生物炭與檸檬酸對石灰性土壤鎘形態(tài)轉(zhuǎn)化及紫花苜蓿鎘富集的影響

摘要：本研究以鎘污染石灰性土壤（Cd含量7.15 mg／kg）為基質(zhì)進行盆栽試驗，設(shè)置Cd脅迫下施用不同熱解溫度生物炭（250、480℃，B1、B2）、檸檬酸不同用量（1、10 mmol/kg，N1、N2）及其組合處理（B1N1、B1N2、B2N1、B2N2），以單種植紫花苜蓿為對照（CK），研究不同熱解生物炭和檸檬酸用量對土壤性質(zhì)、Cd形態(tài)轉(zhuǎn)化及紫花苜蓿Cd富集的影響。結(jié)果表明，生物炭、檸檬酸處理皆可提高土壤有效養(yǎng)分含量、提高土壤酶活性、改變低分子量有機酸組成，高溫熱解生物炭、高劑量檸檬酸處理效果更顯著。生物炭、檸檬酸處理影響土壤Cd形態(tài)轉(zhuǎn)化和紫花苜蓿Cd的富集，但二者的作用強弱與機制不同：不同熱解溫度生物炭對Cd皆為吸附鈍化效果，而低濃度檸檬酸略微鈍化Cd，高濃度檸檬酸活化土壤碳酸鹽結(jié)合態(tài)鎘（CA-Cd）和可交換態(tài)鎘（EX-Cd），提高有效Cd含量。生物炭與檸檬酸配施條件下，與CK相比，B1N2處理的土壤有效Cd含量、植株Cd含量及生物富集系數(shù)分別顯著提高40. 01%、57.48%及12. 40%，B2N1則分別顯著下降26. 79%、49. 38%及30. 81%。綜上，不同熱解溫度生物炭及檸檬酸劑量對Cd修復的作用強弱與機制存在差異，高溫生物炭配施低劑量檸檬酸可鈍化土壤Cd，低溫生物炭配施高劑量檸檬酸處理可活化土壤Cd及促進紫花苜蓿Cd富集。

關(guān)鍵詞：生物炭：檸檬酸；紫花苜蓿；土壤酶活性；鎘污染土壤；鎘形態(tài)；生物富集系數(shù)

中圖分類號：S541.1：X53 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）10-0119-08

隨著工業(yè)化和農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，重金屬污染因其隱蔽性和較高的生態(tài)毒性，正成為各種農(nóng)田土壤污染中最普遍、最嚴重的環(huán)境問題之一。最新的普查數(shù)據(jù)表明，在我國，82.8%的土壤不同程度地受到各種重金屬污染，其中9%的土壤鎘（Cd）濃度超標。Cd具有流動性高、持久性強及易富集等特點，對植物具有極強的破壞性，可顯著抑制植物的生殖、發(fā)育、代謝以及養(yǎng)分吸收，引起植物生理系統(tǒng)紊亂。Cd可通過徑流、灌溉、沉積物等途徑遷移到環(huán)境中，之后通過食物鏈富集于人體中。研究表明，持續(xù)接觸Cd可能引發(fā)多種疾病，如心腦血管疾病、腎衰竭和神經(jīng)系統(tǒng)問題，嚴重影響人類健康。因此，環(huán)境保護和食品安全已成為各國保障人民安全健康的重要任務(wù)。通過土壤鈍化或降低土壤Cd含量是預(yù)防其進入食物鏈的首要環(huán)節(jié)，目前采用物理、化學以及生物技術(shù)的單一或組合手段已廣泛應(yīng)用于土壤修復，并表現(xiàn)出良好的修復效果。

