保加利亞乳桿菌預(yù)處理制備液態(tài)黑蒜技術(shù)研究

摘要：文章研究了保加利亞乳桿菌預(yù)處理制備液態(tài)發(fā)酵黑蒜技術(shù)。以新鮮大蒜為原料，在180 ℃高溫下分別對(duì)大蒜瓣進(jìn)行9，10 min蒜氨酸酶滅活，將滅活后的蒜瓣處理成粒徑為4 mm的顆粒，加水至液料比為4∶1，添加保加利亞乳桿菌比例為4%、5%、6%，室溫下共存16，24，32 h，于恒溫80 ℃發(fā)酵制備液態(tài)黑蒜，以未添加保加利亞乳桿菌的大蒜制備的液態(tài)黑蒜為參照（簡(jiǎn)稱未處理），考察共存時(shí)間、保加利亞乳桿菌比例和滅酶時(shí)間對(duì)液態(tài)黑蒜品質(zhì)的影響。液態(tài)黑蒜制備的最優(yōu)條件為高溫180 ℃、蒜氨酸酶滅活10 min、保加利亞乳桿菌比例6%、共存時(shí)間32 h、發(fā)酵時(shí)間18 d，此時(shí)總酸含量為48.48 g/kg，氨基酸態(tài)氮含量為7.79 g/100 g，還原糖含量為44.61 g/100 g，褐變值為62.49，總酚含量為8.779 mg/g，DPPH·、·OH清除率分別為66.92%、45.97%，相比于未處理的液態(tài)黑蒜，總酸含量是其3.88倍，氨基酸態(tài)氮含量是其1.41倍，還原糖含量是其2.23倍，褐變度是其1.31倍，總酚含量是其1.48倍，DPPH·、·OH清除率分別是其1.40倍和1.15倍。保加利亞乳桿菌預(yù)處理制備液態(tài)黑蒜技術(shù)可以提升黑蒜的品質(zhì)，縮短黑蒜的發(fā)酵時(shí)間，具有較廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：液態(tài)發(fā)酵黑蒜；蒜氨酸酶；預(yù)處理；保加利亞乳桿菌；品質(zhì)指標(biāo)；共存時(shí)間；添加比例

中圖分類號(hào)：TS201.3""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)：1000-9973（2024）11-0127-09

Study on Preparation Technology of Liquid Black Garlic by

Pretreatment with Lactobacillus bulgaricus

JIA Qing-chao1， DIAO Wei1， LI Ke-ying1， LI Meng1， LI Qing-wei2，

ZHANG Dan2， WANG Chong-hua2*

（1.School of Food Science and Engineering， Zhengzhou University of Science and Technology，

Zhengzhou 450064， China; 2.Henan Vocational College of Agriculture，

Zhengzhou 451450， China）

Abstract： In this paper， the preparation technology of liquid fermented black garlic by pretreatment with Lactobacillus bulgaricus is studied. With fresh garlic as the raw material， garlic cloves are inactivated with alliinase at a high temperature of 180 ℃ for 9，10 min respectively. The inactivated alliinase cloves are processed into particles with a diameter of 4 mm. Water is added until the liquid-solid ratio is 4∶1， and the proportion of Lactobacillus bulgaricus is 4%， 5%， 6%. Garlic and Lactobacillus bulgaricus coexist at room temperature for 16， 24， 32 h， and then they are fermented at a constant temperature of 80 ℃ to prepare liquid black garlic. Using liquid black garlic prepared with garlic without adding Lactobacillus bulgaricus as the reference （referred to untreated group）， the effects of coexistence time， proportion of Lactobacillus bulgaricus and enzyme inactivation time on the quality of liquid black garlic are investigated. The optimal conditions for preparation of liquid black garlic are as follows： alliinase is inactivated at a high temperature of 180 ℃ for 10 min， the proportion of Lactobacillus bulgaricus is 6%， the coexistence time is 32 h and the fermentation time is 18 d. At this time， the total acid content is 48.48 g/kg， amino" acid nitrogen content is 7.79 g/100 g， the reducing sugar content is 44.61 g/100 g， the browning value is 62.49， the total phenolic content is 8.779 mg/g， the DPPH·，·OH scavenging rates are 66.92%， 45.97% respectively. Compared with untreated liquid black garlic， the total acid content is 3.88 times， the amino acid nitrogen content is 1.41 times， the reducing sugar content is 2.23 times， the browning degree is 1.31 times， the total phenolic content is 1.48 times， and the DPPH · and · OH scavenging rates are 1.40， 1.15 times respectively. The preparation technology of liquid black garlic by pretreatment with Lactobacillus bulgaricus can improve the quality of black garlic， shorten the fermentation time of black garlic， and has broad application prospects.

