超聲處理對牡蠣肌原纖維蛋白溶解性的影響

摘 要：選擇牡蠣肌原纖維蛋白為對象，以功率200 W、頻率20～22 kHz的超聲為處理條件，分別設(shè)置不同超聲處理時間（0、10、20、30、40、50 min）。通過測定十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、內(nèi)源性熒光、表面疏水性、總巰基含量、游離巰基含量和二硫鍵含量等相關(guān)指標，研究不同超聲處理時間對牡蠣肌原纖維蛋白溶解性的影響。結(jié)果表明：經(jīng)一定時間的超聲處理后，SDS-PAGE的肌球蛋白重鏈條帶明顯加深，但蛋白條帶無明顯變化；肌原纖維蛋白的內(nèi)源性熒光強度降低；此外，肌原纖維蛋白內(nèi)部埋藏的巰基基團暴露并轉(zhuǎn)化為二硫鍵。這些變化均顯著提高了牡蠣肌原纖維蛋白的溶解度，然而，過長時間的超聲處理也會導致蛋白改性過度，從而降低其功能性質(zhì)。本研究結(jié)果為牡蠣肌原纖維蛋白超聲處理提供了理論基礎(chǔ)，并拓展了其在食品溶解性方面的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：超聲處理；牡蠣；肌原纖維蛋白；溶解性

Effects of Ultrasonic Treatment on Solubility of Oyster Myofibrillar Protein

LI Xiaoyan， ZUO Shuojing， LIU Xiaohan， ZHANG Qing， HUAI Xiangqian， SANG Yaxin*

（College of Food Science and Technology， Hebei Agricultural University， Baoding 071001， China）

Abstract： The objective of this study was to examine the impact of ultrasonic treatment on the solubility of oyster myofibrillar protein. Oyster myofibrillar protein was subjected to ultrasonic treatment at 200 W and 20–22 kHz for different durations （0， 10， 20， 30， 40 and 50 min） and evaluated for sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） patterns， endogenous fluorescence intensity， surface hydrophobicity， total sulfhydryl content， free sulfhydryl content， and disulfide bond content. SDS-PAGE results demonstrated a noticeable increase in the intensity of myosin heavy chain bands but no changes in the intensity of protein bands after ultrasonic treatment for a certain period. In addition， the intrinsic fluorescence intensity of myofibrillar protein decreased， which was accompanied by the exposure and conversion into disulfide bonds of hydrophobic groups buried inside myofibrillar protein. These changes significantly improved the solubility of oyster myofibrillar protein. Nevertheless， excessive ultrasonic treatment led to excessive modification of the protein， resulting in a decline in its functional properties. The findings of this study provide a theoretical foundation for the application of ultrasonic treatment to oyster myofibrillar protein and for expanding its potential applications in improving the solubility of food products.

Keywords： ultrasound treatment; oyster; myofibrillar protein; solubility

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240229-044

中圖分類號：TS254.4" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）07-0008-07

牡蠣（Crassostrea gigas）營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)十分鮮美，蛋白質(zhì)含量高達50%以上，素有“海洋牛奶”之稱[1]。

牡蠣所含的蛋白質(zhì)包括肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）、肌漿蛋白和基質(zhì)蛋白，其中MP為牡蠣的優(yōu)質(zhì)蛋白，直接決定著牡蠣產(chǎn)品的感官品質(zhì)和物化性質(zhì)。MP屬于鹽溶性蛋白，需要一定濃度的鹽溶液（＞0.3 mol/L）才能提取，而作為決定蛋白質(zhì)功能特性的主要蛋白質(zhì)，MP由肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白和少量調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)的蛋白構(gòu)成[2]，其功能特性對食品加工有重要影響[3]。

