近紅外光譜檢測油莎豆乳中蛋白質(zhì)和總固形物含量研究

摘要：利用近紅外光譜技術(shù)快速檢測油莎豆乳中蛋白質(zhì)含量、總固形物含量，實驗分別采用凱氏定氮法和考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，采用常壓干燥法測定總固形物含量；分析比較S-G平滑法、標準正態(tài)變量變換（SNV）、多元散射校正（MSC）、一階微分（FD）、二階微分（SD）5種光譜預(yù)處理方法，利用分段建模法篩選出最佳光譜建模區(qū)域，采用留一法交叉驗證主成分分析方法確定的主成分數(shù)量，結(jié)果表明平滑S-G+二階導(dǎo)數(shù)的光譜預(yù)處理效果最佳，以1 200～1 800 nm范圍為PLS建模光譜波段，采用考馬斯亮藍法、凱氏定氮法構(gòu)建的蛋白質(zhì)含量近紅外模型的預(yù)測相關(guān)系數(shù)R分別為0.975 5，0.969 2，預(yù)測均方根誤差分別為0.276，0.287；總固形物含量模型的預(yù)測相關(guān)系數(shù)R為0.969 9，預(yù)測均方根誤差為0.326，獨立測試集樣品的預(yù)測值和實測值之間的殘差值均較小，接近0，殘差和分別為-0.02，0.01，-0.02，研究結(jié)果表明建立的近紅外光譜快速檢測油莎豆乳蛋白質(zhì)含量、總固形物含量的方法能夠滿足檢測要求，可為油莎豆乳行業(yè)健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：油莎豆乳；近紅外光譜；蛋白質(zhì)；總固形物

中圖分類號：TS207.3""""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）11-0158-06

Determination of Content of Protein and Total Solids of Cyperus esculentus

Soymilk by Near-Infrared Spectroscopy

BAI Xia1， YE Chun-miao2， WANG Miao1， ZHANG Hui1， LI Dong-hua1*

（1.School of Pharmaceutical and Bioengineering， Shenyang University of Chemical

Technology， Shenyang 110142， China; 2.Liaoyang Vocational College of

Technology， Liaoyang 111000， China）

Abstract： The content of protein and total solids in Cyperus esculentus soymilk is rapidly detected using near-infrared spectroscopy technology. In this experiment， the content of protein is determined by Kjeldahl method and Coomassie brilliant blue staining method respectively， and the content of total solids is determined by atmospheric pressure drying method. Five spectral pretreatment methods including S-G smoothing method， standard normal variable transformation （SNV）， multivariate scattering correction （MSC）， first order differentiation （FD） and second order differentiation （SD） are analyzed and compared. The segmented modeling method is used to select the optimal spectral modeling region， and the number of principal components is determined by leave-one-out cross validation principal component analysis method. The results show that the spectral pretreatment effect of smoothing S-G+second order derivative is the best， with PLS modeling spectral band in the range of 1 200～1 800 nm， the predicted correlation coefficient R of the protein content near-infrared model constructed by Coomassie brilliant blue staining method and Kjeldahl method is 0.975 5， 0.969 2 respectively， the predicted root mean square errors are 0.276， 0.287 respectively; the predicted correlation coefficient R of the total solid content model is 0.969 9， the predicted root mean square error is 0.326. The residual values between the predicted values and the measured values of the independent test set samples are small and close to zero， with the sum of residual values of -0.02， 0.01， -0.02 respectively. The research results show that the established rapid detection method for the content of protein and total solids in Cyperus esculentus soymilk by near-infrared spectroscopy can meet the detection requirements， which can provide technical support for the healthy development of Cyperus esculentus soymilk industry.