Key words： liquid fermented black garlic; alliinase; pretreatment; Lactobacillus bulgaricus; quality indexes; coexistence time; addition proportion

收稿日期：2024-06-06

基金項(xiàng)目：河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)研究項(xiàng)目（24B550021）；2022年度鄭州科技學(xué)院研究項(xiàng)目（XJKY08）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大宗糧食加工實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（DZLS201704）；河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院校級(jí)科研團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（HNACKT202302）

作者簡(jiǎn)介：賈慶超（1981—），男，副教授，碩士，研究方向：發(fā)酵制品。

*通信作者：王崇華（1981—），男，講師，碩士，研究方向：農(nóng)作物。

黑蒜是新鮮大蒜在高溫高濕的環(huán)境下加工而成的一種無(wú)辛辣刺激感、口味酸甜的大蒜深加工食品，具有促進(jìn)糖尿病人體質(zhì)恢復(fù)、防治流感、增強(qiáng)免疫力、抗癌、抗疲勞、抗衰老、防血栓等功效[1-3]。黑蒜的加工工藝分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黑蒜的研究和生產(chǎn)主要集中于固體發(fā)酵，具有溫度高、時(shí)間長(zhǎng)、有一定的蒜臭味、主要品質(zhì)指標(biāo)受限制等劣勢(shì)[4-6]。相比于固態(tài)發(fā)酵，液態(tài)發(fā)酵黑蒜因具有加工時(shí)間短、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高和生物活性成分含量高等優(yōu)點(diǎn)而備受研究者的青睞[7]，但目前液態(tài)黑蒜仍存在品質(zhì)指標(biāo)提升有限、工藝繁瑣等缺點(diǎn)[8-9]。

近年來(lái)，利用微生物預(yù)處理制備黑蒜成為新的研究熱點(diǎn)。Si等[10]利用保加利亞乳桿菌預(yù)處理新鮮大蒜制備固體黑蒜，不僅提升了黑蒜的抗氧化性，而且具有更好的預(yù)防妊娠期糖尿病的功效。Ro等[11]利用分離的3種乳酸菌發(fā)酵黑蒜提取液，發(fā)現(xiàn)乳酸菌可提升提取液中S-烯丙基半胱氨酸等活性物質(zhì)的含量。但由于大蒜破碎后，其含有的蒜氨酸酶可將蒜氨酸轉(zhuǎn)化成具有滅菌作用的大蒜素，所以目前將乳酸菌直接用于制備液態(tài)黑蒜的想法受到阻礙。但Kim等[12]研究表明，將新鮮大蒜于高溫（180 ℃）預(yù)處理一定時(shí)間使蒜氨酸酶失活后，破碎的大蒜可與乳酸菌共存，且共存可使大蒜的抗氧化性等品質(zhì)指標(biāo)得到提升?；谶@個(gè)思路，作者前期做了嗜熱鏈球菌預(yù)處理制備液態(tài)黑蒜的研究，取得了一定的成果[13]。因此，本研究制備液態(tài)黑蒜方案為首先將新鮮大蒜瓣在高溫180 ℃下預(yù)處理9，10 min，而后破碎成粒徑為4 mm左右的液態(tài)大蒜，按液料比為4∶1（水∶大蒜，質(zhì)量比）加入水，再加入一定量的保加利亞乳桿菌，共存一定時(shí)間改變大蒜的品質(zhì)，然后于80 ℃恒溫發(fā)酵箱中制備液態(tài)黑蒜，以未添加保加利亞乳桿菌制備的液態(tài)黑蒜為參比（簡(jiǎn)稱未處理），考察保加利亞乳桿菌預(yù)處理制備液態(tài)大蒜技術(shù)，為乳酸菌預(yù)處理制備液態(tài)黑蒜的研究提供了數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大蒜：邳州徐新食品有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、焦性沒(méi)食子酸、亞硝酸鈉、亞鐵氰化鉀、無(wú)水葡萄糖、硫酸亞鐵七水合硫酸鋅、無(wú)水亞硫酸鈉、氫氧化鈉、無(wú)水碳酸鈉：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；福林酚（1 mol/L）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；MRS瓊脂：上海沃凱生物技術(shù)有限公司；3，5-二硝基水楊酸、甲醛、苯酚：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉、鄰菲啰啉、無(wú)水乙醇、過(guò)氧化氫：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH·）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KL04A臺(tái)式離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；HH-6S電熱恒溫水浴鍋、DHG-9023A恒溫發(fā)酵箱 無(wú)錫瑪瑞特科技有限公司；UV-3000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 奧譜天成（夏門(mén)）科技有限公司；KQ-5200DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；PHS-2F pH計(jì) 上海微川精密儀器有限公司；CR-10 Plus色差儀 柯尼卡美能達(dá)光學(xué)儀器（上海）有限公司；SQ-ZL立式壓力蒸汽滅菌器 河南省三強(qiáng)醫(yī)療器械有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 液態(tài)黑蒜發(fā)酵工藝流程