低分子量有機酸（LMWOA）是主要由動植物殘體分解、根系分泌、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化以及土壤微生物代謝所產(chǎn)生的一類活性小分子有機化合物，可與重金屬之間發(fā)生螯合／絡(luò)合，因而在控制重金屬的溶解性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，從而改變根際土壤中重金屬的轉(zhuǎn)化與移動。重金屬的遷移性很大程度上取決于LMWOAs的種類和濃度、土壤性質(zhì)和其他環(huán)境因子。研究表明，低濃度的外源檸檬酸鹽和酒石酸鹽可促進重金屬的固定，而二者濃度較高時則促進重金屬的溶解，而高或低濃度的草酸皆可增強重金屬的活化能力。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，低pH值條件下，增加檸檬酸、草酸或蘋果酸會導致酸性水稻土和紅壤鈍化Cd，而較高pH值條件下，只有檸檬酸顯著增加Cd的溶解度。

生物炭（BC）是一類將生物殘體、有機廢棄物在限氧環(huán)境中熱解制備的富碳產(chǎn)物。BC具有弱堿性、表面電荷密度高、孔隙率大及富含多種羥基、烷烴和酰胺基官能團等特點。大量研究表明，BC可通過改善土壤酶活性、影響植物根系分泌物組成及調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等方式介導土壤中的重金屬形態(tài)轉(zhuǎn)化，從而影響植物對重金屬的吸收與富集。然而不同條件下制備的生物炭在基礎(chǔ)性質(zhì)及使用效果上可能存在較大差異。紫花苜蓿（Medicago sativa）是根系分泌物較多且豐富的豆科植物，因其適應(yīng)性強、體內(nèi)蛋白活性高等特點，現(xiàn)已被廣泛用作修復重（類）金屬的功能植物。目前關(guān)于生物炭、低分子量有機酸對Cd修復效果的研究較少，且對富集型植物的研究更是鮮有涉及。本試驗研究了Cd污染土壤中檸檬酸、不同生物炭單獨或混合施用對石灰性土壤性質(zhì)、鎘賦存形態(tài)及紫花苜蓿對Cd積累的影響，以期為鎘污染土壤的治理及修復提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2023年5-7月在濟寧學院大棚試驗區(qū)進行。供試紫花苜蓿品種為‘改革者’，秋眠級3.0。供試檸檬酸（C6H8O7）為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。供試土壤取自山東省濟寧市某皮革廠排水區(qū)0-30 cm土層，土壤類型為砂姜黑土，土壤主要理化性質(zhì)：pH值8.05，有機質(zhì)、全氮含量分別為13.37、0.78 g/kg，堿解氮、有效磷、速效鉀含量分別為62. 75、15. 58、171. 64mg/kg。土壤DTPA提取態(tài)鎘含量為7.15 mg/kg。根據(jù)《農(nóng)用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB15618-2018），當土壤pH值＞7.5時，農(nóng)田土壤污染鎘臨界值為0.8 mg/kg，本試驗供試土壤鎘超標近8倍，為中輕度污染水平。生物炭原料為花生殼，購自河南省生物炭工程技術(shù)研究中心，制備條件見彭紅宇等的方法，供試生物炭基本理化性質(zhì)見表1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，以污染土壤（DTPA-Cd 7.15 mg/kg）為盆栽基質(zhì)，設(shè)置2因素2水平試驗，其中兩因素分別為施用生物炭（B）、施用檸檬酸（N）；生物炭類型為低溫（BI）、高溫（B2）制備，檸檬酸水平為低水平1 mmol/kg（N1）、高水平10 mmol/kg（N2）。相應(yīng)單施和組合施用處理分別為B1、B2、N1、N2、B1N1、B1N2、B2N1、B2N2；以不施生物炭及檸檬酸為對照（CK），共9個處理，重復3次。其中生物炭施用量為盆栽用土質(zhì)量（以干基計）的1%。每盆裝土5 kg，生物炭處理將生物炭與土壤混勻，檸檬酸處理為水溶施入。按田間種植密度8×107粒/hm2換算，每盆播6粒種子，培育周期91 d，期間保持60% - 75%土壤持水量。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 紫花苜蓿Cd含量測定

