酒精含量對快速發(fā)酵醉椒風味物質(zhì)及微生物群落組成的影響研究

摘要：醉椒是以高酒精度白酒（30%以上）和辣椒為主要原料，低鹽慢速發(fā)酵的西南特色鮮辣、低刺激調(diào)味品。其發(fā)酵周期長，且發(fā)酵原理、風味特征和微生物群落組成不明，制約品質(zhì)和安全性控制。文章研究發(fā)現(xiàn)15%以上白酒（60%）顯著抑制醉椒發(fā)酵過程，6%白酒發(fā)酵過快，酸味明顯，質(zhì)構變軟；9%和12%為最適白酒添加范圍，發(fā)酵30 d后pH穩(wěn)定在3.5，總酸含量為13.93～15.92 g/kg，無酸味，無霉變，有清香味，咀嚼感良好；亞硝酸鹽含量低于0.8 mg/kg，大腸菌群未檢出。GC-MS結合16S rDNA、ITS高通量測序顯示，真菌多樣性高于細菌，克魯維畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、皺枝孢霉為優(yōu)勢真菌，黃曲霉、赭曲霉未檢出，植物乳桿菌、腸膜明串珠菌為優(yōu)勢細菌；乳酸酯、萜類、糖醇、寡糖和鮮味氨基酸為醉椒特征風味物質(zhì)。

關鍵詞：醉椒；酒精濃度；快速發(fā)酵；細菌群落組成；真菌群落組成；乳酸酯化

中圖分類號：TS202.1 """""文獻標志碼：A """"文章編號：1000-9973（2024）09-0038-09

Study on Effect of Alcohol Content on Flavor Substances and Microbial

Community Composition of Fast Fermented Zuijiao

WEI Jia-jia1，2， FU Zhong-jie1，2， LUO Ya1， MO Xiao-hui1， JIA Li-rong1，2， DUAN Fei-xia1，2*

（1.College of Biomass Science and Engineering， Sichuan University， Chengdu 610065， China;

2.Key Laboratory of Food Science and Technology in Institutions of Higher Education in

Sichuan Province， Sichuan University， Chengdu 610065， China）

Abstract： Zuijiao is a southwest characteristic spicy and low-stimulation condiment with white wine of high alcohol content （more than 30%） and chili as the main raw materials through low-salt and slow fermentation. Its fermentation cycle is long， and the fermentation principle， flavor characteristics and composition of microbial community are unclear， which restricts the quality and safety control. In this paper， it is found that more than 15% white wine （60%） significantly inhibits the fermentation process of Zuijiao， while 6% white wine makes the fermentation too fast， resulting in its obvious sourness and soft texture. 9% and 12% are the most suitable white wine addition range. After 30 d of fermentation， pH stabilizes at 3.5， total acid content is 13.93～15.92 g/kg. Zuijiao has no sourness， no mildew， and it has a refreshing aroma and good chewiness.The nitrite content is less than 0.8 mg/kg， and the coliform is not detected. GC-MS combined with 16S rDNA and ITS high-throughput sequencing shows that fungal diversity is higher than bacterial diversity. Pichia kluyveri， Pichia membranaefaciens and Cladosporium delicatulum are the dominant fungi， Aspergillus flavus and Aspergillus ochraceus are not detected， and Lactobacillus

plantarum and" Leuconostoc mesenteroides are the dominant bacteria. Lactate， terpenes， sugar alcohol， oligosaccharides and umami amino acids are characteristic flavor substances of Zuijiao.