選取新鮮大蒜→去皮→清洗→去根蒂→蒜氨酸酶滅活（180 ℃）→蒜瓣破碎→裝罐→加水→加輔料（保加利亞乳桿菌）→室溫放置→80 ℃恒溫發(fā)酵→成品[13]。

操作要點(diǎn)：選取新鮮、無(wú)破損、無(wú)變質(zhì)的大蒜，去皮，清洗，去除根蒂，于高溫（180 ℃）下滅活蒜氨酸酶，處理時(shí)間分別為8，9，10 min，然后破碎成粒度為4 mm的蒜粒，裝罐，按液料比4∶1加入水，并加入4%、5%和6%保加利亞乳桿菌（以原料質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)），在室溫下分別共存16，24，32 h，與未添加保加利亞乳桿菌處理的大蒜于80 ℃恒溫恒濕發(fā)酵箱中發(fā)酵。每3 d取一定量的發(fā)酵黑蒜，測(cè)定還原糖含量、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量、總酚含量、褐變度及抗氧化活性等指標(biāo)，探究保加利亞乳桿菌比例對(duì)液態(tài)黑蒜發(fā)酵品質(zhì)的影響。

1.3.2 大蒜中蒜氨酸酶滅活時(shí)間的研究

將新鮮蒜瓣放入滅菌的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入烘箱中，在180 ℃下分別滅活蒜氨酸酶8，9，10 min，在紫外操作臺(tái)上冷卻至室溫，放入滅菌的研缽內(nèi)研磨成小顆粒（直徑1～4 mm），準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品于培養(yǎng)皿中，及時(shí)倒入15～20 mL MRS瓊脂培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后分別吸取1 mL 10-5，10-6稀釋度的保加利亞乳桿菌菌液于大蒜培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使其混合均勻，放置10 min后，將平板反轉(zhuǎn)，于36 ℃下恒溫培養(yǎng)16，24，32 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.3 液態(tài)發(fā)酵黑蒜品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定方法

參考于蒙娜[14]的方法測(cè)定液態(tài)黑蒜發(fā)酵中總酸含量；參考GB 5009.235—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中的方法測(cè)定液態(tài)發(fā)酵黑蒜中氨基酸態(tài)氮含量[15]；采用DNS法測(cè)定還原糖含量[16]，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.021X+0.002，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8；根據(jù)Li等[17]的方法，使用色差計(jì)測(cè)量大蒜發(fā)酵過(guò)程中的褐變程度：ΔE=[（L—L0）2+（a—a0）2+（b-b0）2]1/2，式中：L、a、b分別為色差計(jì)的測(cè)定值，L0、a0、b0分別為未處理的大蒜的測(cè)定值；根據(jù)福林酚法[18]測(cè)定液態(tài)黑蒜發(fā)酵中的總酚含量，沒(méi)食子酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=125.552X+0.028 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 2；參考何軍波等[19]的方法測(cè)定液態(tài)黑蒜的DPPH·和·OH清除率。