Key words： Cyperus esculentus soymilk; near-infrared spectroscopy; protein; total solids

收稿日期：2024-05-14

基金項目：遼寧省教育廳科學(xué)研究經(jīng)費項目（LJKZ0444，LJKMZ20220785）

作者簡介：白瑕（1998—），女，碩士研究生，研究方向：藥品、食品的質(zhì)量控制和無損檢測。

*通信作者：李東華（1981—），女，講師，博士，研究方向： 藥品、食品的質(zhì)量控制和無損檢測。

油莎豆又稱虎堅果、油莎草，是一種莎草科草本植物，《新華本草綱要》中記載，油莎豆塊莖具有一定抗炎癥作用，并有健脾和健胃功效[1-2]。除了豐富的油脂含量外，油莎豆中還含有多種營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、膳食纖維、可溶性糖等，目前國內(nèi)外對油莎豆飲料的加工利用報道很多，油莎豆酒[3]、油莎豆保健乳[4-5]、復(fù)合型油莎豆植物蛋白飲料[6-8]等已成為大眾健康食品的系列產(chǎn)品，油莎豆乳的生產(chǎn)主要依據(jù)植物蛋白飲料的典型磨漿、煮制工藝[9]，但是，制漿方式和具體的工藝條件（豆水比、磨漿溫度、時間等）不同使得豆乳產(chǎn)品在口感、風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)等方面有所差異[10]，為規(guī)范油莎豆乳加工行業(yè)生產(chǎn)和質(zhì)控，研究油莎豆乳內(nèi)在成分的快速檢測和在線監(jiān)測技術(shù)是非常必要的。

近紅外光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用在液態(tài)食品成分分析和定性判別等方面[11-13]，但目前在植物蛋白飲料類中的應(yīng)用研究還較少，本課題組已完成了基于近紅外光譜技術(shù)的大豆豆乳的摻假檢測研究[14]，證明近紅外光譜技術(shù)在植物蛋白類飲料產(chǎn)品中的應(yīng)用是可行的；蛋白質(zhì)含量和總固形物含量是植物蛋白飲料的重要質(zhì)量指標，本實驗根據(jù)前期的研究基礎(chǔ)，采用不同的制漿工藝，擴大建模樣品集的范圍，擬建立油莎豆乳蛋白質(zhì)含量和總固形物含量的近紅外定標模型，為油莎豆蛋白飲料行業(yè)的標準化、規(guī)范化提供一定的理論技術(shù)支撐。

在調(diào)制植物蛋白飲料的生產(chǎn)中，因需添加糖、酸等輔料進行調(diào)配，產(chǎn)品中總固形物含量會有所變化，蛋白質(zhì)含量不發(fā)生變化[15]，因此，植物蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量常作為最主要的評價指標，在近紅外光譜分析中，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的測量準確性直接關(guān)系到模型的性能[16]，所以在建立油莎豆乳中蛋白質(zhì)含量近紅外模型時，本實驗擬采用兩種公認的測定方法（凱氏定氮法、考馬斯亮藍法）測定油莎豆乳的蛋白質(zhì)含量，分別建立模型并進行性能分析，確定近紅外快速分析油莎豆乳蛋白質(zhì)的適宜化學(xué)測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油莎豆原料：購于超市，產(chǎn)地為河北、遼寧兩地。采用不同制漿工藝條件，實驗共制備100個樣品（70個作為校正集，30個作為驗證集），將樣品按照順序依次編號，供光譜和化學(xué)值的測定；實驗所需的化學(xué)試劑（牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、硫酸、硫酸銅等）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；凱氏定氮高效催化劑：北京金元興科科技有限公司。

FN311M型近紅外光譜儀 博爾儀器儀表（天津）有限公司；UV2700紫外可見雙光束掃描分光光度計 日本島津公司；LY2102C電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；SUS304打磨機 飛利浦集團有限公司；K-350/355凱氏定氮儀 瑞士Buchi有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油莎豆乳的制作工藝

在除雜干凈后的脫皮油莎豆中加入豆質(zhì)量3～4倍的水，水溫35～40 ℃，浸泡10 h左右，浸泡至豆的內(nèi)芯脹潤充分，即可撈出控干水分。實驗為了擴大油莎豆乳樣品內(nèi)在成分含量的分布范圍，將濕油莎豆與水的磨漿比例設(shè)置為16個區(qū)間（1∶5，1∶6，…，1∶20），其中每個區(qū)間內(nèi)均按照1∶x，1∶（x+0.2），1∶（x+0.4），1∶（x+0.6），1∶（x+0.8）（其中x=5，6，…，20）的順序制備5個油莎豆乳樣品，且隨機設(shè)定3個樣品采用生漿工藝制備，2個樣品采用熟漿工藝制備，具體制漿工藝流程如下：