Key words： Zuijiao; alcohol concentration; fast fermentation; composition of bacterial community; composition of fungal community; lactic acid esterification

收稿日期：2024-03-28

基金項目：成都市科技項目-重點研發(fā)支撐計劃-技術創(chuàng)新研發(fā)項目（2021-YF05-02232-SN）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（C2023127323）

作者簡介：魏佳佳（2002—），女，碩士研究生，研究方向：食品科學與營養(yǎng)健康。

*通信作者：段飛霞（1981—），女，副教授，研究方向：食品科學。

醉椒是西南地區(qū)一種特色辣椒發(fā)酵制品，具有悠久的食用歷史。醉椒以30%～50%質(zhì)量占比的高度白酒與辣椒混合，低鹽慢速發(fā)酵為其工藝特點，以低酸味、高鮮香為風味特點，與四川泡菜、酸菜、豆瓣具有明顯的風味差異，是鮮香味型發(fā)酵辣醬的代表。醉椒辣味明顯，但食用后胃腸刺激感低，現(xiàn)已作為低刺激型復合調(diào)味料、火鍋底料的生產(chǎn)原料使用，以滿足消費者對低胃腸負擔辣味調(diào)味產(chǎn)品的需求[1]，市場前景廣闊。

目前，醉椒主要通過與高濃度白酒混合的傳統(tǒng)自然發(fā)酵法生產(chǎn)，成熟周期較長（6～12個月），生產(chǎn)效率低，難以滿足調(diào)味產(chǎn)品市場需求。此外，醉椒發(fā)酵過程屬于高濃度白酒混合發(fā)酵，高含量的乙醇等物質(zhì)對醉椒微生物的繁殖、演替和代謝產(chǎn)物的影響及其介導醉椒特殊風味形成的原因不明是制約醉椒生產(chǎn)、應用過程中風味、安全性等品質(zhì)控制的關鍵科學瓶頸問題。

因此，本文主要針對醉椒發(fā)酵周期長、發(fā)酵過程中理化特性、微生物特性不明等問題，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS），以及基于16S rRNA和ITS的二代高通量測序技術，結合感官評定、理化實驗、傳統(tǒng)微生物學實驗等，研究初始酒精含量對醉椒發(fā)酵速度、感官性質(zhì)、風味物質(zhì)組成及微生物群落結構的影響，揭示醉椒發(fā)酵的特征風味物質(zhì)和微生物種群特點，并在保持醉椒鮮香、酯香風味的基礎上優(yōu)化得到可有效縮短醉椒發(fā)酵周期的初始酒精含量范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮二荊條：市售；泡菜鹽：四川久大制鹽有限責任公司；60%濃香型白酒：瀘州永昌隆酒業(yè)有限公司；白糖：安琪酵母股份有限公司。酚酞試劑、氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司；E.Z.N.A.Soil DNA Kit Omega 試劑盒：美國Omega公司；瓊脂糖：西班牙Biowest 公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒：美國Axygen公司。

1.2 儀器與設備

pH計 上海浦春計量儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；8890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent 公司；FastPfu Polymerase 北京全式金生物技術有限公司；ABI GeneAmp9700型PCR儀 美國ABI公司；DYY-6C電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.3 醉椒的生產(chǎn)工藝

選取無蟲眼、無腐壞的鮮二荊條辣椒，清洗、切段或搗碎成0.6～1 cm的小段；選取干辣椒，清洗、切段或搗碎、去籽；以鮮辣椒∶干辣椒不低于3∶1的比例混合均勻，為辣椒原料。辣椒原料與10%白糖、4%食鹽、22%水攪拌均勻，分別加入6%、9%、12%、15%的白酒，酒精含量分別為2.29%、3.36%、4.40%、5.39%。將發(fā)酵混合物密封，進行自然發(fā)酵，檢測指標，獲得醉椒成品，醉椒生產(chǎn)工藝流程圖見圖1。

1.4 實驗方法

1.4.1 理化、微生物指標的檢測

以發(fā)酵起始日期為第0天，于第1，2，3，4，6，8，9，10，11，12，13，17，23，26天測定泡菜的pH值、總酸度，取10 mL發(fā)酵液，在14 000 r/min下離心15 min，取上清液用pH計測定pH值[2]，總酸度采用電位滴定法測定[3]。稱取25 g醉椒，放入盛有225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000 r/min均質(zhì)2 min，制成1∶10的樣品勻液，采用大腸菌群MPN計數(shù)法測定大腸菌群數(shù)[4]。亞硝酸鹽含量采用鹽酸萘乙二胺分光光度法測定[5]。