MP具有乳化性[4]、凝膠性[5]和起泡性[6]等功能特征，但多數(shù)蛋白自身的特性往往無法滿足工業(yè)需求。因此需要通過對蛋白進行改性，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行人為修飾改造以提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，從而拓寬蛋白質(zhì)在食品工業(yè)中的應(yīng)用。常見的改性方法有物理改性、化學改性和生物改性。其中物理改性所涉及的方法較多，主要包括超高壓處理技術(shù)、超微粉碎技術(shù)與超聲波技術(shù)[7]。超聲波技術(shù)作為一種環(huán)保、無毒、安全的加工技術(shù)被廣泛應(yīng)用，也被稱為“綠色能源”[8]。根據(jù)超聲波的頻率和強度可以分為高頻超聲和低頻超聲兩種。超聲波改性技術(shù)主要是通過機械效應(yīng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和化學效應(yīng)作用于蛋白質(zhì)，從而進一步改善蛋白質(zhì)的功能特性[9]。Hao Pan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理牡蠣膠原蛋白可以改善蛋白質(zhì)流變性能，并改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，增加其表面疏水性。Yu Cuiping等[11]研究超聲波對牡蠣分離蛋白理化性質(zhì)的影響，并發(fā)現(xiàn)先超聲處理可以提高牡蠣分離蛋白的持油性、乳化活性指數(shù)、乳化穩(wěn)定性指數(shù)、起泡性和泡沫穩(wěn)定性。Tang Ling等[12]研究發(fā)現(xiàn)，高強度超聲處理可以有效提升羅非魚肌球蛋白的溶解度。Jambrak等[13]研究發(fā)現(xiàn)，高強度超聲可以顯著提升大豆蛋白的溶解度。研究表明，不同的超聲處理條件與蛋白種類可能對其理化性質(zhì)的影響不同，目前超聲波技術(shù)對于MP的功能特性改善尚未全面研究報道。

因此，本研究在超聲功率200 W、頻率20～22 kHz的超聲處理下，探究不同超聲處理時間（0、10、20、30、40、50 min）對MP結(jié)構(gòu)變化和溶解度的影響。通過分析MP十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、內(nèi)源性熒光、表面疏水性、巰基和二硫鍵含量等指標反映其溶解度的變化，旨在為超聲波處理蛋白制品和貝類的綜合利用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牡蠣 河北省保定市海鮮市場。

蛋白Maker（10～250 kDa）、5×SDS-PAGE上樣緩沖液 北京賽文創(chuàng)新有限公司；尿素、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（分析純）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、SDS、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5，5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）、8-苯胺-1-萘磺酸鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、考馬斯亮藍G250、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HH-2數(shù)顯水浴鍋 常州國華電器有限公司；Tanon EPS 300電泳儀、Tanon 4600凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；F-320熒光分光光度計 天津港東儀器有限公司；N5000紫外-可見分光光度計 海佑科儀器有限公司；JP96L均質(zhì)機 浙江蘇泊爾股份有限公司；JY92-IIDN超聲波粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原材料預(yù)處理

牡蠣用冰塊運送至實驗室，清洗并剝除外殼，用蒸餾水對牡蠣肉進行2 次沖洗，切成適當大小的塊狀，4 ℃貯藏，備用。

1.3.2 MP的提取

參照Zhang Longteng等[14]的方法并進行適當調(diào)整。將新鮮的牡蠣肉切成小塊，按照1∶4（g/mL）的比例加入磷酸鹽緩沖液A（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，含100 mmol/L

氯化鈉、1 mmol/L EDTA，pH 7）混合，使用均質(zhì)機均質(zhì)90 s，離心（6 790×g、4 ℃、20 min），收集沉淀物，并重復此過程2 次。將沉淀物以1∶4（g/mL）的比例加入磷酸鹽緩沖液B（25 mmol/L磷酸鹽緩沖液，含0.6 mol/L氯化鈉，pH 7），在冰水浴中使用均質(zhì)機均質(zhì)90 s，離心（6 790×g、4 ℃、20 min）并收集上清液，即為MP溶液。通過使用BSA作為標準品，使用雙縮脲法測定MP質(zhì)量濃度。

1.3.3 不同超聲時間處理MP

將所得MP溶液稀釋至5 mg/mL，在功率200 W、頻率20～22 kHz的超聲波下分別處理0、10、20、30、40、50 min，處理后的樣品保存在4 ℃的環(huán)境中，并盡快使用。

