帶魚酶解工藝研究及海鮮調(diào)味汁的制備

摘要：文章以帶魚為研究對(duì)象，通過酶解作用制備海鮮調(diào)味汁。以水解度（DH）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了不同種類的蛋白酶對(duì)酶解效果的影響，并通過正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝條件。結(jié)果表明，風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解效果較好。最佳工藝條件為酶解溫度60 ℃、復(fù)配比例2∶1、酶添加量1 000 U/g底物、酶解時(shí)間3.5 h。利用酶解液制備的海鮮調(diào)味汁中必需氨基酸和鮮味氨基酸含量較高，帶魚香味濃郁，鮮香味明顯，無明顯雜質(zhì)，有作為具有特色風(fēng)味的調(diào)味汁的潛力。

關(guān)鍵詞：帶魚；酶解作用；工藝；正交試驗(yàn)；海鮮調(diào)味汁

中圖分類號(hào)：TS201.1 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)：1000-9973（2024）09-0109-05

Study on Enzymatic Hydrolysis Process of Hairtail and

Preparation of Seafood Sauce

WANG Ran1， FENG Xin-rui1， FAN Wen2， WU Tao-an1，

ZHANG Bao1， ZHOU Hui1， CAI Ke-zhou1*

（1.Key Laboratory of Green Manufacturing and Resource Exploration of Animal-derived Food

in Anhui Province， Hefei University of Technology， Hefei 230009， China; 2.Zhengzhou

Synear Food Co.， Ltd.， Zhengzhou 450003， China）

Abstract： In this paper， with hairtail as the research object， seafood sauce is prepared through" enzymatic hydrolysis. With the degree of hydrolysis （DH） as the evaluation index， the effects of different types of proteases on the enzymatic hydrolysis effect are studied， and enzymatic hydrolysis process parameters are optimized through orthogonal test， in order to determine the optimal process conditions. The results indicate that flavor protease and neutral protease have better enzymatic hydrolysis effects. The optimal process conditions are enzymatic hydrolysis temperature of 60 ℃， compound ratio of 2∶1， enzyme addition amount of 1 000 U/g substrate and enzymatic hydrolysis time of 3.5 h. The seafood sauce prepared using the enzymatic hydrolysate has higher content of essential amino acids and umami amino acids. The sauce has rich hairtail aroma， clear umami aroma and no obvious impurities， indicating that it has potential as sauce with characteristic flavor.

Key words： hairtail; enzymatic hydrolysis; process; orthogonal test; seafood sauce

收稿日期：2024-03-07

基金項(xiàng)目：“十四五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2021YFD21002）

作者簡介：王冉（1998—），女，碩士，研究方向：食品現(xiàn)代加工理論與方法。

*通信作者：蔡克周（1980—），男，教授，博士，研究方向：肉品加工與質(zhì)量控制。

中國是世界上最大的帶魚生產(chǎn)國之一，中國各個(gè)沿海省份都有著豐富的帶魚資源[1]。帶魚種類繁多，作為我國重要的魚類之一，其肉質(zhì)細(xì)嫩，深受消費(fèi)者的喜愛。帶魚是一種蛋白質(zhì)含量（17.57%）和脂肪含量（5.16%）較高的魚類，同時(shí)還含有多種人體所需的營養(yǎng)成分，例如礦物質(zhì)、維生素、不飽和脂肪酸等[2-3]。然而，長期以來，由于帶魚市場(chǎng)價(jià)格低，加工技術(shù)水平和回收手段落后，滯銷的帶魚大多僅用于加工生產(chǎn)飼料、魚粉等，導(dǎo)致產(chǎn)品的利用率不高、經(jīng)濟(jì)效益低，并且存在嚴(yán)重的資源浪費(fèi)等現(xiàn)象[4-6]。因此，如何提高帶魚的附加值和資源利用率已成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)之一，開展此類研究能夠?yàn)閹~的深度利用提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