1.4.2 感官評定

選取20位經(jīng)過專業(yè)培訓的評定人員組成感官評定小組進行感官描述檢驗，對發(fā)酵30 d的醉椒的色澤、氣味、滋味、質(zhì)構、有無霉變5個指標進行評分，采用加權平均法，色澤系數(shù)0.2，氣味系數(shù)0.2，滋味系數(shù)0.3，質(zhì)構系數(shù)0.2，有無霉變系數(shù)0.1，具體賦分方式見表1。醉椒感官綜合評分S由各項感官特性的加權平均計算得到，見下式：

S=N1×8+N2×6+N3×210×Xi。

式中：N1為評價“好”，得8分的人數(shù)；N2為評價“較好”，得6分的人數(shù)；N3為評價“較差”，得2分的人數(shù)；Xi為指標系數(shù)。

1.4.3 微生物多樣性檢測

各樣品取10 g發(fā)酵液、10 g發(fā)酵辣椒（距頂5，7.5，10 cm采樣），將固液混合物研磨，加入15 mL離心管中，于－80 ℃貯存。DNA抽提和PCR擴增：采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit（Omega Bio-Tek，Norcross， GA， USA）試劑盒進行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2000紫外可見分光光度計測定DNA濃度、純度；用5′端分別連接樣品特異性8堿基barcode的引物對338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），對16S rDNA基因V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序：95 ℃預變性3 min，27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后4 ℃保存。Illumina MiSeq測序：使用2%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒純化回收產(chǎn)物，用Tris-HCl洗脫，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTM Fluorometer（Promega，USA）對回收產(chǎn)物進行檢測定量，建庫并于 Illumina MiSeq平臺（Illumina，San Diego，USA）上機測序。數(shù)據(jù)處理：使用fastp軟件原始測序序列進行質(zhì)控，使用Flash軟件進行拼接，overlap需大于10 bp。使用uParse軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫（v138），設置比對閾值為70%。

1.4.4 GC-MS測定揮發(fā)性有機物組成

加入雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）（含1%三甲基氯硅烷（TMCS））衍生試劑后，再進行GC/MS分析。

色譜條件：將衍生化后樣品用分流模式注入GC-MS系統(tǒng)進行分析，進樣量1 μL，分流比10∶1。樣品經(jīng)Agilent 122-5532G DB-5MS毛細管柱（40 mm×0.25 mm×0.25 μm）分離后進入質(zhì)譜檢測。進樣口溫度300 ℃，載氣為高純氦氣，載氣流速1 mL/min，隔墊吹掃流速3 mL/min，溶劑延遲5.5 min。升溫程序：初始溫度60 ℃，平衡0.5 min，然后以8 ℃/min的速度升至310 ℃，維持6 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），傳輸線溫度310 ℃，離子源溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式（Scan），質(zhì)量掃描范圍（m/z）：50～500 u，掃描頻率為3.2 scan/s。

將質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫進行匹配，根據(jù)質(zhì)譜匹配度鑒定代謝物。主要數(shù)據(jù)庫為 NIST、Fiehn 以及 MS-DIAL 公共庫。

1.4.5 風味成分評價方法

1.4.5.1 相對氣味活度值

根據(jù)劉登勇等[6]的方法，采用氣味活度值（odor activity value，OAV）評價各化合物對樣品總體風味的貢獻，按下式計算：

OAV=CT。

式中：C為物質(zhì)絕對濃度，T為感覺閾值。

OAVlt;1說明該物質(zhì)對總體風味無實際作用；OAVgt;1說明該物質(zhì)可能對總體風味有直接影響；且在一定范圍內(nèi)，OAV越大說明該物質(zhì)對總體風味的貢獻越大。

