掃描電子顯微鏡在微生物學實驗教學中的應用

摘 要 微生物學實驗是高等農(nóng)林院校生物學、林學、農(nóng)學、食品科學等專業(yè)的重要基礎課程之一。掃描電子顯微鏡是一種廣泛應用于生物學領(lǐng)域微觀形貌分析的大型精密儀器。為提升北京林業(yè)大學本科專業(yè)微生物學實驗課程教學質(zhì)量，充分激發(fā)學生的學習積極性，對掃描電子顯微鏡應用于微生物學實驗進行探索與實踐，將實驗拆分為取材、戊二醛固定、乙醇梯度脫水、叔丁醇置換100%乙醇、冷凍干燥和掃描電子顯微鏡觀察六個部分。初步構(gòu)建掃描電子顯微鏡應用于本科微生物學實驗的教學體系，旨在培養(yǎng)學生的實踐操作技能，創(chuàng)新實驗教學內(nèi)容并提高教學效果。

關(guān)鍵詞 掃描電子顯微鏡；微生物學；實驗教學；青霉

中圖分類號：G642.423 文獻標識碼：B

文章編號：1671-489X（2024）20-00-04

DOI：10.3969/j.issn.1671-489X.2024.20.040

0 引言

微生物學是全國各高等農(nóng)林院校生物科學、生物技術(shù)、農(nóng)學、林學、食品科學等本科專業(yè)的基礎課程之一，是一門實踐性很強的應用課程。微生物學是研究微生物生命活動的基本規(guī)律、生長特點、生態(tài)分布和相關(guān)基因工程的一門學科，其應用廣泛涉及發(fā)酵工程、食品安全、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域[1]。微生物學實驗技術(shù)和方法是微生物學創(chuàng)建與發(fā)展的基礎，也為整個生命科學技術(shù)的發(fā)展作出了積極而重要的貢獻。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新方法和新應用融入微生物學的教學中，構(gòu)建微生物學相關(guān)內(nèi)容與新技術(shù)、新方法相融合的課程結(jié)構(gòu)，不僅有助于豐富微生物學實驗技術(shù)的內(nèi)容，也有利于推動微生物學研究的發(fā)展[2]。微生物學實驗課程不僅能夠強化學生對微生物學理論知識的學習和掌握，還在培養(yǎng)學生的創(chuàng)新能力和實踐能力中發(fā)揮重要作用[3]。

掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Micros-

cope，SEM）是一種大型的微觀形態(tài)成像儀器，能夠用來觀察和分析材料表面的成分、形貌和結(jié)構(gòu)等，現(xiàn)已廣泛應用于材料學[4]、生物學[5]、醫(yī)學[6]、化學[7]、農(nóng)業(yè)[8]等研究領(lǐng)域。目前，以掃描電子顯微鏡觀察為代表的分子微生物學實驗技術(shù)在細菌形態(tài)觀察、細菌生長檢測、代謝產(chǎn)物精準識別、分子標記與功能基因定位等方面發(fā)揮重要的作用[9]。利用掃描電子顯微鏡技術(shù)可以對細菌、真菌組織進行顯微研究，這些結(jié)果有助于了解其潛在功能和作用機理[10]。

為提高北京林業(yè)大學本科微生物學實驗的教學質(zhì)量，充分發(fā)揮實驗教學在創(chuàng)新人才培養(yǎng)中的作用，加強學生對大型精密儀器的認知和操作能力，本研究選取北京林業(yè)大學生物科學專業(yè)基礎學科拔尖學生培養(yǎng)計劃2.0基地拔尖班學生為對象，以青霉分生孢子結(jié)構(gòu)為材料，重新設置微生物形態(tài)觀察的實踐教學內(nèi)容，在原有的基礎上增加掃描電子顯微鏡的相關(guān)知識，開展掃描電子顯微鏡應用于微生物學實驗的教學探索與實踐探析，并且改進學生實驗教學的考核和評價機制，旨在在提升學生微生物學相關(guān)實驗操作技能的同時，培養(yǎng)學生利用掃描電子顯微鏡對微生物學材料進行分析研究的能力，進而有效提高實驗教學效果和人才培養(yǎng)質(zhì)量。