生漿工藝：挑選→浸泡→清洗→磨漿→過濾→煮沸5 min→調(diào)制→油莎豆乳。

熟漿工藝：挑選→浸泡→清洗→磨漿→帶渣煮沸5 min→過濾→調(diào)制→油莎豆乳。

1.2.2 理化指標參照值的測定

依據(jù)GB 5009.5—2016中凱氏定氮法和考馬斯亮藍G-250法[17-18]分別進行油莎豆乳蛋白質(zhì)含量的測定，對油莎豆乳中總固形物含量的測定按照GB/T 30885—2014中常壓干燥法測定油莎豆乳中水分含量，再折算成總固形物含量。

1.2.3 近紅外透射光譜的測定

采用博爾儀器儀表（天津）有限公司提供的FN311M型近紅外光譜儀采集光譜數(shù)據(jù)，該分析儀是基于傅里葉變換的MEMS技術(shù)開發(fā)的，其信噪比高、分辨率高，可進行微量物質(zhì)檢測研究，測試參數(shù)：光譜掃描范圍1 200～2 600 nm，掃描次數(shù)32次，光譜分辨率8 nm，參比背景為儀器內(nèi)置自動背景，采集樣品方式為透射式，在室溫（25 ℃左右）下用微量進樣器移取1 mm油莎豆乳樣液于比色皿中，采點間隔為1.29 nm，進行全光譜采集，每個樣品掃描3次，以平均光譜作為樣品光譜。

1.2.4 光譜數(shù)據(jù)的處理

將采集的光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Unscrambler 6.1 軟件中，首先利用多種光譜預(yù)處理方法對光譜背景、信號分離等進行處理，確定最佳的預(yù)處理方法和光譜波段[19-20]，然后利用偏最小二乘法（partial least squares，PLS）[21-22]對光譜數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理并建立模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化實測值的方差分析

按照油莎豆乳產(chǎn)品的典型制備工藝，共制備156個油莎豆乳樣品，在剔除個別異常點的基礎(chǔ)上，保留150個樣品數(shù)據(jù)，隨機選取30個樣品作為獨立測試集不參與數(shù)據(jù)建模。采用濃度梯度法，最終選取90個樣品作為校正集，30個樣品作為驗證集；采用公認的化學(xué)測定方法測得理化數(shù)值，并進行簡單的統(tǒng)計分析，具體結(jié)果見表1。

由表1可知，校正集和驗證集樣品的蛋白質(zhì)含量和總固形物含量基本涵蓋當(dāng)前油莎豆乳生產(chǎn)中可能出現(xiàn)的蛋白質(zhì)含量和總固形物含量的變化范圍， 并且驗證集樣品的蛋白質(zhì)含量和總固形物含量范圍都在校正集范圍內(nèi)，說明樣品具有一定的代表性，可以保證所建模型的可靠性。

實驗分別采用考馬斯亮藍法和凱氏定氮法測得蛋白質(zhì)含量，由于它們最終測定的蛋白質(zhì)類型有所不同，考馬斯亮藍法測定真蛋白質(zhì)含量，凱氏定氮法主要測定粗蛋白含量，所以利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件Duncan新復(fù)極差法對兩種測定方法的差異性進行了方差分析，結(jié)果表明兩者差異不顯著，這與董娜等[23]的研究結(jié)果一致。

2.2 光譜預(yù)處理方法的確定

光譜信號預(yù)處理包含分析檢測與放大校正、濾波與背景扣除、信號分離等手段，可采用硬件和軟件兩種手段進行處理和校正，最重要的信號處理方法有變換、平滑、相關(guān)、卷積、微分和積分[24-26]。為了減少無關(guān)因素對建模效果的影響，本實驗分別用S-G平滑法、標準正態(tài)變量變換（SNV）、多元散射校正（MSC）、一階微分（FD）、二階微分（SD）5種預(yù)處理方法對光譜進行處理。不同光譜預(yù)處理方法對油莎豆乳蛋白質(zhì)含量、總固形物含量校正模型的影響見表2。