1.4 發(fā)酵終點(diǎn)的判斷

結(jié)合黑蒜的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Q/YLY 0001S—2021、Q/SJC 0001S—2010、Q/STY 0001S—2013、Q/SHD 0001S—2011等，并參考趙雪晴等[20]對(duì)黑蒜的研究結(jié)果，制定黑蒜的發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)：還原糖含量≥25 g/100 g，總酚含量≥8 mg/g，氨基酸態(tài)氮含量≥5 g/100 g。參考前期研究結(jié)果[13]，當(dāng)總酸含量為30～40 g/kg時(shí)，黑蒜酸甜適中，口感良好，黑蒜發(fā)酵成熟。低于30 g/kg或高于40 g/kg時(shí)，黑蒜酸甜比例不當(dāng)，口感較差；褐變程度ΔE＞60時(shí)，黑蒜發(fā)酵完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，使用Origin 2018軟件繪制折線圖。

2 結(jié)果分析

2.1 滅活時(shí)間對(duì)保加利亞乳桿菌菌落生長(zhǎng)的影響

由表1可知，共存16 h、滅活8 min無(wú)菌落產(chǎn)生，滅活9 min和10 min有一定菌落產(chǎn)生，與8 min差異顯著；共存24，32 h、滅活8，9，10 min均有菌落產(chǎn)生，滅活9，10 min的菌落總數(shù)差異不顯著（Pgt;0.05），二者顯著大于滅活8 min的菌落總數(shù)（Plt;0.05），大蒜中蒜氨酸在蒜氨酸酶的作用下產(chǎn)生蒜素，抑制了保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)，所以滅活蒜氨酸酶8 min的效果不如滅活9，10 min。而用未滅酶大蒜作培養(yǎng)基時(shí)，共存16，24，32 h均無(wú)菌落產(chǎn)生。所以，本研究將9，10 min作為滅活蒜氨酸酶的研究時(shí)間，分別將180 ℃高溫滅酶后的大蒜按黑蒜發(fā)酵步驟加入4%、5%、6%的保加利亞乳桿菌，于室溫下共存16，24，32 h，再于80 ℃恒溫發(fā)酵箱內(nèi)發(fā)酵制備液態(tài)黑蒜，以未添加保加利亞乳桿菌的黑蒜作為參比（下文簡(jiǎn)稱未處理），每隔一定時(shí)間取出黑蒜樣品測(cè)定其品質(zhì)指標(biāo)，考察保加利亞乳桿菌預(yù)處理對(duì)液態(tài)黑蒜品質(zhì)指標(biāo)的影響。

2.2 總酸含量

滅活9，10 min時(shí)，不同共存時(shí)間下保加利亞乳桿菌比例對(duì)黑蒜總酸含量的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，在不同的滅活、共存時(shí)間下，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，不同保加利亞乳桿菌添加比例下液態(tài)黑蒜中總酸含量基本上都呈先升高后趨于平緩的趨勢(shì)，且不同比例保加利亞乳桿菌的發(fā)酵黑蒜總酸含量均大于未被處理的發(fā)酵黑蒜總酸含量。在3～15 d時(shí)黑蒜總酸含量增加緩慢，在15～27 d時(shí)總酸含量增加較快，在發(fā)酵27 d左右時(shí)總酸含量達(dá)到最高且趨于平緩。滅活9 min、共存16，24，32 h時(shí)，總酸含量達(dá)到30 g/kg左右所需時(shí)間最短的是保加利亞乳桿菌比例分別為6%、5%、6%，所需時(shí)間分別為21，18，15 d，且共存32 h時(shí)，保加利亞乳桿菌比例為6%的黑蒜發(fā)酵18 d時(shí)，總酸含量為41.28 g/kg。滅活10 min、共存16，24，32 h時(shí)，總酸含量達(dá)到30 g/kg左右所需時(shí)間最短的是保加利亞乳桿菌比例分別為5%、5%、6%，所需時(shí)間分別為18，18，12 d，且共存32 h時(shí)，保加利亞乳桿菌比例為6%的黑蒜發(fā)酵18 d時(shí)，總酸含量為48.48 g/kg。故當(dāng)滅活時(shí)間為9，10 min時(shí)，共存32 h是較優(yōu)條件，且滅活10 min時(shí)黑蒜發(fā)酵速率更快，是此時(shí)較適宜的滅活時(shí)間。于蒙娜[14]在黑蒜液態(tài)發(fā)酵工藝中，80 ℃下發(fā)酵黑蒜的總酸含量大于30 g/kg時(shí)，所需發(fā)酵時(shí)間為18 d，遠(yuǎn)大于本研究的12 d，由此可知添加保加利亞乳桿菌有利于發(fā)酵黑蒜，且蒜氨酸酶滅活10 min、保加利亞乳桿菌比例6%、室溫共存時(shí)間32 h條件下（設(shè)為 B1）的黑蒜發(fā)酵速率較快，同時(shí)以上分析也說(shuō)明保加利亞乳桿菌預(yù)處理可以縮短黑蒜的發(fā)酵時(shí)間，加快黑蒜發(fā)酵。