1 微生物學實驗教學改革內(nèi)容設計與學時

安排

顯微鏡應用技術(shù)是高等農(nóng)林院校生物學、林學、食品科學等專業(yè)的必修課程教學內(nèi)容之一，已有近15年的教學發(fā)展歷程，主要講授光學顯微鏡的使用方法。掃描電子顯微鏡等大型儀器往往由于運營成本較高而沒有用于本科實驗教學。2023年秋季，北京林業(yè)大學微生物學教研室選擇生物科學專業(yè)的微生物學實驗課程為對象，以生物科學專業(yè)拔尖班學生為實踐對象，增加電子顯微鏡觀察技術(shù)的創(chuàng)新實驗課程。在教學過程中，教師先通過PPT以圖片、視頻或者動畫的方式向?qū)W生講述掃描電子顯微鏡的基本工作原理、儀器結(jié)構(gòu)、性能參數(shù)、樣品制備和操作方法等理論知識，為后續(xù)實驗操作的順利進行奠定堅實基礎。

掃描電子顯微鏡觀察實驗首先要選取和制備實驗材料，本實驗課程選取的材料為北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院微生物學實驗室保存的青霉（1號penicillium chrzaszczii和2號penicillium osmophilum）。

由于實驗材料制備步驟多、過程復雜，包括固定、脫水、置換、干燥、粘樣、導電處理等環(huán)

節(jié)[11]，本研究將其分為六個實驗開展：1）取材；2）戊二醛固定；3）乙醇梯度脫水；4）叔丁醇置換100%乙醇；5）冷凍干燥；6）掃描電子顯微鏡觀察。本實驗課共12學時，六個實驗分別安排1、2、2、2、2、3學時，如表1所示。

2 微生物學實驗教學改革的實踐過程

2.1 取材

生物科學專業(yè)微生物學實驗開課前，將學生分為六個小組，每組派一名學生提前五天于北京林業(yè)大學微生物學實驗室進行實驗材料的準備，具體步驟如下。

首先，把青霉1號和2號的菌株號簡化后寫于相應的無菌培養(yǎng)皿上，將熔化好的培養(yǎng)基注入該培養(yǎng)皿內(nèi)，注入量以達到在皿底形成約2 mm（因太厚不便使用）的平板為宜，培養(yǎng)基凝固后待用。

其次，在超凈工作臺上進行轉(zhuǎn)接操作，接種后置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約四天，此時分生孢子結(jié)構(gòu)正好成熟。

最后，取該帶有分生孢子結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基切一3～4 mm小條，并將切好的瓊脂塊一起放入一個無菌的小容器（如無菌培養(yǎng)皿）內(nèi)，此材料即可開始實施戊二醛固定實驗。

此外，注意切除組織的過程要快，觀察面需與長軸垂直，選擇部位準確無誤，無關(guān)部分切去，并且全程操作需保持在冰上進行，防止組織自溶。

2.2 戊二醛固定

戊二醛穿透性強，能夠使蛋白質(zhì)等成分凝固，使組織結(jié)構(gòu)或細胞形態(tài)更接近生活狀態(tài)，因此，分別將帶有不同青霉分生孢子結(jié)構(gòu)的瓊脂塊進行戊二醛固定。具體操作步驟如下。

首先，將由2.5%的戊二醛、磷酸鹽、去離子水組成，pH為7.2～7.4的戊二醛固定液放置于4 ℃

冰箱預冷。

其次，將戊二醛固定液用5 mL移液槍加入裝有分生孢子結(jié)構(gòu)瓊脂塊的無菌小容器內(nèi)，使得戊二醛固定液的厚度可以沒過該瓊脂塊。

最后，將添加戊二醛固定液的瓊脂塊放置于室溫干燥地方固定2 h后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱內(nèi)，再次固定過夜。添加試劑時注意不要澆到樣品上，以免損傷分生孢子結(jié)構(gòu)，影響電鏡觀察。

此外，在進行下一步乙醇梯度脫水前，將戊二醛用5 mL的移液槍吸凈，并將吸出的戊二醛廢液排于廢液缸中，廢液缸中的廢液于實驗結(jié)束后倒入廢液桶中，以免造成下水道水體污染，槍頭打在另一干燥的廢液缸中。