目前，海鮮調(diào)味料作為一種特有的風(fēng)味調(diào)料制品，已經(jīng)成為人們餐桌上不可或缺的調(diào)味品之一[7]。制備海鮮調(diào)味料的方法主要包括酶解法和微生物發(fā)酵法[8-10]。其中，利用酶解法制備海鮮調(diào)味汁已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用和研究。Peinado等[6]發(fā)現(xiàn)酶解后的魚粉釋放出大量的呈味氨基酸，尤其是谷氨酸、賴氨酸。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)酶解海帶后制備的海鮮調(diào)味品中含有豐富的氨基酸，主要呈現(xiàn)鮮味和咸味，這些結(jié)果表明酶解法在海鮮調(diào)味制品的制備中具有較大的潛力。目前，國內(nèi)外對(duì)帶魚的研究多集中在生物活性肽、金屬螯合物等方面，而以帶魚為原料制備調(diào)味汁的報(bào)道較少。因此，本研究旨在通過酶解法制備具有帶魚特色風(fēng)味的海鮮調(diào)味汁，以提高帶魚的深加工利用價(jià)值并為新型海鮮調(diào)味品的開發(fā)提供一定的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

冰鮮帶魚：購于合肥大潤發(fā)超市翡翠店；風(fēng)味蛋白酶（2×104 U/g）、堿性蛋白酶（2×105 U/g）、中性蛋白酶（5×104 U/g）、復(fù)合蛋白酶（1.2×105 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；鄰苯二甲醛（分析純）：上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS，分析純）：上?？蒲派锟萍加邢薰?；二硫蘇糖醇（DTT，分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-絲氨酸（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；四硼酸鈉、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T18型高速均質(zhì)機(jī) 德國IKA集團(tuán)；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Synergy H1型酶標(biāo)儀 美國BioTek儀器有限公司；SZCL-2恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SB-5200D超聲波清洗機(jī)、Scientz-12N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；HH-4X型恒溫水浴鍋 上海力辰邦西儀器科技有限公司；S-433D全自動(dòng)氨基酸分析儀 德國Sykam公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 帶魚酶解液的制備

將帶魚進(jìn)行預(yù)處理，去除魚骨、魚鰭、內(nèi)臟等，清洗干凈，瀝干水分后，分裝并密封于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

工藝流程：向預(yù)處理后的帶魚肉中按一定的料液比（1∶5）加入超純水，混合均勻后，經(jīng)8 500 r/min均質(zhì)勻漿2 min后，添加適量的蛋白酶，在一定溫度下進(jìn)行酶解；酶解結(jié)束后，于80～90 ℃水浴鍋中滅酶10～15 min，冷卻后，在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心15 min，棄沉淀，即為待測(cè)酶解液。

1.3.2 蛋白酶的篩選

選取風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，料液比為1∶5，酶添加量為400 U/g底物，于各自最適條件下進(jìn)行酶解。以水解度（DH）為篩選指標(biāo)，篩選出兩種效果最佳的蛋白酶進(jìn)行后續(xù)酶解條件優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以酶解液的水解度為指標(biāo)，在保證其他因素相同的情況下，考察酶解時(shí)間（2.5，3，3.5，4，4.5 h）、酶解溫度（40，45，50，55，60 ℃）、酶添加量（400，600，800，1 000，1 200 U/g底物）、復(fù)配比例（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）4個(gè)因素對(duì)酶解液水解度的影響，進(jìn)而篩選出最佳條件。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解溫度、復(fù)配比例、酶添加量、酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響，以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步確定最佳水解工藝條件，正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

1.3.5 水解度（DH）

水解度（degree of hydrolysis，DH）是指蛋白質(zhì)中肽鍵被酶裂解的百分比，可用來衡量蛋白質(zhì)被酶解的程度。以絲氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用OPA法對(duì)帶魚酶解液進(jìn)行水解度的測(cè)定[12-13]。水解度（DH）計(jì)算公式如下：

DH=Serine-NH2-βα·htot×100%。

式中：Serine-NH2為每克蛋白中絲氨酸氨基的毫摩爾數(shù)（mmol/g）；htot為每克蛋白中所含的總肽鍵數(shù)（mmol/g），帶魚的htot為8.17 mmol/g[14]；α、β分別為常數(shù)1，0.4[12]。