2.3 氨基酸態(tài)氮含量

滅活9，10 min時(shí)，不同共存時(shí)間下保加利亞乳桿菌比例對(duì)黑蒜氨基酸態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，在不同的滅活和共存時(shí)間下，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，不同保加利亞乳桿菌比例下液態(tài)黑蒜的氨基酸態(tài)氮含量基本上都是先升高后降低，說(shuō)明在黑蒜發(fā)酵開(kāi)始一段時(shí)間內(nèi)，蛋白質(zhì)分解成氨基酸的速率大于美拉德反應(yīng)消耗氨基酸的速率，而發(fā)酵到一定程度后，前者速率小于后者速率[21]。添加不同比例保加利亞乳桿菌的發(fā)酵黑蒜的氨基酸態(tài)氮含量均大于未被處理的發(fā)酵黑蒜。滅活9 min、共存時(shí)間為16，24，32 h時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到5 g/100 g左右所需時(shí)間最短的是保加利亞乳桿菌比例分別為4%、6%、6%，所需時(shí)間均為12 d，氨基酸態(tài)氮含量分別為4.96，5.03，5.2 g/100 g。滅活10 min、共存時(shí)間16，24，32 h時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到5 g/100 g左右所需時(shí)間最短的是保加利亞乳桿菌比例分別為6%、5%、6%，所需時(shí)間均為12 d，氨基酸態(tài)氮含量分別為5.38，5.65，6.30 g/100 g。綜合以上分析，滅活10 min、共存時(shí)間32 h、保加利亞乳桿菌添加量6%是較優(yōu)條件（設(shè)為B2），此時(shí)液態(tài)黑蒜發(fā)酵速率較快，此條件下氨基酸態(tài)氮含量最高，為8.58 g/100 g。賈慶超等[22]研究了蒸汽預(yù)處理對(duì)黑蒜品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)液態(tài)黑蒜的氨基酸態(tài)氮含量最高值小于8 g/100 g；唐仕榮等[23]在研究發(fā)酵大蒜加工過(guò)程中功能物質(zhì)與抗氧化活性的變化中發(fā)現(xiàn)，在70 ℃環(huán)境下發(fā)酵得到的氨基酸態(tài)氮最高值為2.012 g/100 g，與保加利亞乳桿菌預(yù)處理制備液態(tài)黑蒜得到的氨基酸態(tài)氮含量相差較大，說(shuō)明保加利亞乳桿菌能夠進(jìn)一步促進(jìn)液態(tài)黑蒜中氨基酸態(tài)氮含量的增加，促進(jìn)液態(tài)黑蒜發(fā)酵。