2.3 乙醇梯度脫水

青霉分生孢子材料經(jīng)過充分固定后即可開展乙醇梯度脫水實驗。脫水的具體操作過程如下。

首先，配制不同濃度梯度（30%、50%、70%、95%和100%）的乙醇溶液50 mL，盛入干凈的50 mL容積離心管中以備后續(xù)兩次脫水使用，每次使用的量需使乙醇溶液沒過樣品塊。為避免第一次乙醇用量過多致使第二次的量不足以沒過樣品塊，可以配制100 mL的乙醇溶液分裝于兩個離心管中。制備之前需在離心管上標注好乙醇濃度，以免后續(xù)實驗使用時混淆。

其次，分別用已配制好的30%、50%、70%、95%和100%的乙醇，由低至高的濃度進行梯度脫水，且同一濃度使用相同的加液方法重復脫水兩次，每個濃度處理時間均為5 min，操作過程中注意最后一次的100%乙醇不要排除。

此外，添加相同濃度的乙醇溶液時可以使用一只槍頭，添加不同濃度的溶液時需要及時更換槍頭，并且不要混淆。

2.4 叔丁醇置換100%乙醇

叔丁醇是一種傳統(tǒng)的冷凍干燥置換溶劑，具有較高的凝固點和蒸氣壓，能夠較好地保護細胞的完整性，因此常用于SEM快速制樣，并且通過叔丁醇置換進行冷凍干燥的效果優(yōu)于直接冷凍干燥。置換的具體操作過程如下。

首先，將乙醇-叔丁醇分別按3∶1、1∶1、1∶3的比例配比，并將配好的溶液裝入50 mL離心管中，標注比例備用。

其次，將青霉分生孢子組織浸沒在依次盛有乙醇-叔丁醇3∶1、1∶1、1∶3比例混合溶液的離心管中，置于室溫下進行置換，處理時間均為20 min。

最后，樣品統(tǒng)一使用100%叔丁醇進行置換（叔丁醇的厚度剛好浸沒樣品，利于后續(xù)進行冷凍干燥處理），處理時間為15 min，并重復操作本置換實驗兩次。

2.5 冷凍干燥

經(jīng)過上一步置換后，進行冷凍干燥，具體操作過程如下。

首先，將保存于適量100%叔丁醇溶液中的青霉分生孢子組織置于冰上，用保鮮膜將樣品所在的無菌小容器包裹一層，保證該樣品在冷凍干燥機的干燥過程中不會飛出來，隨后用牙簽在上面扎小孔，保證冷凍干燥時，容器內(nèi)是通氣的，以達到干燥的效果。

其次，將樣品放入-80 ℃冰箱冷凍2 h或?qū)悠贩湃?20 ℃冰箱過夜預冷。

最后，待試管中叔丁醇凍成冰晶后，按照操作流程，把樣品置于提前預冷（預冷時間30 min）的冷凍干燥機中進行干燥處理，時間為12 h，之后將干燥好的樣品按照操作流程從冷凍干燥機中取出，關(guān)閉機器和電源，注意冷凍干燥機使用前后都應在登記本上記錄使用情況。樣品保存于室溫干燥環(huán)境中。

2.6 掃描電子顯微鏡觀察

青霉分生孢子經(jīng)過取材、固定、脫水、置換、干燥后即可開展掃描電子顯微鏡觀察實驗。具體操作過程如下。

1）粘樣：按預約時間于電子顯微鏡樣品準備室將干燥的青霉分生孢子組織用導電性好的黏合劑或膠帶粘在金屬樣品臺上，粘樣時注意不要破壞樣品表面結(jié)構(gòu)，正面（帶有分生孢子結(jié)構(gòu)的一面）朝上，保證樣品粘牢，并標記好樣品組號。

2）噴金：將冷凍干燥后的青霉分生孢子組織粘于樣品臺上，在真空環(huán)境下進行濺射噴金。在濺射噴金過程中，根據(jù)具體的樣品和金屬靶材的性質(zhì)控制濺射參數(shù)，電流為15 mA，電壓為220 V，濺射時間為60 s，以保證所需的金屬涂層厚度和均勻性。濺射噴金完成后，使用電子顯微鏡檢查金屬涂層的質(zhì)量，包括涂層的均勻性、致密性等。此外，可以根據(jù)不同需求進行后續(xù)處理，如調(diào)整合適的退火溫度，以改善涂層性質(zhì)。

