豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF7基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

收稿日期：2024-02-29

基金項(xiàng)目：甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21JR1RA221）；蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2023-1-31）；中央高?；究蒲许?xiàng)目（31920220050）

作者簡(jiǎn)介：安樂樂（1997-），男，河南周口人，碩士研究生，主要從事病毒基因工程研究。（Tel）17836954272；（E-mail）1803180130@qq.com

通訊作者：趙永清，（E-mail）450883800@qq.com

摘要： 為建立一種快速、高效檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，本研究根據(jù)GenBank公布的中國流行PRRSV病毒株基因序列，制備包含PRRSV ORF7基因的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)，針對(duì)PRRSV保守區(qū)域ORF7基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并優(yōu)化引物和探針終濃度，建立PRRSV TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板構(gòu)建檢測(cè)方法線性模型，評(píng)估靈敏度、重復(fù)性和特異性，并在疑似臨床樣品中初步應(yīng)用。本研究建立的PRRSV TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法線性關(guān)系良好，線性決定系數(shù)為0.997 5；病毒載量檢測(cè)限度為 "μL 3.32×10 拷貝；變異系數(shù)在組內(nèi)和組間重復(fù)中均小于1.500%；僅與PRRSV發(fā)生特異性反應(yīng)，未與其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。臨床樣品qPCR檢測(cè)陽性率為36.92%，高于PCR檢測(cè)陽性率（26.15%），陽性符合率為100%?；赑RRSV ORF7基因構(gòu)建的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法線性關(guān)系良好、靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)，可快速、高效檢測(cè)臨床樣品PRRSV，為PRRSV早期診斷、及時(shí)防控和流行病學(xué)調(diào)查提供了科學(xué)的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞： 豬繁殖與呼吸綜合征； ORF7基因； TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR； 早期診斷

中圖分類號(hào)： S855.3"" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A"" 文章編號(hào)： 000-4440（2024）09-1681-08

Establishment of real-time fluorescence quantitative PCR method for detection of ORF7 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus

AN Lele LUO Xun YANG Xuanye HU Xinyan ZHAO Yongqing ，2

（1.Biomedical Research Center， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030， China；2.College of Life Science and Engineering， Northwest Minzu University， Lanzhou 730100， China）

Abstract： To establish a rapid and efficient qPCR method for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）， standard recombinant plasmid samples containing the ORF7 gene of PRRSV were prepared， according to the gene sequences of popular PRRSV strains in China annunciated by GenBank. Meanwhile， specific primers and probes were designed according to the ORF7 gene sequence of the conserved region of PRRSV， and the final concentrations of primers and probes were optimized to construct a real-time fluorescence quantitative PCR detection method for PRRSV TaqMan. The linear model of the assay was constructed by using the plasmid standard sample as the template to evaluate the sensitivity， repeatability and specificity， and the preliminary application was made in suspected clinical samples. The linear determination coefficient of the established TaqMan qPCR detection method for PRRSV was 0.997 5 and the linear relationship was good. The minimum detection limit of viral load was 3.32×10 "copies/μL. The coefficient of variation was less than .500% in both intra-group and inter-group replicates. It only reacted specifically with PRRSV， and did not cross-react with other viruses. The positive detection rate of qPCR in clinical samples was 36.92%， which was higher than that of PCR （26.15%）， and the positive coincidence rate was 00%. The TaqMan fluorescence quantitative PCR method based on PRRSV ORF7 gene had good linear relationship， high sensitivity， good repeatability and strong specificity. It can quickly and efficiently detect PRRSV in clinical samples， which provides scientific technical support for PRRSV early diagnosis， timely prevention and control as well as epidemiological investigation.

Key words： porcine reproductive and respiratory syndrome;ORF7 gene;TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR；early diagnosis