1.3.4 SDS-PAGE測定

參考Balange等[15]的方法，并略作調(diào)整。將MP溶液稀釋至3 mg/mL，取20 μL MP溶液與5 μL 5×SDS-PAGE緩沖液混合均勻，水浴加熱10 min。制備10%的分離膠與5%的濃縮膠，使用100 V恒定電壓，直至指示劑靠近凝膠邊緣約5 mm處停止電泳。電泳結(jié)束后，將制備的凝膠用考馬斯亮藍G250進行染色15 min，之后用5%甲醇＋7.5%乙酸脫色液進行脫色處理。脫色結(jié)束后，在凝膠成像儀上進行圖像捕捉。

1.3.5 內(nèi)源性熒光測定

參考Jia Na等[16]的方法。將MP溶液稀釋至0.5 mg/mL，利用熒光分光光度計設(shè)定激發(fā)波長為295 nm，激發(fā)波長和發(fā)射波長狹縫寬度均為10 nm，在315～420 nm發(fā)射波長范圍內(nèi)進行熒光掃描。

1.3.6 表面疏水性測定

參考Liu Xiaohan等[17]的方法，并稍做調(diào)整。將MP溶液稀釋至0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，分別取5 mL稀釋液與25 μL 8 mmol/L ANS溶液（溶于20 mmol/L

磷酸鹽緩沖液，pH 7.5）混合，在25 ℃下黑暗處靜置25 min，利用熒光分光光度計測定激發(fā)波長374 nm和發(fā)射波長485 nm處的相對熒光強度。計算熒光強度與MP質(zhì)量濃度的比值，即為MP的表面疏水性。

1.3.7 巰基含量測定

參考Liu Xiaohan等[18]方法，并稍作修改。采用DTNB方法進行測定。

總巰基含量測定：用磷酸鹽緩沖液B將MP溶液稀釋至1 mg/mL。取0.5 mL MP溶液加入4.5 mL試劑A（8 mol/L尿素、10 mmol/L EDTA、pH 6）中，隨后加入100 μL Ellman’s試劑（0.1 mol/L磷酸二氫鈉、10 mmol/L DTNB，pH 6），充分混勻后，在25 ℃的環(huán)境中避光靜置25 min，利用紫外分光光度計在412 nm波長處測定吸光度?？瞻讓φ战M采用不含DTNB的MP溶液。

游離巰基含量測定：吸取5 mL稀釋后的MP溶液與20 μL 10 mmol/L DTNB溶液混合，在25 ℃的環(huán)境中避光靜置1 h，利用紫外分光光度計在412 nm波長處測定吸光度?？瞻讓φ战M同樣采用不含DTNB的MP溶液。

巰基含量按式（1）計算：

巰基含量/（μmol/g）=A-A₀/ε×p （1）

式中：A為412 nm處樣品的吸光度；A0為412 nm處空白試劑的吸光度；ε為摩爾消光系數(shù)（13 600 L/（mol·cm））；ρ為樣品中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.8 二硫鍵含量測定

二硫鍵含量按式（2）計算：

二硫鍵含量/（μmol/g）=C₁-C₂/2 （2）

式中：C₁為總巰基含量/（μmol/g）；C₂為游離巰基含量/（μmol/g）。

1.3.9 濁度測定

參考Kaur等[19]的方法，并稍作修改。使用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將MP溶液稀釋至1 mg/mL，在25 ℃下靜置30 min，利用紫外分光光度計在340 nm波長下測定吸光度，即為MP的濁度。

1.3.10 溶解度測定

參考Kaur等[19]的方法，并稍作修改。將MP溶液質(zhì)量濃度調(diào)整至5 mg/mL，在4 ℃、6 890×g條件下離心20 min，使用雙縮脲法測定離心前后上清液中的蛋白質(zhì)量濃度。蛋白質(zhì)溶解度按式（3）計算：

溶解度/％=ρ₁-ρ₂×100％ （3）

式中：ρ₁為上清液蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ₂為原液蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均至少重復進行3 次，結(jié)果以平均值±標準差表示。采用SPSS 22.0軟件（芝加哥，IL，USA）進行單因素方差分析，分析數(shù)據(jù)間差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲處理對牡蠣MP SDS-PAGE的影響SDS-PAGE主要反映蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)[20]。