盆栽結(jié)束時，獲取紫花苜蓿完整植株，將干凈植株置于105℃烘箱中殺青30 min，60℃烘干以獲得干物質(zhì)量。將烘干的植株采用SG65型實驗用小型研磨機粉碎為粉末，裝入自封袋密封備用。粉末樣品加入HNO3與HClO4混合液采用微波消解儀（MDS-6，上海新儀微波化學科技有限公司產(chǎn)品）消解，借助電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（IM2000E，江蘇天瑞儀器股份有限公司產(chǎn)品）采用ICP-MS法測定Cd含量。

1.3.2 土壤Cd形態(tài)、土壤性質(zhì)及酶活性測定

從紫花苜蓿根表附近（＜0.5 cm）獲取根際土壤，過0.15 mm網(wǎng)篩后分為兩部分，一部分自然風干用于測定土壤Cd粗存形態(tài)，另一部分采用真空冷凍干燥機（2022-00986，東富龍科技集團股份有限公司產(chǎn)品）干燥后用于測定土壤酶活性和土壤性質(zhì)。

土壤有效鎘含量采用二乙烯三胺五乙酸（DTPA）浸提，ICP-MS法測定。根際土壤鎘形態(tài)采用改進的BCR連續(xù)提取法進行測定。土壤Cd包含可交換態(tài)（EX-Cd）、鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)（FM-Cd）、碳酸鹽結(jié)合態(tài)（CA-Cd）、有機結(jié)合態(tài)（OM-Cd）以及殘渣態(tài)（RE-Cd）共5種形態(tài)。

土壤pH值（水：土=2.5：1）采用pH計[ ST3100/F，奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品]測定。土壤可溶性有機碳（DOC）采用水浸提—有機碳分析儀（IFIA7，北京吉天儀器有限公司產(chǎn)品）測定。腐植酸（HA）采用焦磷酸鈉浸提—重鉻酸鉀法測定。土壤堿解氮（AN）、有效磷（AP）及速效鉀（AK）分別采用堿解擴散法、鉬藍法及火焰光度法測定。土壤過氧化氫酶（CAT）、土壤轉(zhuǎn)化酶（INV）、土壤堿性蛋白酶（ALPT）、土壤脲酶（SUE）活性采用試劑盒提取—分光光度法測定，試劑盒均購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，型號分別為：S-CAT-2-Y、SINV-2-Y、S-ALPT-2-Y、S-UE-2-Y。

1.3.3 土壤低分子量有機酸含量測定

根際土壤低分子量有機酸含量測定參照Tao等，的方法，略有修改。稱取10.00 g根際土于三角瓶中，加入45 mL超純水，使用渦旋振蕩儀（2-16KL，上海納茲儀器有限公司產(chǎn)品）以2 000 r/min渦旋振搖2 min，使其充分混勻。將勻漿采用高速低溫離心機以15 000 r/min離心10 min，用0.22 μm的微孔濾膜抽真空過濾。濾液采用樹脂柱吸附有機酸組分，采用1 mol/L鹽酸洗脫，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以90 r／min蒸發(fā)濃縮至2mL。濃縮液加入超純水至10 mL，采用0.22 μm的微孔濾膜抽真空過濾，借助高效液相色譜儀（HPLC-20AT，上海昂軒儀器有限公司產(chǎn)品）采用HPLC法測定根際低分子量有機酸譜。色譜條件、流動相及參數(shù)設(shè)置參照Zhao等的方法，采用相應(yīng)低分子量有機酸標準品用于校正。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

鎘的生物富集系數(shù)（BCF）按照下式計算：

BCF=植株Cd含量／土壤有效Cd含量。

采用Microsoft Excel、SPSS 23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理與統(tǒng)計分析，采用Origin 11軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭與檸檬酸對污染土壤理化性質(zhì)的影響