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染妊娠母豬會(huì)導(dǎo)致妊娠終止、胎兒死亡、木乃伊胎產(chǎn)生、畸形胎產(chǎn)生和弱仔產(chǎn)生等繁殖障礙，各日齡豬群感染后表現(xiàn)出以呼吸困難、咳嗽等呼吸道典型癥狀為主要特征的豬繁殖與呼吸綜合征[1]，其中最易感豬群是30日齡以下仔豬和妊娠母豬，且PRRSV僅感染豬群，對(duì)其他動(dòng)物不發(fā)生感染。因豬繁殖與呼吸綜合征病毒病在臨床上可使病豬耳朵部位呈現(xiàn)藍(lán)紫色，故又稱“豬藍(lán)耳病”。1987年P(guān)RRSV在美國北卡羅來納州、艾奧瓦州等地首次被發(fā)現(xiàn)，1988年在加拿大暴發(fā)，1990年以來在德國、丹麥及歐洲其他國家相繼發(fā)現(xiàn)該病毒的存在[2]。1991年荷蘭學(xué)者Wensvoort等分離出Lelystad virus（簡(jiǎn)稱LV株），1992年美國學(xué)者分離出ATCC VR-2332株，依照病毒代表株最初分離地域不同，將分離毒株分別命名為歐洲型株（Ⅰ型豬繁殖與呼吸綜合征）和北美洲型株（Ⅱ型豬繁殖與呼吸綜合征）[3]。PRRSV基因組為易發(fā)生變異的RNA，該RNA單股正鏈，不分節(jié)段，序列長度約15.4 kb[4]。PRRSV是網(wǎng)巢病毒目，歸屬動(dòng)脈炎病毒科成員，是病毒科4個(gè)成員中基因組長度最大的，透射電鏡觀察病毒顆粒呈現(xiàn)球狀，具有表面纖突的囊膜結(jié)構(gòu)，病毒顆粒直徑為45～65 nm，核衣殼直徑為25～35 nm，呈現(xiàn)二十面體對(duì)稱[5]。PRRSV基因組堿基易發(fā)生突變和缺失，變異區(qū)域主要集中在非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2區(qū)域[6]，而編碼核衣殼N蛋白的ORF7基因高度保守，是PRRSV通用性檢測(cè)引物設(shè)計(jì)最佳靶基因的區(qū)域[7-8]。

1996年，在中國大陸首次發(fā)現(xiàn)并成功分離出PRRSV毒株[9]，毒株血清型與北美洲型接近。迄今，中國國內(nèi)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的PRRSV毒株，大多數(shù)血清型為北美洲型，關(guān)于歐洲型毒株的報(bào)道較少[10]。2006年，在江西省首次發(fā)現(xiàn)高熱、高致死率的高致病性PRRSV，對(duì)免疫力尚弱的仔豬和健康的育肥豬均能引起感染，此高致病性毒株的流行導(dǎo)致中國生豬養(yǎng)殖面臨極大的風(fēng)險(xiǎn)挑戰(zhàn)和經(jīng)濟(jì)財(cái)產(chǎn)損失，并逐步發(fā)展成為中國流行毒株[11]?，F(xiàn)如今科技發(fā)展迅速，生豬養(yǎng)殖越來越集中化、立體化、工業(yè)化，單位面積內(nèi)豬數(shù)量龐大，豬與豬之間接觸緊密，PRRSV接觸傳染性較強(qiáng)，易發(fā)生大規(guī)?？焖賯鞑デ也豢煽?。因此，建立一種快速高效的特異性檢測(cè)方法不僅是解決PRRSV預(yù)防和控制的有效手段，更對(duì)中國獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)具有深遠(yuǎn)的意義。目前，由于存在大量亞臨床感染[12]，且不同豬群發(fā)病臨床癥狀也存在不同，因此需要更精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行臨床檢測(cè)，以更好地確定發(fā)病原因，從而積極科學(xué)有效地針對(duì)性治療和確定快捷處置方案。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法多以PCR為主，也有血清學(xué)檢查，包括間接免疫熒光技術(shù)、血清中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)。常規(guī)PCR存在無法定量分析、敏感性差、易發(fā)生中途開蓋污染等缺陷；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)及其他血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)存在操作繁瑣、時(shí)間周期長等缺點(diǎn)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)具有相對(duì)定量和絕對(duì)定量、操作簡(jiǎn)單快捷、重復(fù)性好、敏感性高、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)[13]，在實(shí)驗(yàn)室臨床檢測(cè)方法中更具優(yōu)勢(shì)。

本研究基于PRRSV 保守基因ORF7設(shè)計(jì)多對(duì)引物探針，并對(duì)比試驗(yàn)數(shù)據(jù)篩選出最佳熒光定量檢測(cè)性引物和探針，在熒光定量PCR（探針法）方法上構(gòu)建一種能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)PRRSV的實(shí)驗(yàn)室方法，用標(biāo)準(zhǔn)曲線創(chuàng)建病毒載量拷貝數(shù)與循環(huán)數(shù)（Ct）之間的定量關(guān)系，采用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣本作模板的試驗(yàn)方案驗(yàn)證檢測(cè)方法的靈敏度、重復(fù)性、特異性，并在臨床樣品上進(jìn)行初步應(yīng)用，為PRRSV早期診斷、預(yù)防控制和流行病學(xué)調(diào)查提供科學(xué)的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒株與臨床病料