如圖1所示，所有樣品均表現(xiàn)出牡蠣MP典型的蛋白條帶，包括2 條肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）（MHC-1、MHC-2，220 kDa）、M蛋白（97 kDa）、肌動蛋白（44.3 kDa）和肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC，16 kDa）。與對照組相比，超聲處理時間10～40 min時，MHC-1的條帶顏色逐漸變深，但當超聲處理時間達到50 min時，MHC-1的條帶變淺。該結(jié)果表明，隨著超聲處理時間的延長，MHC條帶逐漸加深后變淺，可能是由于超聲波的空化效應(yīng)，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，從而使MHC條帶加深，但隨著超聲時間的持續(xù)延長使蛋白質(zhì)發(fā)生降解，條帶變淺。說明一定時間的超聲處理能夠引起蛋白聚集且形成大分子蛋白。通過與空白組對比，其他小分子質(zhì)量的蛋白條帶并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化，表明超聲處理沒有引起小分子蛋白的聚集，該結(jié)果與Wang Jingyu等[21]的結(jié)果相似。

2.2 超聲處理對牡蠣MP內(nèi)源性熒光的影響

蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光主要反映蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，熒光強度主要由蛋白質(zhì)芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）產(chǎn)生[22]，內(nèi)源性熒光強度發(fā)生變化往往表示蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。如圖2所示，超聲處理后牡蠣MP內(nèi)源性熒光光譜在340 nm左右有一個發(fā)射峰，并且隨著超聲時間的延長，MP熒光發(fā)射峰的位置變化不明顯。但在超聲處理10 min后，最大熒光強度下降，并在30 min時達到最低。經(jīng)超聲處理后，色氨酸氧化，導致熒光發(fā)生猝滅，使熒光強度降低[23]。當超聲時間延長到20 min時，最大熒光強度增加，可能是由于超聲波的空化效應(yīng)可使Trp/Tyr殘基以及蛋白質(zhì)疏水集團暴露，使熒光性增加[24]。當超聲時間延長到30 min時，最大熒光強度顯著下降且達到最低，這是由于Trp/Tyr殘基促進疏水區(qū)域之間的分子間疏水相互作用和聚集體的產(chǎn)生，從而使芳香族氨基酸重新包埋，熒光強度下降。40～50 min熒光強度逐步上升，由于超聲時間過長，蛋白逐漸失活，熒光強度顯著降低。

2.3 超聲處理對牡蠣MP表面疏水性的影響

表面疏水性的變化主要反映蛋白質(zhì)表面疏水基團的數(shù)量以及表征蛋白質(zhì)三、四級結(jié)構(gòu)的變化[25]。如圖3

所示，與對照組相比，超聲處理后的MP表面疏水性均顯著增加（P＜0.05）。并且隨著超聲處理時間的延長，MP的表面疏水性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢并在超聲處理30 min達到最高。與對照組相比，MP經(jīng)過30 min超聲處理后，表面疏水性從935.00±73.87增加到1 332.80±67.34。表面疏水性的增加可能是由于超聲波的空化作用與物理剪切作用產(chǎn)生的活性基團通過氧化暴露蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團，同時物理剪切作用引起的湍流使蛋白質(zhì)分子展開[26-27]。隨著超聲處理時間延長到40 min后，其表面疏水性顯著降低，這可能是由于超聲處理的時間過長，蛋白在表面疏水基團的相互作用下重新聚集包埋，使表面疏水性下降[28]。

小寫字母不同，表示差異顯著（P＜0.05）。圖4～8同。

2.4 超聲處理對牡蠣MP巰基含量的影響

總巰基含量是指暴露在表面與包埋于蛋白內(nèi)部的巰基總和，它表示MP的結(jié)構(gòu)與氧化變化，游離巰基為暴露于蛋白質(zhì)表面的巰基[29]。如圖4所示，所有樣品經(jīng)超聲處理后，總巰基含量均顯著下降（P＜0.05）。與對照組相比，經(jīng)超聲波處理10 min的總巰基含量從（37.81±0.07）μmol/g下降到（36.31±0.15）μmol/g。總巰基含量的降低可能是由于游離巰基在超聲波空化作用下氧化成二硫鍵[30]。隨著超聲處理時間的進一步延長（20～50 min），總巰基含量變化不顯著，可能是由于在空化現(xiàn)象的高壓和剪切力下，一些埋藏的蛋白質(zhì)巰基暴露。