3）觀察：進行電子顯微鏡觀察，并保存青霉優(yōu)質(zhì)圖像，如圖1所示。

3 微生物學實驗教學結(jié)果分析

微生物學實驗是將理論知識與實際應用結(jié)合起來的課程，對于不同種類微生物的學習與認識，實驗方案的設計、實驗操作的完成都需要學生的探索與創(chuàng)新。

在微生物學實驗課程中增加掃描電子顯微鏡觀察的內(nèi)容，可以使學生對微生物的微形態(tài)特征有直觀感受，還能豐富教學內(nèi)容，開拓學生的視野，提高學生對實驗的積極性。例如，實驗一選取實驗的觀察樣品，每組由學生代表完成菌種的活化、轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)，培養(yǎng)基的制備和分生孢子組織的切除等工作，這些樣品制備環(huán)節(jié)能夠切實鍛煉學生的無菌操作能力。

按照實驗二到實驗六的順序依次進行“固定—脫水—置換—干燥—粘樣—噴金—SEM觀察”，學生必須嚴格按照該樣品制備流程進行操作，但固定液、脫水劑的配比，固定、脫水、置換的時間，冷凍干燥方法的選擇都需要學生不斷探索調(diào)整，以確定最佳的材料制備方案。

此外，進行掃描電子顯微鏡觀察時，學生需要根據(jù)樣品的特點確定噴金所用電壓、時間和SEM儀器拍照參數(shù)的設置，直至獲得清晰度高、立體感強且質(zhì)量高的青霉分生孢子結(jié)構(gòu)圖像，從而對微生物材料的超微結(jié)構(gòu)有更加深入的了解。

4 微生物學實驗課程考核

青霉的掃描電子顯微鏡觀察實驗采用課前準備、課堂展示、課后考核相結(jié)合的考核方式，其中課前準備占10%，課堂展示占20%，課后考核占70%。教學過程中，課前準備主要包括自主觀看視頻、學習知識點、查閱相關(guān)文獻資料和設計實驗方案，教學目標集中在學生的自學能力培養(yǎng)上；課堂展示包括學生的小組討論、個人發(fā)言和實驗操作三個環(huán)節(jié)，主要考查學生的實踐操作能力和團結(jié)協(xié)作能力，確保學生能夠掌握該課程的基本知識和主要技術(shù)；課后考核由實驗報告考核（60%）和期末考核（10%）兩部分組成。由于本實驗被拆分為取材、戊二醛固定、乙醇梯度脫水、叔丁醇置換100%乙醇、冷凍干燥、掃描電子顯微鏡觀察六次實驗課程，因此每次實驗課程分別 提交一次實驗報告，每次實驗報告考核占比為10%，共計60%。實驗報告重點考查學生對實驗內(nèi)容的掌握程度、對實驗過程中重要問題的解決能力和實驗結(jié)果的準確性。期末考核采用PPT匯報的形式，每小組派一名代表對青霉的掃描電子顯微鏡觀察實驗進行綜合介紹。匯報內(nèi)容包括取材、戊二醛固定、乙醇梯度脫水、叔丁醇置換100%乙醇、冷凍干燥、粘樣、噴金處理、掃描電子顯微鏡觀察以及對課程改革的體會和評價。任課教師分別對每組的PPT匯報內(nèi)容進行點評，并按照統(tǒng)一的標準給出考核分值。

5 微生物學實驗教學改革效果評價與反饋

微生物學實驗教學內(nèi)容和教學方式改革實施后，微生物學教研室設計了微生物學實驗教學改革評價反饋表，要求生物科學專業(yè)拔尖班參與微生物學實驗教學改革的學生填寫并在期末考核前上交?，F(xiàn)將學生的評價反饋匯總?cè)缦隆?/p>

1）掃描電子顯微鏡觀察技術(shù)與微生物學實驗教學相結(jié)合，輔助本科實驗教學，能夠充分發(fā)揮大型精密儀器在本科實驗教學中的作用。此外，增加學生接觸大型精密儀器的機會，可以增強他們對實驗設備的理解和操作技能，有效地將理論知識與實際操作相結(jié)合，從而顯著提高實驗教學的效果。