由于所研究樣品往往包含幾十甚至上百種揮發(fā)性化合物，絕對定量幾乎不可能。因此，食品風味研究領域一般用化合物的相對濃度（Cr）代替絕對濃度進行分析，即：

Cr≈C。

各化合物的相對濃度可以通過峰面積歸一化法計算得到，各化合物的相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）按下式計算：

ROAVi=100×OAViOAVmax。

OAVmax是OAV最高的物質(zhì)，由下式得到：

ROAVi≈100×CrCmax×TmaxTi。

顯然，所有組分均滿足0lt;ROAV≤100，且ROAV越大的組分對樣品總體風味的貢獻越大。本研究認為ROAV≥1的物質(zhì)為所分析樣品的主體風味成分，但0.1≤ROAVlt;1的物質(zhì)對樣品總體風味也具有比較重要的貢獻。

1.4.5.2 滋味活度值

滋味物質(zhì)的滋味活度值（taste activity value，TAV）的計算公式如下：

TAV=CT。

式中：TAV為味道強度值；C為滋味物質(zhì)的絕對濃度（mg/100 g）；T為滋味物質(zhì)的閾值（mg/100 g）[7]。

通常認為，TAV大于1時，該物質(zhì)對該樣品的呈味有貢獻，且數(shù)值越大，貢獻越大。相反，當TAV小于1時，說明該物質(zhì)對呈味貢獻不大，呈味作用不顯著。

用化合物的相對濃度（Cr）代替絕對濃度進行分析，相對滋味活度值（relative taste activity value，RTAV）按照下式計算：

RTAVi≈100×CrCmax×TmaxTi。

式中：Cr為物質(zhì)相對濃度，T為感覺閾值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

各實驗均重復3次，本文采用平均值±標準差的形式進行數(shù)據(jù)計算和繪圖；采用Origin 2021軟件作圖，采用SPSS 21.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 pH值

由圖2可知，當白酒添加量為6%和9%時，醉椒樣品的pH值快速下降，第6天時降至4.0后逐漸趨于平緩，維持在3.9左右；第26天時，白酒添加量為6%樣品的pH值下降到3.7。當白酒添加量為12%時，樣品的pH值下降較慢，第12天后逐漸穩(wěn)定在3.9。當白酒添加量為15%時，pH值下降極緩慢，到第28天時pH值仍然維持在4.9以上。

發(fā)酵食品中，pH值的降低通常由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸等有機酸濃度增加導致[8]，上述實驗結果表明，白酒對乳酸菌生長的抑制作用與初始濃度呈正相關，當白酒添加量低于15%，即酒精總含量低于6.4%時，乳酸菌在體系中較快增長，前期pH值仍快速下降，在第28天左右達到最低值3.8；白酒添加量為15%（酒精含量6.4%）顯著抑制醉椒發(fā)酵體系中乳酸菌的生長。

2.2 總酸

白酒添加量為6%、9%和12%的樣品中，總酸變化趨勢包括3個階段：短暫的延滯期、快速積累期和穩(wěn)定期。由圖2可知，白酒添加量為6%和9%時，總酸在第12 天左右趨于穩(wěn)定，分別達到13.98，13.93 g/kg；白酒添加量為12%時，總酸含量在第23天后達到峰值15.92 g/kg。在第26天時，在白酒添加量為9%和12%的樣品中觀察到總酸含量下降的現(xiàn)象。白酒添加量為15%的醉椒樣品中總酸含量無顯著增加（P＞0.05）。上述實驗結果與pH值的變化趨勢一致，二者均說明15%的白酒添加量顯著抑制乳酸菌生長繁殖，導致難以發(fā)酵或極長的發(fā)酵周期。