2.4 還原糖含量

還原糖是大蒜發(fā)生美拉德反應(yīng)的重要底物，其還原糖含量不僅影響黑蒜在發(fā)酵過(guò)程中褐變的速率，而且影響其口感。黑蒜中影響還原糖含量的因素有兩個(gè)：一是保加利亞乳桿菌具有胞外果聚糖水解酶活性[24]，促進(jìn)大蒜多糖的水解，影響還原糖含量，同時(shí)大蒜中淀粉酶和果聚糖聚合酶等發(fā)生酶解作用使多糖分解成單糖和雙糖，增加了黑蒜中還原糖含量[8]；二是發(fā)酵過(guò)程中美拉德反應(yīng)消耗還原糖，使液態(tài)黑蒜中還原糖含量下降[22]。滅活9，10 min時(shí)，不同共存時(shí)間下保加利亞乳桿菌比例對(duì)還原糖含量的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在不同的滅活和共存時(shí)間下，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，不同保加利亞乳桿菌比例下液態(tài)黑蒜還原糖含量基本上都是先升高后趨于平緩，且添加不同比例保加利亞乳桿菌的發(fā)酵黑蒜的還原糖含量均大于未處理的。滅活時(shí)間9 min、共存時(shí)間為16，24，32 h時(shí)，還原糖含量大于25 g/100 g所需時(shí)間最短的是保加利亞乳桿菌比例分別為4%、6%、4%，所需發(fā)酵時(shí)間分別為12，9，9 d，還原糖含量分別為30.42，26.72，29.84 g/100 g，由此可知，此時(shí)較優(yōu)條件是共存32 h、保加利亞乳桿菌比例4%；滅活時(shí)間為10 min、共存時(shí)間為16，24，32 h時(shí)，還原糖含量大于25 g/100 g所需時(shí)間最短的是保加利亞乳桿菌比例均為6%，所需發(fā)酵時(shí)間分別為12，6，12 d，還原糖含量分別為31.86，27.39，32.16 g/100 g，由此可知，此時(shí)最優(yōu)條件為共存24 h、保加利亞乳桿菌比例6%，在此條件下，發(fā)酵時(shí)間為12 d時(shí)，還原糖含量為40.3 g/100 g，說(shuō)明此時(shí)發(fā)酵速率較快。綜上分析，保加利亞乳桿菌比例為6%、共存時(shí)間為24 h、蒜氨酸酶滅活10 min時(shí)（設(shè)為B3）還原糖含量較高。李超峰等[25]采用糖化變溫處理工藝，得到還原糖含量為32.14 g/100 g；崔春蘭等[26]采用5個(gè)階段發(fā)酵法制備黑蒜，黑蒜中還原糖含量為7.8 g/100 g，這兩種方法制備的黑蒜均低于本文預(yù)處理所得還原糖含量。以上數(shù)據(jù)表明，保加利亞乳桿菌的添加會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)多糖水解成還原糖，提升美拉德反應(yīng)底物濃度，增加美拉德反應(yīng)速率，有利于縮短黑蒜的制備時(shí)間。

2.5 褐變程度ΔE

大蒜在發(fā)酵過(guò)程中褐變程度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，一是由于保加利亞乳桿菌體內(nèi)果聚糖水解酶活性大[24]，加強(qiáng)美拉德反應(yīng)和大蒜中類黑精產(chǎn)生；二是在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生酶促褐變反應(yīng)和非酶促褐變反應(yīng)，從而產(chǎn)生呈褐色物質(zhì)[27]。滅活9，10 min時(shí)，不同共存時(shí)間下保加利亞乳桿菌比例對(duì)黑蒜褐變程度ΔE的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，在不同的滅活和共存時(shí)間下，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，保加利亞乳桿菌比例對(duì)液態(tài)黑蒜褐變程度的影響都是先升高后趨于平緩，液態(tài)黑蒜的褐變程度在發(fā)酵前期增加幅度較大，發(fā)酵到一定程度后增加緩慢，且添加不同比例保加利亞乳桿菌的發(fā)酵黑蒜的褐變程度均大于未處理的。滅活9 min、共存時(shí)間16 h時(shí)，5%保加利亞乳桿菌比例的黑蒜在18 d時(shí)褐變程度為60.01，4%、6%保加利亞乳桿菌比例的黑蒜在21 d時(shí)才達(dá)到60；共存24 h時(shí)，6%保加利亞乳桿菌比例的黑蒜在18 d時(shí)褐變程度為64.56，4%、5%保加利亞乳桿菌比例的黑蒜在21 d時(shí)褐變程度才達(dá)到60；共存32 h時(shí)，5%保加利亞乳桿菌比例的黑蒜在18 d時(shí)褐變程度為61.88，4%、6%保加利亞乳桿菌比例的黑蒜在21 d時(shí)才達(dá)到60；滅活10 min、共存16 h時(shí)，4%、5%、6%保加利亞乳桿菌比例的黑蒜均在21 d時(shí)褐變程度大于60；共存24 h時(shí)，4%保加利亞乳桿菌比例的黑蒜在18 d時(shí)褐變程度為60.69，而5%、6%保加利亞乳桿菌比例的黑蒜在21 d時(shí)褐變程度才達(dá)到60；共存32 h時(shí)，5%、6%保加利亞乳桿菌比例的黑蒜均在18 d時(shí)滿足發(fā)酵要求，二者褐變程度分別為60.3，62.49，而4%保加利亞乳桿菌比例的黑蒜在21 d時(shí)才大于60?；谝陨戏治觯紤]到褐變程度的大小，滅活10 min、共存32 h、保加利亞乳桿菌比例6%是較優(yōu)條件（設(shè)為B4）。

