腸炎沙門氏菌對雛鴨致病性差異與攜帶毒力基因相關(guān)性研究

摘 要：為了探究腸炎沙門氏菌的致病性差異，選擇7株鴨源腸炎沙門氏菌開展動物試驗，并檢測了20種毒力基因（avrA、sipA、sipC、sopA、ssaB、mgtC、misL、orf319、sopB、siiE、pipC、stn、fimA、spvB、spvD、spvC、sitC、sefA、sifA、pefA）在不同菌株中的分布情況，對毒株致病性與攜帶毒力基因的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，所有腸炎沙門氏菌對雛鴨均有致病性，但致病性存在明顯差異，致死率為12%～87.5%。毒力基因檢測結(jié)果顯示，不同菌株攜帶的毒力基因存在差異，其中SE115、SE161菌株攜帶基因avrA、sipA、sipC、sopA、sopB、ssaB、mgtC、misL、siiE、pipC、stn、fimA、orf319、spvB、spvC、sitC、sefA、sifA、pefA等19種毒力基因；SE60、SE62、SE63菌株除攜帶上述基因外，還攜帶spvD基因；SE39菌株攜帶avrA、sipA、sipC、sopA、sopB、ssaB、

mgtC、misL、siiE、pipC、stn、fimA、orf319、sitC、sefA、sifA、pefAd等17種毒力基因；SE56菌株攜帶avrA、misL、ssaB、spvB、spvD等5種毒力基因。上述結(jié)果說明不同菌株的鴨源腸炎沙門氏菌對雛鴨的致病性存在差異，這種差異與其攜帶毒力基因的數(shù)量和種類有一定相關(guān)性，此研究結(jié)果為進(jìn)一步研究沙門氏菌的致病機(jī)理提供基礎(chǔ)理論。

關(guān)鍵詞：鴨源腸炎沙門氏菌；致病性；毒力基因；相關(guān)性

中圖分類號：S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-1085（2024）09-0006-08

沙門氏菌是世界衛(wèi)生組織列出的最危險的食源性病原體之一[1]。我國是世界上水禽生產(chǎn)第一大國，近30年來，我國鴨、鵝出欄量的年均增長率超過5%，其中鴨肉產(chǎn)量占總禽肉的1/3[2-3]。研究表明，養(yǎng)鴨場沙門氏菌分離率顯著高于養(yǎng)雞場和養(yǎng)豬場[4]。腸炎沙門氏菌成為引發(fā)沙門氏菌病的最主要血清型，已成為養(yǎng)禽業(yè)的主要問題之一[5]。

沙門氏菌可導(dǎo)致從輕度腹瀉至嚴(yán)重全身性感染等不同程度的癥狀，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)和人類的公共衛(wèi)生，且其致病力均與沙門氏菌攜帶的毒力因子相關(guān)。沙門氏菌依靠多種毒力因子在宿主體內(nèi)生存、繁殖和擴(kuò)散，如毒力島（Salmonella pathogen islands，SPIs）、pSLT 毒力質(zhì)粒、菌毛、鞭毛和生物被膜等[6]。徐愛霞[7]研究表明，60株沙門氏菌對受試毒力基因的檢出率為 100%，且單株菌毒力基因至少攜帶14種，最多攜帶23種；致病性研究初步表明致病性與毒力基因的攜帶數(shù)量呈正相關(guān)。本試驗對7株鴨源腸炎沙門氏菌進(jìn)行了致病性試驗和毒力基因檢測，探究鴨源腸炎沙門氏菌致病性與毒力基因攜帶情況的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本研究中的腸炎沙門氏菌是從山東省內(nèi)養(yǎng)鴨場送檢的病料中分離，由本實驗室鑒定、保存，樣本信息見表1。

基金項目：河北省自然科學(xué)基金生物農(nóng)業(yè)聯(lián)合基金培養(yǎng)項目（C2022402048）

第一作者：劉智慧（1999—），女，碩士，家禽傳染病專業(yè)，E-mail：2679712425@qq.com

通信作者：胡峰（1985—），男，副研究員，E-mail：hufengggg@126.com

并列通信作者：劉冠慧（1986—），女，副教授，E-mail：liuguanhui.1986@163.com

收稿日期：2024-07-16

1.2 主要試劑材料

TSA固體培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基，海博生物科技有限公司；2 × Taq Master Mix （Dye Plus）、DL2 000 DNA Marker，康潤生物科技（北京）公司；引物由北京華大基因科技有限公司合成。