2.3 醉椒感官評定

由圖3可知，各醉椒樣品在色澤上無顯著差異，白酒添加量為6%的醉椒樣品微酸帶異味，質(zhì)構較軟，辣椒皮肉分離；白酒添加量為9%和12%時，醉椒樣品無明顯酸味，有酒香與清香，無霉變，辣椒有咀嚼感，發(fā)酵效果較好；白酒添加量為15%的醉椒樣品無明顯酸味，滋味平淡，無明顯霉變。結果顯示，白酒添加量下降到6%時，產(chǎn)生酸味和異味，可能是由于在此酒精含量下，乳酸菌生長被部分抑制，乳酸積累速度和乙醇濃度均不足以抑制腐敗菌，導致乳酸菌和耐乙醇腐敗菌同時生長，形成不良風味；進一步提高白酒添加量為15%，能有效抑制腐敗菌，同時抑制了乳酸菌的生長，導致發(fā)酵速度變慢；而白酒添加量為9%和12%時，經(jīng)過30 d的發(fā)酵，可獲得具有酯香風味且無明顯酸味的較成熟的醉椒產(chǎn)品。上述現(xiàn)象表明，不同含量的酒精度能通過抑制或調(diào)控微生物生長速度影響醉椒風味的形成。

2.4 微生物多樣性分析

采用基于16S rDNA和ITS的二代高通量測序技術分別研究白酒添加量為6%、9%和12%時醉椒發(fā)酵樣品的細菌和真菌群落結構。

多樣性指數(shù)分析見表2。所有實驗樣品的OTU覆蓋率（coverage）均大于99%，表明本次實驗建立的文庫能夠較準確地反映出待測樣品的微生物多樣性情況[9]。Shannon、Simpson指數(shù)用于計算菌群多樣性（community diversity），Shannon值越大，說明群落多樣性越高，Simpson值越大，說明群落多樣性越低[10]。Chao、ACE指數(shù)用于計算菌群豐度（community richness），指數(shù)越大，說明群落豐富度越高[11]。

由表2可知，白酒添加量為6%的醉椒細菌群落Shannon指數(shù)大于其真菌群落，細菌群落Simpson指數(shù)小于其真菌群落，而白酒添加量為9%和12%的醉椒細菌群落Shannon指數(shù)小于其真菌群落，細菌群落Simpson指數(shù)大于其真菌群落，各樣品的細菌Chao、ACE指數(shù)均大于真菌。上述結果表明，白酒添加量為6%的醉椒細菌群落多樣性大于其真菌群落，白酒添加量為9%和12%的醉椒細菌群落多樣性小于其真菌群落，各組醉椒細菌群落豐富度比真菌群落高。

白酒添加量為6%的醉椒細菌群落Shannon指數(shù)大于白酒添加量為9%和12%的醉椒，Simpson指數(shù)小于白酒添加量為9%和12%的醉椒，而Chao、ACE指數(shù)均小于白酒添加量為9%和12%的醉椒，說明白酒添加量為6%的醉椒細菌群落多樣性更高，豐富度更低。白酒添加量為6%的醉椒真菌群落Shannon指數(shù)小于白酒添加量為9%和12%的醉椒，Simpson指數(shù)遠大于白酒添加量為9%和12%的醉椒，而Chao、ACE指數(shù)均小于白酒添加量為9%和12%的醉椒，說明白酒添加量為6%的醉椒中真菌群落的多樣性和豐富度小于白酒添加量為9%和12%的醉椒，提示真菌群落結構及代謝產(chǎn)物對醉椒發(fā)酵風味物質(zhì)形成具有重要意義。結合感官、pH、總酸實驗結果，認為酒精含量通過差異化干預不同微生物的生長繁殖速度，改變發(fā)酵過程中細菌和真菌群落結構，導致不同的代謝產(chǎn)物積累。

2.5 醉椒細菌群落組成分析

各樣品的稀釋性曲線見圖4中A。由圖4中A可知，3個樣品的細菌測序量基本覆蓋了樣品中所存在的全部物種，說明本研究中樣品豐富度較高，實驗結果科學有效。在門水平上的細菌群落組成見圖4中B。由圖4中B可知，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）是白酒添加量為9%和12%樣品中的主要優(yōu)勢菌。厚壁菌門（Firmicutes）在白酒添加量為12%的醉椒樣品中占88.39%，在白酒添加量為9%的醉椒樣品中占87.63%；變形菌門（Proteobacteria）在白酒添加量為12%的醉椒樣品中占10.75%，在白酒添加量為9%的醉椒樣品中占11.61%。在白酒添加量為6%的樣品中，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）為主要優(yōu)勢菌，占比分別為69.63%和20.34%。