2.6 總酚含量

大蒜經(jīng)過(guò)高溫滅活蒜氨酸酶后，阻斷了大蒜中γ-谷氨酰基半胱氨酸水解，同時(shí)也氧化成細(xì)胞毒性化合物，使得γ-谷氨?；腚装彼嵩诎l(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)化成酚類物質(zhì)[22]，然后呈穩(wěn)定趨勢(shì)，其原因是乳酸菌可促進(jìn)美拉德反應(yīng)的進(jìn)行和多酚氧化酶的作用，液體發(fā)酵黑蒜的總酚含量變化明顯。滅活9，10 min時(shí)，不同共存時(shí)間下保加利亞乳桿菌比例對(duì)黑蒜總酚含量的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，在不同的滅活和共存時(shí)間下，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，不同保加利亞乳桿菌比例下液態(tài)黑蒜總酚含量都是先升高后趨于平緩，且添加不同比例保加利亞乳桿菌的發(fā)酵黑蒜的總酚含量均大于未處理的。滅活9 min、共存16，24，32 h時(shí)，液態(tài)黑蒜總酚含量達(dá)到8 mg/g左右所需時(shí)間最短的分別是保加利亞乳桿菌比例為5%、6%、6%，總酚含量分別為8.18，8.022，8.12 mg/g，所需時(shí)間分別為18，15，15 d，其中共存24，32 h，保加利亞乳桿菌比例均為6%時(shí)，第18天時(shí)總酚含量分別為8.425，8.401 mg/g。滅活10 min、共存16，24，32 h時(shí)，液態(tài)黑蒜總酚含量達(dá)到8 mg/g所需時(shí)間最短的分別為保加利亞乳桿菌比例為4%、6%、6%，總酚含量分別為8.275，8.325，8.033 mg/g，所需時(shí)間分別為18，18，12 d，而共存32 h，保加利亞乳桿菌比例為6%時(shí)，發(fā)酵液態(tài)黑蒜在第18天時(shí)總酚含量為8.779 mg/g。綜上所述，較優(yōu)條件為滅活10 min、共存時(shí)間32 h、保加利亞乳桿菌比例6%（設(shè)為B5），液態(tài)黑蒜發(fā)酵第30天時(shí)，總酚含量為10.671 mg/g，未處理黑蒜的總酚含量為8.101 mg/g，增加了30%。唐仕榮等[23]研究恒溫發(fā)酵固體大蒜，發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵黑蒜的總酚含量在發(fā)酵30 d后達(dá)到最大值，僅為3.3 mg/g左右；湯薇等[3]研究美拉德反應(yīng)液對(duì)黑蒜發(fā)酵的影響，測(cè)得黑蒜中總酚含量為2.097 mg/g。以上數(shù)據(jù)表明，保加利亞乳桿菌的添加會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)液態(tài)黑蒜中總酚含量的增加，進(jìn)而提升黑蒜的品質(zhì)指標(biāo)。

2.7 抗氧化性

2.7.1 DPPH·清除率

滅活9，10 min時(shí)，不同共存時(shí)間下保加利亞乳桿菌比例對(duì)黑蒜DPPH·清除率的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可知，在不同的滅活和共存時(shí)間下，不同保加利亞乳桿菌比例下液態(tài)黑蒜DPPH·清除率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，且添加不同比例保加利亞乳桿菌的發(fā)酵黑蒜的DPPH·清除率均大于未處理的。滅活9 min、共存16，24，32 h時(shí)，DPPH·清除率上升速率較快的是保加利亞乳桿菌比例分別為5%、5%、6%，發(fā)酵至30 d時(shí)，最大清除率分別為84.89%、86.16%、89.92%。滅活10 min、共存16，24，32 h時(shí)，DPPH·清除率上升速率較快的是保加利亞乳桿菌比例分別為6%、5%、6%，發(fā)酵至30 d時(shí)，最大清除率分別為85.69%、85.71%、87.21%。綜上所述，較優(yōu)條件是滅活9 min、共存32 h、保加利亞乳桿菌比例6%（設(shè)為B6）。王玉榮等[28]研究黑蒜的簡(jiǎn)易制備及其抗氧化活性的測(cè)定中黑蒜DPPH·清除率為77.5%；鐘成等[29]研究超高壓預(yù)處理大蒜后發(fā)酵黑蒜，發(fā)現(xiàn)保壓15 min預(yù)處理后黑蒜中DPPH·清除率為45%左右。由此可見(jiàn)，添加保加利亞乳桿菌預(yù)處理能夠提高液態(tài)黑蒜的DPPH·清除率，且比例為6%時(shí)液態(tài)黑蒜的抗氧化性更高。