PRRSV病料、偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病病毒（CSFV）、豬細(xì)小病毒（PPI）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬流感病病毒（SIV）等經(jīng)過56 ℃、30 min滅活處理的陽性毒株樣本均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室通過基因擴(kuò)增測(cè)序鑒定和保存。65份病豬疑似臨床組織樣本（淋巴結(jié)、糞便等）分別從不同地區(qū)的養(yǎng)豬場(chǎng)采集，由本實(shí)驗(yàn)室于56 ℃、30 min滅活處理后，于-80 ℃冷凍保存。

1.2 主要試劑與儀器

微生物培養(yǎng)皿（90 mm），50×TAE購自北京索萊寶科技有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑[HiScript II Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）]、熒光定量PCR探針法酶試劑（Taq Pro U + Multiple Probe qPCR Mix）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；克隆載體（pUC57，Ampicillin抗性）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；BeyoPure TM Ultrapure Water （PCR級(jí)， Sterile）購自碧云天生物技術(shù)有限公司； DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、SanPrep 柱式質(zhì)粒小提試劑盒、SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自康寧生命科學(xué)有限公司。

SH-NanoOne超微量分光光度計(jì)購自杭州申花科技有限公司；GM-O5 PCR基因擴(kuò)增儀購自杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；qPCR儀購自西安天隆科技有限公司。

1.3 引物探針設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank 發(fā)布的PRRSV（OR805486）相對(duì)保守區(qū)域ORF7基因，按照Taq Man復(fù)合熒光引物探針設(shè)計(jì)和常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)原則，利用Oligo7.60設(shè)計(jì)1對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品上下游引物（PRRSV-F1/PRRSV-R1） 、1對(duì)熒光定量PCR上下游引物（PRRSV-F2/PRRSV-R2）及探針（PRRSV-P），PCR引物及探針序列見表1，熒光定量PCR引物及探針序列位置信息見圖1，其中探針序列2端進(jìn)行特殊熒光基團(tuán)修飾（5′端為FAM，3′端為BHQ-1）。引物及探針合成由擎科生物科技股份有限公司完成。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

使用AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒提取病料中PRRSV基因組并反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板，使用常規(guī)引物擴(kuò)增獲取ORF7目的基因，使用SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒回收目的基因并純化。按照TaKaRa DNA連接試劑盒說明書配置目的基因ORF7，然后和pUC57克隆載體反應(yīng)體系進(jìn)行連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α Competent cells，37 ℃培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌斑進(jìn)行抗性培養(yǎng)，陽性菌斑培養(yǎng)液進(jìn)行菌液基因擴(kuò)增鑒定和基因測(cè)序鑒定[由生工生物工程（上海）股份有限公司完成]。使用SanPrep 柱式質(zhì)粒小提試劑盒抽提陽性菌液獲取質(zhì)粒，質(zhì)粒命名為pUC57-PRRSV-ORF7。陽性質(zhì)粒pUC57-PRRSV-ORF7作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和后續(xù)試驗(yàn)的陽性模板，放置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病料核酸提取及反轉(zhuǎn)錄

取滅活處理后的PRV、CSFV、PCV2、PPI、SIV陽性血清樣本和65份病豬滅活臨床組織樣本，利用AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒提取基因組RNA和DNA，其中豬瘟病毒和豬流感病毒基因組RNA易降解，無法長期穩(wěn)定保存，故需要用商業(yè)化反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄處理，獲取高穩(wěn)定性產(chǎn)物cDNA。所有病毒基因組于-20 ℃條件下保存。

1.6 熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

以1 μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC57-PRRSV-ORF7為反應(yīng)模板，反應(yīng)總體系為20 μL，對(duì)引物終濃度、探針終濃度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)程序：污染消化（37 ℃ 2 min），預(yù)變性（95 ℃ 30 s），循環(huán)反應(yīng)（95 ℃ 0 s，60 ℃ 30 s），循環(huán)40次。引物終濃度和探針終濃度如表2所示，以循環(huán)數(shù)低、熒光強(qiáng)度高和穩(wěn)定性好來綜合考量確定該qPCR檢測(cè)方法引物和探針的最佳終濃度。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC57-PRRSV-ORF7進(jìn)行10倍倍比稀釋，以1 μL 0 3～10 8拷貝質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為反應(yīng)模板，使用方法1.6最優(yōu)引物探針終濃度進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，每組3個(gè)重復(fù)，Ct取平均值，由陽性質(zhì)?？截悢?shù)和Ct平均值繪制該qPCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 靈敏性試驗(yàn)