各樣品在屬水平上的細菌群落組成見圖4中C。由圖4中C可知，白酒添加量為9%和12%時，乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）為主要優(yōu)勢菌屬，隨著白酒添加量的增加，乳桿菌屬占比變大，而明串珠菌屬占比變小。乳桿菌屬（Lactobacillus）占比分別為63.95%和73.95%，明串珠菌屬（Leuconostoc）占比分別為22.62%和12.55%。乳桿菌屬（Lactobacillus）是泡菜、酸奶中常見的菌種，明串珠菌屬（Leuconostoc）常見于泡菜、黃酒、發(fā)酵乳中，具有較強的產(chǎn)酸能力和耐酸性，是醉椒酸味物質(zhì)的主要來源。白酒添加量為6%時，假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和一種未知腸桿菌屬為優(yōu)勢菌，其占比分別為37.06%、16.39%、16.97%。低白酒含量無法抑制果膠乳桿菌的生長，會對醉椒的質(zhì)構等品質(zhì)產(chǎn)生不良影響。

各樣品在種水平上的細菌群落組成見圖4中D。由圖4中D可知，在白酒添加量9%、12%的樣品中，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是主要優(yōu)勢菌，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是兩組醉椒中的絕對優(yōu)勢物種。植物乳桿菌在白酒添加量為9%和12%的樣品中占比分別為56.26%和72.68%，而腸膜明串珠菌（L. mesenteroides）占比分別為20.17%和11.23%。白酒添加量越大，植物乳桿菌（L. plantarum）在醉椒中占比越高，腸膜明串珠菌（L. mesenteroides）占比越低，這種差異可能與不同菌種對酒精的耐受程度不同有關。植物乳桿菌（L. plantarum）是益生菌，在食品行業(yè)中通常用于酸奶、泡菜的制作，產(chǎn)生乳酸、抗菌肽、胞外多糖和其他代謝產(chǎn)物[12]，在醉椒發(fā)酵中起重要作用。腸膜明串珠菌（L. mesenteroides）是乳酸菌中的明串珠菌屬的重要菌種，能發(fā)酵糖類產(chǎn)生多種酸類和醇類，具有高產(chǎn)酸能力、抗氧化能力和拮抗致病菌等能力[13]。

在白酒添加量6%的樣品中，植物乳桿菌（L. plantarum）、嗜冷假單胞菌（Pseudomonas psychrophila）和一種未分類的歐文氏菌（Erwiniaceae）是主要優(yōu)勢菌，占比分別為14.88%、36.07%和16.97%。歐文氏菌（Erwiniaceae）是一種植物腐敗菌[14]，可由原料帶入，可能是導致白酒添加量6%的醉椒質(zhì)構、氣味等感官品質(zhì)不良的主要菌種之一。由門、屬、種水平的細菌群落組成可以看出，白酒添加量越小，醉椒細菌群落豐富度越高，這與多樣性指數(shù)結果一致，其原因可能是白酒添加量過低時，無法抑制雜菌生長，導致乳酸菌無法成為絕對優(yōu)勢菌種。

2.6 醉椒真菌群落組成分析

各樣品的稀釋性曲線見圖5中A，3個樣品的細菌測序量基本覆蓋了樣品中所存在的全部物種，說明本研究中樣品豐富度較高，實驗結果科學有效。各樣本門水平上的真菌群落組成見圖5中B。由圖5中B可知，當白酒添加量為9%和12%時，子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）為優(yōu)勢真菌，子囊菌門（Ascomycota）占比達到84.83%和80.89%，擔子菌門（Basidiomycota）占比達到15.12%和18.34%。白酒添加量為6%時，子囊菌門（Ascomycota）是唯一優(yōu)勢菌。