1.3.6 帶魚海鮮調(diào)味汁的制備

在酶解液中加入1％白砂糖、1.5％食用鹽、0.5％味精、0.2％檸檬酸進(jìn)行調(diào)配。將加入輔料的酶解液混合均勻，即為帶魚海鮮調(diào)味汁。

1.3.7 游離氨基酸的測(cè)定

對(duì)海鮮調(diào)味汁進(jìn)行游離氨基酸含量的測(cè)定，測(cè)定方法參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》。

1.3.8 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)定小組由6名食品質(zhì)量與安全和食品科學(xué)與工程專業(yè)的學(xué)生組成，其中男生3名，女生3名，年齡均在22～26歲。在正式參與評(píng)價(jià)前，6名感官評(píng)定人員分別對(duì)樣品的肉香味、甜味、鮮味、咸味、苦味等進(jìn)行了訓(xùn)練以區(qū)分不同的味道和特征。每次評(píng)價(jià)之前漱口30 s，隨后在昏暗的條件下進(jìn)行感官描述。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均平行3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件Origin 8.0、SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析，顯著性水平為Plt;0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

本研究選取了4種蛋白酶，包括堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶。以絲氨酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。測(cè)定了不同蛋白酶酶解帶魚后酶解液的水解度（DH），結(jié)果見圖2。

由圖2可知，不同蛋白酶對(duì)帶魚的酶解效果有顯著差異。風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)應(yīng)的水解度依次為20.59%、10.73%、6.84%、11.17%，其中風(fēng)味蛋白酶水解帶魚蛋白的能力最強(qiáng)，表明經(jīng)過風(fēng)味蛋白酶的酶解作用，更多的小分子物質(zhì)如多肽被釋放出來[15]。風(fēng)味蛋白酶的酶解效果最強(qiáng)，說明風(fēng)味蛋白酶可能更適合酶解帶魚蛋白，其次是中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶。因此，選擇風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶作為酶解帶魚的最適蛋白酶。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 復(fù)配比例對(duì)酶解效果的影響

復(fù)配比例（風(fēng)味蛋白酶∶中性蛋白酶）對(duì)帶魚酶解效果的影響見圖3。

由圖3可知，隨著風(fēng)味蛋白酶比例的減小，水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)中性蛋白酶的比例不斷增大時(shí)，水解度呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。在復(fù)配比例為2∶1（風(fēng)味蛋白酶∶中性蛋白酶）時(shí)，水解度達(dá)到峰值（32.53%），這是由于蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同，不同的酶復(fù)配有助于起到互補(bǔ)的效果，進(jìn)而促進(jìn)肽鍵的斷裂和短肽的生成，水解度升高[16]。因此，選擇2∶1作為酶解的最適復(fù)配比例。

2.2.2 酶添加量對(duì)酶解效果的影響

酶添加量對(duì)酶解效果的影響見圖4。

由圖4可知，隨著酶添加量的增加，水解度整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)酶添加量從400 U/g底物增加到1 000 U/g底物時(shí)，水解度顯著上升，當(dāng)酶添加量為1 000 U/g底物時(shí)，水解度達(dá)到最大值，為32.91%。而當(dāng)酶添加量超過1 000 U/g底物時(shí)，水解度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是由于酶添加量過多導(dǎo)致酶解物進(jìn)一步分解。因此，選擇1 000 U/g底物為最佳酶添加量。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響見圖5。

由圖5可知，隨著酶解時(shí)間的延長，水解度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酶解時(shí)間從2.5 h增加到3 h時(shí)，帶魚蛋白的水解度逐漸上升，從27.62%上升到32.69%，達(dá)到最大值。當(dāng)酶解時(shí)間從3 h延長到4.5 h時(shí)，水解度逐漸降低，從32.69%降低至27.44%，并且下降的速度逐漸緩慢，這可能是因?yàn)槎虝r(shí)間內(nèi)酶與底物充分結(jié)合，使得水解度升高，而時(shí)間過長，底物逐漸減少，酶與底物結(jié)合時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生競爭性抑制作用，從而導(dǎo)致水解度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[17]。因此，選擇3 h作為最佳酶解時(shí)間。