以1 μL 0 0～10 8 拷貝質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為反應(yīng)模板，以去離子水作為陰性對(duì)照，使用最優(yōu)引物探針終濃度進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。同時(shí)以常規(guī)PCR方法[14]檢測(cè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，作為靈敏性試驗(yàn)的對(duì)照組，其中選用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)1 μL 0 0 拷貝作陽性對(duì)照。分析熒光定量PCR和常規(guī)PCR檢測(cè)的最小病毒載量拷貝數(shù)，通過數(shù)據(jù)對(duì)比說明該qPCR檢測(cè)方法在靈敏度上的優(yōu)勢(shì)。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

以1 μL 0 3～10 7 拷貝質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為反應(yīng)模板，以去離子水作為陰性對(duì)照，使用上述最優(yōu)反應(yīng)條件進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，對(duì)建立的檢測(cè)方法進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，每個(gè)質(zhì)?？截愒O(shè)組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和組間重復(fù)試驗(yàn)各3次。以組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差來計(jì)算變異系數(shù)（CV），評(píng)價(jià)該qPCR檢測(cè)方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

1.10 特異性試驗(yàn)

以豬繁殖與呼吸綜合征病毒病料基因組和方法1.5提取的PRV、CSFV、PPI、PCV2及SIV基因組作為反應(yīng)模板，同時(shí)以去離子水作為陰性對(duì)照，使用上述最優(yōu)反應(yīng)條件進(jìn)行特異性試驗(yàn)，通過觀察是否出現(xiàn)“S”形擴(kuò)增曲線來檢驗(yàn)該qPCR檢測(cè)方法的特異性。

1.11 臨床樣本的檢測(cè)

以方法1.5提取的65份病豬臨床組織樣本基因組及反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為反應(yīng)模板，同時(shí)以去離子水作為陰性對(duì)照，使用上述建立的qPCR檢測(cè)方法進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)用方法1.8中常規(guī)PCR方法對(duì)65份基因組cDNA進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，使用擴(kuò)增ORF7基因的上下游引物PRRSV-F1/PRRSV-R1進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，獲得ORF7基因，基因大小為372 bp（圖2）。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收并純化，連接轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素篩選后挑取單克隆菌斑進(jìn)行37 ℃過夜擴(kuò)大培養(yǎng)。使用菌液進(jìn)行PCR鑒定，目的基因條帶大小為372 bp（圖3），將陽性菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序鑒定，對(duì)比測(cè)序序列與目的基因ORF7序列，結(jié)果一致，證明重組質(zhì)粒pUC57-PRRSV-ORF7構(gòu)建成功。抽提陽性質(zhì)粒并用SH-NanoOne儀器進(jìn)行濃度檢測(cè)，重組質(zhì)粒質(zhì)量濃度為112.316 ng/μL，理論拷貝數(shù)為1 μL 3.32×10 0 拷貝。

2.2 Taq Man熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

在退火溫度60 ℃反應(yīng)條件下，在合理的引物探針濃度范圍（100～600 nmol/L）內(nèi)，設(shè)置6個(gè)不同濃度的處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，對(duì)TaqMan熒光定量方法進(jìn)行終濃度優(yōu)化。引物終濃度在100 nmol/L、200 nmol/L、300 nmol/L、400 nmol/L、500 nmol/L、600 nmol/L的條件下，循環(huán)數(shù)分別為17.736±0.356、17.561±0.383、17.247±0.149、17.492±0.475、17.366±0.594、17.474±0.403，每個(gè)濃度的擴(kuò)增曲線的重復(fù)性、穩(wěn)定性均較佳且無非特異性擴(kuò)增（圖4），在引物終濃度為300 nmol/L時(shí)，循環(huán)數(shù)（17.247±0.149）最低，穩(wěn)定性最好，故優(yōu)化得到最佳引物終濃度為300 nmol/L，最佳探針終濃度為150 nmol/L。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以1 μL 3.32×10 2拷貝、1 μL 3.32×10 3拷貝、1 μL 3.32×10 4拷貝、1 μL 3.32×10 5拷貝、1 μL 3.32×10 6拷貝、1 μL 3.32×10 7拷貝、1 μL 3.32×10 8拷貝的質(zhì)粒為模板，每組3個(gè)重復(fù)，用最佳引物探針終濃度進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)，采用循環(huán)數(shù)平均值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線模型。如圖5所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=-3.398 9x+38.114 0，使用GraphPad Prism8.0.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在線性回歸模型擬合度中的決定系數(shù)（R 2）為0.997 5，用公式[擴(kuò)增效率（E）=10[（-1/斜率）-1]]計(jì)算擴(kuò)增效率，為96.89%。結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的擬合性，線性關(guān)系良好。