在屬水平上，各樣品真菌群落組成見圖5中C。由圖5中C可知，當白酒添加量為9%和12%時，畢赤酵母屬（Pichia）、枝孢屬（Cladosporium）、假絲酵母屬（Candida）為主要優(yōu)勢菌，在白酒添加量為9%的樣品中占比10.82%、16.83%和9.26%，在白酒添加量為12%的樣品中占比10.65%、22.24%和5.73%。畢赤酵母屬（Pichia）是白酒中主要微生物之一，具有較強的酯化能力，枝孢屬（Cladosporium）廣泛分布于土壤、空氣及各種有機物中，可由原料帶入，可產(chǎn)生多種脂肪酸參與酯化反應，假絲酵母屬（Candida）在白酒酒曲、康磚茶[15]、老面酵頭中均有發(fā)現(xiàn)。在白酒添加量為6%時，畢赤酵母屬（Pichia）和一種未知酵母屬為優(yōu)勢菌，且白酒添加量為6%的樣品在真菌豐富度上遠低于白酒添加量9%和12%的樣品。

在種水平上，各樣品真菌群落組成見圖5中D。由圖5中D可知，白酒添加量為9%和12%時，克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、膜醭畢赤酵母（Pichia membranaefaciens）、皺枝孢菌（Cladosporium delicatulum）是優(yōu)勢真菌，克魯維畢赤酵母（P. kluyveri）占比6.18%和4.90%，膜醭畢赤酵母（P. membranaefaciens）占比4.64%和5.74%，皺枝孢菌（C. delicatulum）占比16.31%和21.78%?？唆斁S畢赤酵母（P. kluyveri）在葡萄酒中被檢出，在葡萄酒品質(zhì)與風味形成中有良好作用[16-17]，有較強的產(chǎn)酸、產(chǎn)酯、產(chǎn)乙醇能力[18]；膜醭畢赤酵母（P. membranaefaciens）可提升草莓、柑橘等水果對青綠霉菌的抗病性[19-20]，在醉椒發(fā)酵過程中可能參與抑制腐敗真菌的繁殖。皺枝孢菌（C.delicatulum）在自然發(fā)酵的腐乳、貴州酸湯中被檢出，與有機酸含量呈負相關[21]，且酯化能力較強。當白酒添加量為6%時，真菌群落豐富度和多樣性極低，克魯維畢赤酵母（P. kluyveri）、膜醭畢赤酵母（P. membranaefaciens）和一種未知酵母菌為優(yōu)勢真菌，總占比達90%以上。

由門、屬、種水平的細菌和真菌群落組成可以看出，白酒添加量越小，樣品細菌群落的豐富度與多樣性越高，而真菌群落的豐富度與多樣性越低，與多樣性指數(shù)的趨勢一致。白酒添加量低于6%時，乙醇濃度低，無法抑制雜菌生長，腐敗菌與乳酸菌同時快速繁殖，發(fā)酵末期細菌群落的豐富度與多樣性高，盡管乳酸菌不是絕對優(yōu)勢菌種，但快速發(fā)酵導致體系pH快速下降，抑制真菌生長，導致發(fā)酵后期真菌的豐富度和多樣性低。而在適宜的白酒添加量下，在發(fā)酵初始腐敗菌生長受到乙醇抑制，在發(fā)酵過程中可能受到乳酸和抗菌肽抑制，形成以乳酸菌為絕對優(yōu)勢菌的細菌群落特點，此外，由于乳酸積累速度更慢，使酵母等真菌在發(fā)酵前期得以增長，為發(fā)酵后期的產(chǎn)香和酯化作用奠定了基礎，從而呈現(xiàn)出較高的真菌豐富度和多樣性。