2.2.4 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

酶解溫度對(duì)酶解效果的影響見圖6。

由圖6可知，隨著酶解溫度的升高，水解度逐漸升高；當(dāng)酶解溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值，為36.85%。當(dāng)酶解溫度超過55 ℃后，水解度下降，這可能是因?yàn)槊附鉁囟冗^高抑制了酶的生物活性，從而降低了對(duì)底物的水解能力。因此，選擇55 ℃作為最適酶解溫度。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶解溫度、復(fù)配比例、酶添加量、酶解時(shí)間4個(gè)因素，取各單因素試驗(yàn)中3個(gè)較優(yōu)水平，按照表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表2中極差分析可知，對(duì)帶魚酶解效果影響的因素主次順序?yàn)槊附鉁囟萭t;酶添加量gt;酶解時(shí)間gt;復(fù)配比例。由表3中方差分析可知，酶解溫度和酶添加量對(duì)酶解效果的影響極顯著，而復(fù)配比例和酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響顯著。表2中第9號(hào)試驗(yàn)結(jié)果最好，其最優(yōu)組合為A3B3C2D1。而根據(jù)計(jì)算分析可得最優(yōu)組合為A3B2C2D3。在A3B2C2D3條件下測(cè)得的水解度為42.39%。因此，采用酶添加量1 000 U/g底物、復(fù)配比例（風(fēng)味蛋白酶∶中性蛋白酶）2∶1、酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間3.5 h作為反應(yīng)條件制備酶解液。

2.4 海鮮調(diào)味品綜合評(píng)價(jià)

2.4.1 游離氨基酸組成和含量分析

游離氨基酸對(duì)酶解產(chǎn)物的風(fēng)味特性具有重要影響[18]。海鮮調(diào)味汁中游離氨基酸的組成和含量見表4。

由表4可知，酶解液中主要的氨基酸為谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和精氨酸。必需氨基酸（Lys、Phe、Met、Thr、Ile、Val、His、Leu）含量占58.59%，占比較高。在必需氨基酸中，亮氨酸含量最高，為（4.47±0.01） g/100 g，其次是苯丙氨酸，含量為（3.15±0.02） g/100 g。鮮味氨基酸（Glu、Asp）占比為12.08%，其中谷氨酸含量為（3.00±0.04） g/100 g，僅次于異亮氨酸、亮氨酸和精氨酸，并且鮮味氨基酸含量高，有助于促進(jìn)產(chǎn)品鮮味的產(chǎn)生，為成品提供鮮香風(fēng)味。

2.4.2 感官評(píng)價(jià)

由表5可知，經(jīng)過感官評(píng)價(jià)后，發(fā)現(xiàn)利用酶解液制備的海鮮調(diào)味汁呈現(xiàn)濃郁的帶魚香味，鮮味和咸味較明顯，其次是甜味，苦味較弱。觀察形態(tài)發(fā)現(xiàn)，無沉淀、不溶物存在，且顏色鮮亮有光澤。因此，上述結(jié)果表明采用優(yōu)化后的工藝制備的酶解液有作為海鮮風(fēng)味調(diào)味汁的潛力。

3 結(jié)論

本文以水解度作為篩選指標(biāo)，通過試驗(yàn)篩選出酶解帶魚的兩種最優(yōu)酶（風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶），并運(yùn)用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)確定了帶魚酶解液制備的最佳工藝條件：酶解溫度60 ℃、復(fù)配比例2∶1、酶添加量1 000 U/g底物、酶解時(shí)間3.5 h，此條件下酶解液的水解度達(dá)到42.39%。經(jīng)過游離氨基酸測(cè)定發(fā)現(xiàn)，利用最優(yōu)條件下得到的酶解液制成的海鮮調(diào)味汁中鮮味氨基酸含量較高，其中谷氨酸含量僅次于異亮氨酸、亮氨酸和精氨酸。必需氨基酸含量占比58.59%，營養(yǎng)價(jià)值較高。感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，調(diào)味汁咸鮮味適中，具有帶魚特有的香氣，無刺激性味道，無肉眼可見的雜質(zhì)。該研究結(jié)果為提高帶魚的深加工提供了參考，也為酶解制備海鮮調(diào)味汁這一思路提供了理論依據(jù)。

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