2.4 靈敏性試驗(yàn)

以1 μL 3.32×10 0拷貝、1 μL 3.32×10 拷貝、1 μL 3.32×10 2拷貝、1 μL 3.32×10 3拷貝、1 μL 3.32×10 4拷貝、1 μL 3.32×10 5拷貝、1 μL 3.32×10 6拷貝、1 μL 3.32×10 7拷貝、1 μL 3.32×10 8拷貝的質(zhì)粒作為反應(yīng)模板，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（ddH2O），在優(yōu)化的最佳引物探針終濃度條件下進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過比較TaqMan qPCR方法和常規(guī)PCR方法的質(zhì)?？截悢?shù)最小值來驗(yàn)證方法的靈敏度。結(jié)果（圖6）顯示，常規(guī)PCR方法可以檢測(cè)最小病毒載量拷貝數(shù)為1 μL 3.32×10 3 拷貝；圖7顯示， TaqMan qPCR方法可以檢測(cè)最小病毒載量拷貝數(shù)為1 μL 3.32×10 "拷貝。二者對(duì)比，TaqMan qPCR方法靈敏度更高，是常規(guī)PCR方法的100倍，具備更好的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

以1 μL 3.32×10 3拷貝、1 μL 3.32×10 4拷貝、1 μL 3.32×10 5拷貝、1 μL 3.32×10 6拷貝、1 μL 3.32×10 7拷貝的質(zhì)粒作為反應(yīng)模板，每組3個(gè)重復(fù)作為組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，在不同時(shí)間段進(jìn)行3次試驗(yàn)作為組間重復(fù)試驗(yàn)，在優(yōu)化的最佳引物探針終濃度條件下進(jìn)行TaqMan qPCR擴(kuò)增，對(duì)組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析來評(píng)估TaqMan qPCR方法的重復(fù)性。由表3可知，該方法組內(nèi)變異系數(shù)為0.460%～1.124%，組間變異系數(shù)為0.607%～1.366%，組內(nèi)、組間變異系數(shù)均小于1.500%，因此該TaqMan qPCR方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，表明該檢測(cè)方法具備合理性和可重復(fù)性。

2.6 特異性試驗(yàn)

使用優(yōu)化反應(yīng)條件檢測(cè)PRV、CSFV、PPI、PCV2、SIV基因組和PRRSV病料基因組，以去離子水作為陰性對(duì)照，觀察分析擴(kuò)增曲線來驗(yàn)證TaqMan熒光定量PCR方法的特異性。由圖8可知，僅有PRRSV出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，說明本檢測(cè)方法與豬身上常見的病毒核酸未發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性較強(qiáng)。

2.7 臨床樣本的檢測(cè)

為了驗(yàn)證所建qPCR方法臨床應(yīng)用的可行性，以65份病豬臨床組織樣本的核酸作為反應(yīng)模板，用建立的qPCR方法在臨床樣本中進(jìn)行初步檢驗(yàn)。結(jié)果顯示：TaqMan熒光定量PCR方法陽性檢出率為36.92%（24/65），高于常規(guī)PCR方法陽性檢出率（26.15%=17/65），qPCR陽性樣品經(jīng)測(cè)序鑒定，符合率為100%，并且PCR方法檢出的17份陽性樣品均包含在qPCR方法檢出的24份陽性樣品中，論證了2.4節(jié)qPCR方法的高靈敏性，表明建立的qPCR檢測(cè)方法具有更好的臨床適用性和更好的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，可以對(duì)大批量臨床樣本和低病毒載量的樣本進(jìn)行有效檢測(cè)。