2.7 生物指標、理化指標

在發(fā)酵第28天檢測各樣品的大腸菌群數(shù)量和亞硝酸鹽含量，結果見表3。

由表3可知，各樣品中均未檢出大腸菌群，與微生物多樣性的結果一致；在白酒添加量為6%、9%、12%和15%的樣品中，亞硝酸鹽含量分別為0.7，0.8，0.8，0.5 mg/kg，均顯著低于國標相關規(guī)定的安全范圍。

2.8 醉椒風味分析

白酒添加量為9%和12%的醉椒樣品衍生化后通過GC-MS檢測的風味物質(zhì)見表4。由表4可知，共檢測到37種風味物質(zhì)，包括2種酯類、2種氨基酸、16種酸類、14種糖類、1種萜類和2種辣椒素類。香氣成分以酯類、脂肪酸、氧化芳樟醇和酸類為主。白酒添加量為9%的醉椒中乳酸乙酯占比23.0%、乳酸甲酯占比0.8%，白酒添加量為12%的醉椒中乳酸乙酯占比14.2%、乳酸甲酯占比1.0%。乳酸乙酯呈甜香、水果香，乳酸甲酯呈酯香，乳酸甲酯在兩組樣品中均為最大揮發(fā)性風味貢獻物質(zhì)。白酒添加量為9%的醉椒中α-亞麻酸的ROAV為0.155 8，白酒添加量為12%的醉椒中α-亞麻酸的ROAV為0.171 4，α-亞麻酸對醉椒風味起到重要作用。白酒添加量為9%和12%的醉椒氧化芳樟醇的ROAV均為0.006，對氣味的貢獻較小。

味覺成分主要為呈味氨基酸、有機酸和寡糖。白酒添加量為9%和12%的醉椒鮮味氨基酸L-谷氨酸的RTAV均為100，白酒添加量為9%和12%的醉椒鮮味增效劑亮氨酸的RTAV分別為1.57，1.02。有機酸檢測到檸檬酸、2-戊酮酸、5-氧代吡咯烷-2-羧酸、酒石酸、乳酸、乙醇酸、2，3，4-三羥基戊酸、酒石酸、琥珀酸、L-蘇糖酸、2，3，5-三羥基己二酸和D-（+）-蘋果酸，其中以檸檬酸具有最大RTAV貢獻，白酒添加量為9%和12%的醉椒酸味物質(zhì)的整體RTAV分別為19.50，31.65。糖類包括阿洛酮糖、半乳糖醇、異麥芽糖、麥芽糖，白酒添加量為9%和12%的醉椒甜味物質(zhì)的RTAV分別為10.49，11.20，整體風味貢獻不大，但寡糖和糖醇作為益生元具有健康益處。

此外，檢測到兩種辣椒素類物質(zhì)，包括辣椒素和二氫辣椒素，白酒添加量為9%的醉椒中辣椒素含量為0.56%，二氫辣椒素含量為0.15%；白酒添加量為12%的醉椒中辣椒素含量為0.80%，二氫辣椒素含量為0.25%。

3 結論

文章通過16S rRNA和ITS的二代高通量測序技術、GC-MS等，發(fā)現(xiàn)細菌和真菌繁殖、代謝共同推進醉椒的自然發(fā)酵成熟過程。乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌（Leuconostoc），尤其是植物乳桿菌（L. plantarum）、腸膜明串珠菌（L. mesenteroides）是主要優(yōu)勢細菌，畢赤酵母屬（Pichia）、枝孢屬（Cladosporium），尤其是克魯維畢赤酵母（P. kluyveri）、膜醭畢赤酵母（P. membranaefaciens）、皺枝孢霉（C. delicatulum）是主要優(yōu)勢真菌，其發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量乳酸酯、萜類、糖醇、寡糖和鮮味氨基酸形成了醉椒的鮮香風味；同時明確了醉椒快速發(fā)酵的適宜白酒添加量為9%～12%（酒精度60%），可有效縮短發(fā)酵周期到1個月。本研究為逐步揭示醉椒發(fā)酵原理、推動醉椒過程中的品質(zhì)和安全性控制提供了數(shù)據(jù)和理論支持。

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