由表2可知，油莎豆乳的蛋白質(zhì)含量、總固形物含量光譜分別經(jīng)過幾種預(yù)處理后，3種成分近紅外模型 Rc均在0.9以上，RMSECV 較小，模型的精度較理想，其中平滑S-G+二階導(dǎo)數(shù)處理后，模型的Rc最大，RMSECV 最小，模型的精度最高；處理后的光譜信息清晰，結(jié)果見圖1。

2.3 光譜建模區(qū)域的選擇

光譜建模范圍的優(yōu)化選擇是提高建模精度的一種手段，采用全光譜計算時，計算工作量很大，有些光譜區(qū)域樣品的光譜信息很弱，與樣品的組成或性質(zhì)間缺乏相關(guān)關(guān)系，為了找出最有效的光譜區(qū)域，可以將測定的組分或性質(zhì)數(shù)據(jù)與樣品的光譜數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，求出相關(guān)系數(shù)，并得到相關(guān)系數(shù)與波長的相關(guān)圖，通過相關(guān)圖選出較大相關(guān)系數(shù)的光譜區(qū)域[27-28]。

根據(jù)上述分段建模思想，分析樣品原始和二階的光譜特征，本實驗選取全光譜、1 200～1 800 nm 和1 800～2 600 nm 3段光譜區(qū)域為建模的譜區(qū)，首先對光譜數(shù)據(jù)進行平滑S-G、二階求導(dǎo)處理，然后采用PLS法分別進行分段和全光譜校正模型的建立，結(jié)果見表3。

由表3可知，利用1 200～1 800 nm光譜建立的校正模型的相關(guān)系數(shù)分別為0.964 4，0.949 1，0.929 0，高于其他兩段光譜建立的模型，說明油莎豆乳內(nèi)在成分在1 200～1 800 nm波段光譜的信息表達充分，這主要是因為糖類的O—H基團伸縮振動的二級倍頻吸收帶在1 440 nm附近，蛋白質(zhì)的N—H基團伸縮振動的二級倍頻吸收帶在1 510 nm附近，淀粉內(nèi)氫鍵（O—H）的伸縮振動二級倍頻吸收帶在1 540 nm附近[29-30]，油莎豆乳中主要的水溶性成分在該波譜范圍內(nèi)均有明顯的二級倍頻吸收；而光譜范圍大于2 000 nm后，由于O—H、N—H等基團的不對稱振動、變形振動，使光譜攜帶的信息復(fù)雜化，表現(xiàn)出來的建模效果劣于1 200～1 800 nm段光譜，因此本實驗確定1 200～1 800 nm光譜區(qū)域為最佳的蛋白質(zhì)含量、總固形物含量建模光譜區(qū)。

2.4 潛在變量數(shù)量的選擇

主成分數(shù)量的選擇影響PLS法構(gòu)建定量校正模型的性能，主成分數(shù)量太多會出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，數(shù)量太少會導(dǎo)致建模信息不全，模型的預(yù)測性能下降。本實驗采用留一法交叉驗證（leave-one-out cross validation）主成分分析方法確定主成分數(shù)量，當(dāng)考馬斯亮藍法蛋白質(zhì)校正模型的主成分數(shù)量為9時，前9個主成分的數(shù)據(jù)累計方差貢獻率達 99.30%，對應(yīng)的交互驗證均方根誤差（RMSECV）數(shù)值最小（見圖2），其數(shù)值趨于穩(wěn)定；最終確定考馬斯亮藍法蛋白質(zhì)含量、凱氏定氮法蛋白質(zhì)含量、總固形物含量3個校正模型的最佳主成分數(shù)含量分別為9，10，9。