3 討論與結(jié)論

PRRSV唯一的易感動(dòng)物是豬，該病毒傳播途徑廣泛，可以通過動(dòng)物直接接觸方式或排泄物、組織器官等接觸方式進(jìn)行傳播；還可以空氣作為媒介以氣溶膠的形式傳播；也能由精液攜帶方式進(jìn)行傳播。某些鳥類、蚊子也可以攜帶病原進(jìn)行傳播[15-16]?；疾∝i可以通過糞便、尿液、精液、唾液和乳腺分泌物等載體向環(huán)境排出豬繁殖與呼吸綜合征病毒。1993年，在中國臺(tái)灣分離出豬繁殖與呼吸綜合征病毒；1995年底，在中國大陸發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性豬場(chǎng)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所郭寶清等率先在北京地區(qū)分離出4株豬繁殖與呼吸綜合征病毒（CH-1a、CH-1b、CH-1c和CH-1d）[17-18]，均屬于北美洲型毒株[19]，從而證實(shí)在中國大陸存在豬繁殖與呼吸綜合征病毒。2006年4月，高致病性PRRSV毒株首次在江西省被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，感染豬的主要特征是體溫高、發(fā)病率高及死亡率高，且各品種、各種年齡階段的豬群均能感染發(fā)病[20]。根據(jù)現(xiàn)有的調(diào)查數(shù)據(jù)[21]初步統(tǒng)計(jì)，PRRSV發(fā)病率在50%以上，死亡率在20%～100%，給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著PRRSV疫苗的大規(guī)模普及應(yīng)用，該病毒感染在國內(nèi)得到顯著控制，但亞臨床感染逐漸增加，僅依據(jù)臨床癥狀很難準(zhǔn)確斷定疾病類型，無法對(duì)早期感染豬進(jìn)行有效隔離和針對(duì)性治療。因此，找到更方便、靈敏、安全、準(zhǔn)確、特異的PCR檢測(cè)方法成為必需。張宇鑫等[22]利用四重PCR方法檢測(cè)PRRSV，該方法檢測(cè)下限為1μL 6.5×10 4 拷貝；王方洲等[23]建立RT-PCR方法檢測(cè)PRRSV；王新港等[24]建立雙重PCR方法檢測(cè)PRRSV，該方法檢測(cè)下限為2.48×10 4 ng。與常規(guī)PCR方法檢出率低、無法定量病毒載量、操作時(shí)間長、中間操作環(huán)節(jié)易污染的缺陷相比較，熒光定量PCR優(yōu)勢(shì)較明顯，具備靈敏度高、準(zhǔn)確性好、中間操作污染環(huán)節(jié)減少、絕對(duì)或相對(duì)定量及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)，目前被廣泛應(yīng)用于各種疾病的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查[25]中。張杰等[26]利用染料法建立熒光定量 PCR 方法檢測(cè)PRRSV，該方法檢測(cè)下限為1×10 0.5 TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）病毒。使用TaqMan探針法建立的針對(duì)PRRSV感染的檢測(cè)方法，與染料法SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR相比，探針法的特異性更強(qiáng)，準(zhǔn)確性和靈敏性更高，檢測(cè)結(jié)果更具有說服力。

本研究基于ORF7基因高保守性，以O(shè)RF7為靶基因完成特異性引物和探針設(shè)計(jì)，改善引物和探針終濃度以達(dá)到最佳反應(yīng)條件，建立適用于PRRSV早期感染診斷的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-3.398 9x+38.114 0，線性決定系數(shù)（R 2）為0.997 5，擴(kuò)增效率為96.89%，可以穩(wěn)定檢出的最小病毒載量值為1 μL 3.32×10 "拷貝，靈敏度是常規(guī)PCR方法的100倍，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于1.500%，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，同時(shí)對(duì)PRRSV、PRV、CSFV、PPI、PCV2和SIV進(jìn)行檢測(cè)，僅有PRRSV出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，常見的感染豬的其余病毒核酸檢測(cè)結(jié)果均呈現(xiàn)陰性，可見此檢測(cè)方法與豬身上其他常見病原核酸不存在交叉反應(yīng)，特異性較強(qiáng)。使用該qPCR檢測(cè)方法對(duì)采集的65份病豬臨床樣本核酸進(jìn)行檢測(cè)，陽性率為36.92%，符合率為100%，具有良好的臨床適用性。

綜上所述，本研究基于PRRSV ORF7基因構(gòu)建的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法，靈敏性高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)，且適用于大批量臨床樣本檢測(cè)，為豬群PRRSV早期快速診斷、及時(shí)防控、流行病學(xué)調(diào)查提供了科學(xué)的技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）