗HF的作用機(jī)制可能是通過抑制α-SMA和TGF-β1蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，RWE對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HF模型大鼠具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕肝脂質(zhì)過氧化損傷、抗OS反應(yīng)、抑制炎癥因子釋放及TGF-β1蛋白表達(dá)等有關(guān)。溪黃草主要分布于我國(guó)西南地區(qū)，目前已有較為成熟的栽培、采摘及粗加工技術(shù)[22]，但民間多用于煲湯及制作涼茶，僅在部分地區(qū)用于肝膽疾病的輔助治療，且相關(guān)研究主要集中于藥效方面，而抗HF的作用機(jī)制研究尚不充分，導(dǎo)致其開發(fā)程度不高[23]。本研究采用多項(xiàng)指標(biāo)探討了RWE對(duì)HF模型大鼠的保護(hù)作用，同時(shí)還對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了較為全面的考察，為溪黃草的開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)，但其具體作用機(jī)制仍有待后續(xù)深入研究。

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（收稿日期：2018-02-26 修回日期：2018-06-01）

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