2.5 模型的建立

為了提高模型的檢測精度，去除首尾處噪聲，建模選取1 200～1 800 nm光譜區(qū)間，采用平滑S-G+二階導(dǎo)預(yù)處理，利用偏最小二乘法進行回歸分析，主成分數(shù)量分別為9，10，9，分別建立了油莎豆乳的蛋白質(zhì)含量和總固形物含量的校正模型，一個優(yōu)秀的近紅外模型除了模型自身相關(guān)性要較高之外，還要具備較好的預(yù)測性能，在實際應(yīng)用中后者往往尤為重要。因此，實驗利用已建立的數(shù)學(xué)模型分別對30個驗證集樣品進行預(yù)測，根據(jù)預(yù)測結(jié)果的可靠性來分析模型的預(yù)測性能，蛋白質(zhì)含量和總固形物含量的驗證結(jié)果見圖3。

由圖3中a、b、c可知，蛋白質(zhì)含量和總固形物含量校正模型的內(nèi)部驗證結(jié)果均較好，相關(guān)系數(shù)均達到0.9以上，驗證均方根誤差也較低。

2.6 模型預(yù)測的性能分析

為了進一步驗證構(gòu)建的蛋白質(zhì)含量和總固形物含量定標模型的預(yù)測能力和應(yīng)用性能， 將30個獨立預(yù)測樣品帶入蛋白質(zhì)和總固形物模型中，對模型的精準性和穩(wěn)定性進行驗證，結(jié)果見圖 4。

由圖4可知，3個定量模型給出的近紅外預(yù)測值與參考值十分接近，變化趨勢基本保持一致，殘差和較?。ń咏?），表明在一定的樣品分布范圍內(nèi)，采用NIRS可以成功預(yù)測油莎豆乳內(nèi)在蛋白質(zhì)含量和總固形物含量的變化，滿足實際生產(chǎn)中未知油莎豆乳樣品檢測的精準度要求。通過對2個蛋白質(zhì)含量定標模型的預(yù)測能力進行差異性分析，結(jié)果見表4?？捡R斯亮藍法和凱氏定氮法對30個驗證集樣品的預(yù)測結(jié)果差異不顯著，即兩種方法建立的蛋白質(zhì)模型性能均較好，達到實際應(yīng)用的要求；因此，考慮到測定的方便性和節(jié)省時間等特點，本實驗推薦考馬斯亮藍法作為蛋白質(zhì)含量定標模型的化學(xué)測定方法。

3 結(jié)論與討論

本研究使用近紅外光譜儀對不同濃度的油莎豆乳進行光譜掃描，通過化學(xué)計量軟件進行光譜預(yù)處理方法篩選，利用分段建模思想確定最佳建模光譜區(qū)間，采用留一法交叉驗證主成分分析方法確定最佳的主成分數(shù)量，確定二階導(dǎo)數(shù)＋S-G平滑預(yù)處理結(jié)合PLS建模方法可以有效地對外界干擾做出補償，構(gòu)建了油莎豆乳蛋白質(zhì)含量和總固形物含量的近紅外透射光譜數(shù)學(xué)模型，結(jié)果顯示所建立的定標模型預(yù)測相關(guān)系數(shù)均達到0.9以上，預(yù)測均方根誤差也較低；對驗證集樣品進行預(yù)測，結(jié)果顯示預(yù)測相關(guān)系數(shù)、預(yù)測均方根誤差均較理想，對獨立預(yù)測集樣品進行預(yù)測，殘差分布圖表明模型預(yù)測能力較理想，綜上所述，模型能夠較準確地預(yù)測油莎豆乳預(yù)測集樣品的蛋白質(zhì)含量和總固形物含量，預(yù)測性能較好。

植物蛋白飲料市場發(fā)展?jié)摿薮?，因其成分?fù)雜檢測難度較大，目前油莎豆乳的成分快速定量分析檢測研究的報道還不常見，使用近紅外光譜技術(shù)可以有效地對其進行定量分析，為油莎豆乳產(chǎn)品的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了質(zhì)量控制和定量檢測的技術(shù)支撐。

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