如圖5所示，與對照組相比，經(jīng)超聲波處理后牡蠣MP游離巰基含量顯著下降（P＜0.05），游離巰基含量的降低表明經(jīng)超聲處理后，埋藏在內(nèi)部的巰基基團暴露，轉(zhuǎn)化成二硫鍵。超聲處理時間20～50 min時，游離巰基含量相較于10 min時顯著增加（P＜0.05），說明MP進一步展開，更多的游離巰基暴露[31]。

2.5 超聲處理對牡蠣MP二硫鍵含量的影響

巰基基團的暴露可以通過半胱氨酸的氧化形成二硫鍵，二硫鍵在穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象和保持蛋白質(zhì)活性方面起著重要作用[32]。如圖6所示，與對照組相比，經(jīng)超聲處理后二硫鍵含量均顯著升高（P＜0.05）。經(jīng)超聲處理40 min的牡蠣MP二硫鍵含量達到最高，由未經(jīng)處理的（14.66±0.06）μmol/g上升到（15.17±0.04）μmol/g?？赡艿脑蚴浅曁幚砗蟮牡鞍讕€基基團結(jié)構(gòu)比較松散，使內(nèi)部的巰基暴露，加之超聲波的空化效應(yīng)使水分子解離成羥基活性自由基，進而將自由巰基氧化為二硫鍵，使二硫鍵的含量增加[33]。超聲處理顯著提高二硫鍵的含量，另一方面的原因可能是由于高強度的超聲產(chǎn)生的自由基使蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基氧化形成二硫鍵，誘導蛋白分子的交聯(lián)[34]。

2.6 超聲處理對牡蠣MP濁度的影響

濁度反映蛋白分子的聚集程度，從而反映蛋白顆粒的大小[35]。MP的粒徑變大，吸光度變大，濁度增加。如圖7所示，與對照組相比，經(jīng)超聲處理后的蛋白濁度顯著下降（P＜0.05）。隨著超聲處理時間的延長，MP的濁度呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，并在30 min時達到最低值，即1.049。這可能是因為超聲波的高剪切作用使蛋白質(zhì)的原始結(jié)構(gòu)遭到破壞，同時在超聲空化效應(yīng)的影響下，蛋白質(zhì)的粒徑減小，增加了光散射的比表面積[36-37]，使MP的濁度降低，隨著超聲時間的進一步延長，MP的濁度又逐漸上升，可能是因為超聲引起蛋白質(zhì)的“過度加工”[2]。

2.7 超聲處理對牡蠣MP溶解度的影響

溶解度是蛋白質(zhì)最基本的物理性質(zhì)，同時也影響蛋白質(zhì)的功能特性[13]。如圖8所示，隨著超聲時間的延長，MP的溶解度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。與對照組相比，MP的溶解度在40 min達到最大，為87.09%。溶解度的增加可能是由于超聲波的空化效應(yīng)使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開，造成親水氨基酸暴露，從而使溶解性增加[38]，超聲處理后的蛋白質(zhì)粒徑減小，進而增加了蛋白質(zhì)與水分子的相互作用[39]。Liu Xiaohan等[17]的研究認為，超聲波的空化作用影響了MP中的肌球蛋白含量，因為肌球蛋白的粒徑減小，增加了蛋白-水分子之間的相互作用力，使蛋白質(zhì)的溶解度增加。但隨著超聲時間持續(xù)延長到50 min，蛋白質(zhì)的溶解度下降，可能是超聲時間過長導致親水基團聚集，使氨基酸的溶解度降低，此時蛋白質(zhì)可能已經(jīng)喪失部分功能。

3 結(jié) 論

在超聲功率200 W、頻率20～22 kHz條件下，探究不同超聲時間（0、10、20、30、40、50 min）對牡蠣MP結(jié)構(gòu)修飾、聚集行為和溶解性的影響。結(jié)果表明，適當?shù)某曁幚砟軌蚋淖兊鞍椎臉?gòu)象（SDS-PAGE的MHC條帶加深、穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)以及疏水基團和巰基的暴露），減輕聚集行為（濁度降低），從而獲得較高的溶解度。本研究能為了解超聲處理賦予牡蠣MP良好的溶解性提供關(guān)鍵的見解。

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