由表2可知，各處理土壤pH值范圍為7.85 -8.07，其中以B2處理最高，其他處理較之降低0.62% - 2.73%，僅BIN2與B2處理差異顯著。土壤溶解性有機碳（DOC）含量表現(xiàn)為單施檸檬酸處理（N1、N2）高于單施生物炭處理（B1、B2），與對照（CK）相比，生物炭與檸檬酸相關(guān)處理提高15.61% - 51.93%，除B2外其他處理皆顯著高于CK。腐植酸（HA）含量表現(xiàn)為B1處理顯著高于N1處理，而B2處理顯著低于N2處理，且N1處理與CK無顯著差異：生物炭與檸檬酸組合處理中，以B1N2處理HA含量最高，顯著高于其他組合處0理。堿解氮（AN）、有效磷（AP）及速效鉀（AK）含量均以單施生物炭整體大于單施檸檬酸處理，其中單施檸檬酸處理表現(xiàn)為N2＞N1，單施生物炭處理表現(xiàn)為B2＞B1。綜上，生物炭與檸檬酸配施處理土壤各指標中以B2N2（HA除外）、B1N2（pH值除外）處理存在較大值。

2.2 生物炭與檸檬酸對土壤酶活性的影響

由表3可知，土壤轉(zhuǎn)化酶（INV）活性以B2N2處理最高，B1N2次之，但兩處理間無顯著差異，而其他處理較B2N2、BIN2分別顯著降低20. 09% -54.30%、14. 65% - 51. 18%。土壤過氧化氫酶（CAT）活性，就單施生物炭或檸檬酸處理而言，CAT活性皆以N2大于N1;生物炭與檸檬酸配施處理CAT活性則表現(xiàn)為B1N1＜ B2N1＜ B1N2＜B2N2，其中BIN2、B2N2較B1N1分別顯著提高7.60%、12.57%；B1、N1與CK的CAT活性較低且處理間均無顯著差異；土壤脲酶（SUE）活性以CK最低，其他處理較之顯著提高118.66% -211.94%；生物炭與檸檬酸配施處理中，以B1N2處理的SUE活力最旺盛，但處理間差異不顯著：各單施處理中B1、B2、N1及N2較B1N2分別顯著降低29.90%、15.07%、22.97%及16.27%。土壤堿性蛋白酶（ALPT）活性以B2N2處理最高，CK、B1、B2、N1及BINI較之分別顯著降低50.46%、42.69%、31.62%、35. 84%及44. 14%，其余處理亦低于B2N2處理，但差異均未達顯著水平。

2.3 生物炭與檸檬酸對紫花苜蓿根際土壤低分子量有機酸含量影響

由表4可知，紫花苜宿根際土壤低分子量有機酸各組分含量表現(xiàn)為丙二酸＜奎寧酸＜琥珀酸＜酒石酸＜檸檬酸＜草酸。不同處理各組分含量存在一定差異，其中BIN2處理的檸檬酸、草酸及奎寧酸含量最高，其他處理較之分別降低5. 36% -32.97%、8.16% - 36.57%及3.91% - 34. 16%。酒石酸含量各處理表現(xiàn)為CK＜B1＜B2＜N1＜B2N1＜B1N1＜B2N2＜B1N2＜N2，與N2相比，其他處理顯著降低8.05% - 46.40%。CK琥珀酸含量最高，其他處理較之顯著降低4.20% - 38.72%。丙二酸含量各處理表現(xiàn)為CK ＜B1＜ B2＜ N1 ＜N2 ＜B1N1、B2NI＜BIN2＜B2N2，與CK相比，B1提高7.83%，但二者無顯著差異，其他處理顯著提高9. 57% -37.39%。

2.4 生物炭與檸檬酸對土壤有效鎘含量及鎘形態(tài)比例的影響

由圖IA可知，土壤碳酸鹽結(jié)合態(tài)（CA-Cd）、可交換態(tài)（EX-Cd）有效鎘含量均以B1N2處理最高，其他處理較之分別顯著降低12. 29% -66.42%、2.33% - 31.79%：B1N2處理的總有效鎘含量最高，較CK顯著提高40.01%，而B2N1處理最低，較CK顯著降低26.79%。表明高溫生物炭配施低水平的檸檬酸對土壤Cd具有鈍化作用。