2）充分利用掃描電子顯微鏡建立多樣的實驗模式，本實驗課程支持和輔助大學生開放實驗、大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實驗，將教學實踐與科學研究相結(jié)合，通過實踐教學促進科研的發(fā)展。同時允許學生結(jié)合所屬院校和專業(yè)的特點，自備材料、自主設計實驗，對掃描電子顯微鏡觀察技術(shù)進行深入研究。

3）優(yōu)化整合微生物學實驗課程體系和教學內(nèi)容，將本實驗拆分為取材、戊二醛固定、乙醇梯度脫水、叔丁醇置換100%乙醇、冷凍干燥和掃描電子顯微鏡觀察六個實驗，這一套完整的課程體系可以鍛煉學生使用戊二醛固定法和叔丁醇冷凍干燥法制備電子顯微鏡材料的技能；讓學生通過掃描電子顯微鏡檢驗并于顯微鏡下觀察真菌樣品，在生物科學專業(yè)拔尖班進行了有益的嘗試，該教學方法的創(chuàng)新獲得了大部分學生的認可。

4）在實驗教學改革中，生物科學專業(yè)拔尖班學生從制備青霉的分生孢子結(jié)構(gòu)入手，全程參與取材、戊二醛固定、乙醇梯度脫水、叔丁醇置換100%乙醇、冷凍干燥、粘樣、噴金、觀察這一系列完整的實驗流程，不但可以激發(fā)學生學習的興趣和積極性，而且可以培養(yǎng)學生的實踐操作能力、創(chuàng)新思維、團結(jié)協(xié)作能力，提升學生的綜合素質(zhì)。

6 參考文獻

[1] 王楚楚，郭慶勛，張明哲.高等院校微生物學實驗教

學改革的幾點探索[J].中國多媒體與網(wǎng)絡教學學報，

2020（4）：162-163.

[2] 國輝，何曉青，金一，等.高等林業(yè)院?！拔⑸飳W”

課程教學改革的思考：以北京林業(yè)大學為例[J].中國

林業(yè)教育，2017，35（增刊1）：43-46.

[3] 張香美，李樹立，賈月梅，等.淺談微生物學課堂教學

中創(chuàng)新能力的培養(yǎng)[J].微生物學通報，2009，36（7）：

1077-1079.

[4] 萬鵬，王馨楠，徐強，等.材料表面性質(zhì)對掃描電鏡鍍

膜形貌的影響[J].電子顯微學報，2021，40（6）：758-763.

[5] 趙孟良，任延靖.掃描電子顯微鏡在植物中的應用研究

進展[J].電子顯微學報，2021，40（2）：197-202.

[6] 肖鑫，陶樂仁，習德成，等.凍干紅細胞干燥過程及凍

干樣品的微CT實驗分析[J].中國醫(yī)學物理學雜志，

2007（1）：12-16.

[7] 孔華杰，李丹丹.淺談掃描電子顯微鏡在材料化學教學

實踐中的應用[J].廣州化工，2020，48（2）：116-117，135.

[8] 王建林，陸翠珍，陳玎玎，等.電子顯微鏡在農(nóng)業(yè)上的

應用及進展[J].農(nóng)技服務，2010，27（12）：1659-1660.

[9] 潘旭遲，許劍鋒，傅昱晟，等.3種植物揮發(fā)油抑制食源

性細菌生長活性成分及機理[J].食品科學，2017，38（13）：

143-149.

[10] 何斌，許澤安，李雪影，等.鏈霉菌B221降解角蛋白

的掃描電鏡觀察[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2011（1）：24-26.

[11] 劉樂，王文可，卓靜，等.掃描電子顯微鏡叔丁醇冷凍

干燥快速制樣方法的探索[J].電子顯微學報，2022，

41（1）：98-104.

*項目來源：北京林業(yè)大學教育教學改革與研究項目“OBE理念下虛擬仿真實驗在微生物學實踐教學中的改革與實踐”（BJFU

2023JY043）。

作者簡介：毋瑞華，博士，實驗師；何曉青，博士，教授；何湘?zhèn)?，博士，副教授；鄭菲，通信作者，博士，講師。