2.7.2 ·OH清除率

大蒜在發(fā)酵過(guò)程中，·OH清除率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增大，其原因包括兩方面：一是黑蒜在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量的酚類、黃酮類以及多種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[30]，這些物質(zhì)都具有一定抗氧化性；二是保加利亞乳桿菌在死亡裂解后細(xì)胞內(nèi)的提取物和在代謝過(guò)程中產(chǎn)生硫化合物、半胱氨酸、還原型谷胱甘肽等抗氧化性物質(zhì)[31]。滅活9，10 min時(shí)，不同共存時(shí)間下保加利亞乳桿菌比例對(duì)黑蒜·OH清除率的影響見(jiàn)圖7。

由圖7可知，在不同的滅活和共存時(shí)間下，不同保加利亞乳桿菌比例下液態(tài)黑蒜·OH清除率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，且添加不同比例保加利亞乳桿菌的發(fā)酵黑蒜的·OH清除率均大于未處理的。滅活9 min、共存16，24，32 h時(shí)，·OH清除率上升速率較快的是保加利亞乳桿菌比例分別為5%、4%、6%，發(fā)酵至30 d時(shí)，最大清除率分別為74.88%、73.19%、71.07%。滅活10 min、共存16，24，32 h時(shí)，·OH清除率上升速率較快的是保加利亞乳桿菌比例分別為6%、5%、6%，發(fā)酵至30 d時(shí)，最大清除率分別為75.81%、77.92%、81.69%。綜上所述，較優(yōu)條件是滅活10 min、共存32 h、保加利亞乳桿菌比例6%（設(shè)為B7）。王玉榮等[28]研究黑蒜的簡(jiǎn)易制備及其抗氧化活性的測(cè)定中黑蒜中·OH清除率的最高值為78%左右；鐘成等[29]研究超高壓預(yù)處理大蒜后發(fā)酵黑蒜，發(fā)現(xiàn)保壓20 min預(yù)處理后黑蒜中·OH清除率為75%左右，由此可得滅活蒜氨酸酶利用保加利亞乳桿菌預(yù)處理的大蒜在發(fā)酵過(guò)程中·OH清除率更好，能夠提升·OH清除率。

3 結(jié)論

本研究以新鮮大蒜為原料，采用高溫滅活蒜氨酸酶促使保加利亞乳桿菌與滅活破碎的大蒜能夠共存的方法制備液態(tài)黑蒜。對(duì)文中較優(yōu)條件B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7綜合分析，液態(tài)黑蒜最優(yōu)制備條件為180 ℃蒜氨酸酶滅活10 min、保加利亞乳桿菌比例6%、共存時(shí)間32 h、液態(tài)黑蒜制備時(shí)間18 d，此時(shí)總酸含量為48.48 g/kg，氨基酸態(tài)氮含量為7.79 g/100 g，還原糖含量為44.61 g/100 g，褐變值為62.49，總酚含量為8.779 mg/g，DPPH·清除率為66.92%，·OH清除率為45.97%，未處理液態(tài)黑蒜總酸含量是其3.88倍，氨基酸態(tài)氮含量是其1.41倍，還原糖含量是其2.23倍，褐變度是其1.31倍，總酚含量是其1.48倍，DPPH·清除率和·OH清除率分別是其1.40倍和1.15倍。

該試驗(yàn)方案操作簡(jiǎn)單，加入保加利亞乳桿菌后的液體發(fā)酵黑蒜的各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)均優(yōu)于未處理的大蒜，從結(jié)果來(lái)看，保加利亞乳桿菌預(yù)處理對(duì)黑蒜的品質(zhì)指標(biāo)產(chǎn)生較大影響，可以提升黑蒜的品質(zhì)指標(biāo)，縮短黑蒜的發(fā)酵時(shí)間，具有較大應(yīng)用前景。下一步工作重點(diǎn)是探究保加利亞乳桿菌對(duì)黑蒜品質(zhì)指標(biāo)影響的原因，并進(jìn)一步研究其他種類乳酸菌對(duì)黑蒜品質(zhì)指標(biāo)的影響，探索如何將此技術(shù)應(yīng)用于黑蒜生產(chǎn)中。

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