由圖1B可知，土壤不同形態(tài)鎘占比表現(xiàn)為CA-Cd＜EX-Cd＜OM-Cd＜RE-Cd＜FM-Cd，且不同處理鎘組分比例存在差異，其中CA-Cd、EX-Cd占比以BIN2處理最高，分別為24.22%、23.29%。FM- Cd、RE - Cd組分占比分別為21. 98% -32.62%、14.18% - 26. 21%，分別以B2N2、BC2處理最高。OM-Cd組分占比各處理表現(xiàn)為B1N2＜NM2＜CK＜NM1＜B2N2＜BC1＜BC2 ＜B2N1＜B1N1，其他處理較B1N1顯著降低5.33 - 15.95個百分點。

2.5 生物炭與檸檬酸對紫花苜蓿鎘含量與富集的影響

由圖2A可知，各處理紫花苜蓿植株Cd含量表現(xiàn)為B1N2處理最高，顯著高于CK 57.48%，NM2處理次之，也顯著高于CK，其他處理均顯著低于對照，其中B2N1處理最低，較對照降低49.38%。單施檸檬酸植株的Cd含量整體高于單施生物炭處理，其中單施生物炭處理差異不顯著，而單施檸檬酸則以N2顯著較高：二者組合處理中，以B1N2含量最高，B1N1、B2N1及B2N2較之顯著降低49.51%、67.86%及56.24%。表明低溫生物炭配施高水平的檸檬酸對土壤Cd具有活化作用從而提高植株Cd含量。

由圖2B可知，各處理的BCF值以BIN2最高，較CK顯著提高12.40%；B2N1處理最低，較CK顯著降低30.81%。

2.6 土壤性質(zhì)、低分子量有機酸（LMWOA）含量與鎘指標間的相關(guān)性分析

土壤性質(zhì)、LMWOA含量與不同形態(tài)鎘指標間的相關(guān)性分析結(jié)果（表5）表明，CA-Cd與檸檬酸、草酸、丙二酸均呈顯著或極顯著正相關(guān)，與pH值、DOC、HA、INV、CAT、ALPT、琥珀酸呈顯著或極顯著負相關(guān)。EX-Cd與草酸呈顯著正相關(guān)，與pH值、DOC、AP、CAT、SUE、琥珀酸呈顯著負相關(guān)。FM-Cd與pH值、草酸分別呈顯著正、負相關(guān)。OM-Cd與AK、琥珀酸分別呈顯著正、負相關(guān)。RE-Cd與pH值、草酸分別呈顯著正、負相關(guān)。植株Cd含量與AP、檸檬酸、草酸呈顯著正相關(guān)，與pH值、DOC、AN、AK呈顯著負相關(guān)。BCF與檸檬酸呈顯著正相關(guān)，與DOC、HA、AN、CAT呈顯著負相關(guān)，與丙二酸呈極顯著負相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

土壤Cd污染是影響農(nóng)田生態(tài)的主要因素之一，目前Cd污染土壤修復策略為有效態(tài)／半有效態(tài)鈍化及固持態(tài)活化以促進超積累植物Cd富集。低分子量有機酸、生物炭皆是目前常用的土壤重金屬修復材料，但關(guān)于不同熱解溫度生物炭、不同檸檬酸水平對土壤Cd的修復效果尚不清楚。土壤可溶性有機碳、腐植酸是土壤中重要的有機物質(zhì)，可與Cd2+發(fā)生吸附、絡(luò)合及沉淀反應(yīng)。本研究中，B1N2處理具有最高的DOC、HA含量，且pH值最低，表明該處理具有較強的絡(luò)合鈍化潛力，換言之，B1N2處理沒有發(fā)生鈍化作用。有效養(yǎng)分是影響植物生長的關(guān)鍵因素，其含量高低反映著土壤供給能力，決定著當季植物的生長發(fā)育及生產(chǎn)性能。本研究中，單施生物炭、檸檬酸處理的AN、AP、AK含量皆高于CK，其中B2N2、B1N2處理存在較大值。這表明檸檬酸對有效養(yǎng)分的影響較大，且較高的檸檬酸水平具有較強的養(yǎng)分周轉(zhuǎn)能力。

土壤酶在促進土壤元素循環(huán)、微生物代謝及生態(tài)穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用，其活性可反映土壤健康狀況，有助于調(diào)節(jié)土壤質(zhì)量與生態(tài)。本研究中，與CK相比，生物炭、檸檬酸單施或組合處理土壤轉(zhuǎn)化酶、過氧化氫酶、脲酶及堿性蛋白酶均具有較高活性，且高溫熱解生物炭處理優(yōu)于低溫熱解生物炭。前人研究表明，生物炭制備過程中的熱解溫度是影響生物炭結(jié)構(gòu)、元素組成及理化性質(zhì)等的重要因素，高溫熱解生物炭往往含有更多底物養(yǎng)分、微孔結(jié)構(gòu)和更大的表面積，可提供更多的生態(tài)位，從而更有利于改善土壤質(zhì)地，這可能是本研究高溫熱解生物炭處理土壤的酶活性更旺盛的原因。本研究中，B1N1、B1N2、B2N1、B2N2整體具有較高的土壤酶活性，表明適宜生物炭與檸檬酸組合處理可以增加土壤微生物活性，進而提高土壤養(yǎng)分周轉(zhuǎn)。

LMWOA是根系分泌物中的重要成分，植物能夠通過根系向根際釋放不同數(shù)量不同組分的LMWOA來響應(yīng)外界刺激。本研究中，10mmol/kg檸檬酸相關(guān)處理（N2、B1N2、B2N2）的檸檬酸、草酸、酒石酸、奎寧酸及丙二酸含量較高。這與馬歡歡等的研究結(jié)果基本一致：檸檬酸是可溶性LMWOA的重要組成部分，外源施用高劑量的檸檬酸可誘導油葵釋放更多的LMWOA，從而有利于提高鎘的生物可用性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在僅種植紫花苜蓿條件下，琥珀酸含量較高，顯著高于生物炭、檸檬酸單施或組施處理。琥珀酸是紫花苜蓿釋放較多的LMWOA成分，檸檬酸與琥珀酸具有互斥作用，因此檸檬酸處理下琥珀酸含量下降：生物炭的表面電荷為負，且具有一定量的官能團，因此生物炭施用下琥珀酸可能被吸附、分解，因此含量亦較少。

重金屬的生物毒性和有效性與其含量、賦存形態(tài)及植物耐受性密切相關(guān)。本研究中，紫花苜蓿根際土壤Cd形態(tài)的組成表現(xiàn)為碳酸鹽結(jié)合態(tài)＜可交換態(tài)＜有機結(jié)合態(tài)＜殘渣態(tài)＜鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)：土壤顆粒表面對RE-Cd、CA-Cd的吸附較弱，可在土壤溶液中游離，是可以被植物吸收的有效Cd形態(tài)。本研究中，B1N2較CK顯著提高土壤有效鎘含量40.01%，而B2NI處理土壤總有效態(tài)鎘含量最低，較CK顯著降低26.79%。紫花苜蓿Cd含量、生物富集系數(shù)均以BIN2處理最大，分別較CK顯著提高57. 48%、12. 40%，B2N1處理最低，分別較CK顯著降低49.38%、30.81%。前人研究表明，檸檬酸具有增強植物抵抗Cd脅迫、絡(luò)合土壤Cd2+、促進超富集植物吸收Cd2+及改善土壤Cd的遷移轉(zhuǎn)化等功能。

綜上，不同熱解溫度生物炭及檸檬酸劑量對Cd修復的作用強弱與機制存在差異，高溫生物炭配施低劑量檸檬酸可鈍化土壤Cd，低溫生物炭配施高劑量檸檬酸處理可活化土壤Cd及促進紫花苜蓿Cd富集。

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（41807053）