1.3 菌液培養(yǎng)

取凍存的腸炎沙門氏菌菌種，TSA固體培養(yǎng)基三區(qū)劃線，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，無菌挑取單菌落至4 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min搖床中培養(yǎng)12 h，收集菌液，計數(shù)，備用。

1.4 致病性試驗

將66只7日齡健康雛鴨隨機(jī)分為8組，其中7組為試驗組，每組8只；1組為對照組，10只。生理鹽水調(diào)整菌液濃度至1×109 CFU/mL，經(jīng)腿部肌肉注射途徑感染雛鴨，0.2 mL/只，對照組按相同方式注射等體積生理鹽水。試驗組與對照組隔離飼養(yǎng)7 d，每日觀察，記錄雛鴨發(fā)病情況。取病死鴨的肝臟進(jìn)行致病菌分離培養(yǎng)[8]。

1.5 PCR擴(kuò)增

按參考文獻(xiàn)[7， 9-10]設(shè)計特異性引物，引物序列、擴(kuò)增片段長度及退火溫度分別見表2、表3。PCR反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix（Dye Plus） 10 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板為菌液1 μL，ddH2O 5 μL，共20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；退火溫度按照不同引物進(jìn)行更改。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀成像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性結(jié)果

致病性試驗結(jié)果顯示，攻毒第1天，SE39株和SE63株感染的雛鴨即出現(xiàn)死亡；攻毒第2天，SE63株和SE115株感染的雛鴨死亡數(shù)量明顯增加；到第7天時，SE39、SE56、SE60、SE62、SE63、SE115、SE161各組的存活率分別為25%、87.5%、50%、37.5%、12.5%、12.5%、37.5%，見圖1；對照組無死亡。攻毒后觀察發(fā)現(xiàn)，試驗組鴨均出現(xiàn)不同程度的跛行、運動障礙等癥狀。死亡雛鴨剖檢可見肝臟、脾臟腫脹、出血，心臟出現(xiàn)心包炎及出血，心臟外膜有黃白色纖維素樣物質(zhì)滲出，出現(xiàn)壞死灶；對照組組織臟器均正常。

無菌蘸取肝臟內(nèi)部組織液接種TSA培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，獲得與目的片段大小一致的條帶，見圖2，證實雛鴨發(fā)病是由接種的腸炎沙門氏菌引起。

2.2 毒力基因檢測

20種毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3。由檢測結(jié)果可知，7株分離菌均攜帶毒力島基因avrA、ssaB、misL。SE115、SE161菌株攜帶基因avrA、sipA、sipC、sopA、sopB、ssaB、mgtC、misL、siiE、pipC、stn、fimA、orf319、spvB、spvC、sitC、sefA、sifA、pefA。SE60、SE62、SE63株除攜帶上述19種基因外，還攜帶spvD基因。SE39菌株攜帶avrA、sipA、sipC、sopA、sopB、ssaB、mgtC、misL、siiE、pipC、stn、fimA、orf319、sitC、sefA、sifA、pefA等17種毒力基因。SE56菌株攜帶5種毒力基因，包括avrA、misL、ssaB、spvB、spvD。7株沙門氏菌毒力基因攜帶情況見表4。

3 分析與討論

家禽是腸炎沙門氏菌的天然感染對象，1周齡以下的家禽中，腸炎沙門氏菌表現(xiàn)為高致病性，急性感染可致死亡[11]。大量研究報道顯示，不同菌株沙門氏菌的致病性存在較大差異。張珍[12]通過小鼠致病性試驗檢測55株沙門氏菌分離株的致病性，結(jié)果顯示所有分離株對小鼠均具有致病性，但致死的時間和劑量有所差異。王德寧[13]檢測雞源沙門氏菌分離株的致病性，結(jié)果顯示菌株表現(xiàn)出強(qiáng)致病性、中等強(qiáng)度致病性、弱致病性，表明菌株的致病性存在差異。本研究致病性試驗結(jié)果表明，7株鴨源腸炎沙門氏菌均可引起雛鴨死亡，但致死時間存在差異；致病性強(qiáng)弱依次為SE63、SE115、SE39、SE62、SE161、SE60、SE56，致死率為12%～87.5%，表明不同菌株、不同來源的沙門氏菌的致病性存在差異。沙門氏菌致病性差異是多種因素共同作用的結(jié)果，其中，菌株中含有的毒力基因數(shù)量、種類是主要原因，可通過檢測菌株的毒力基因攜帶情況來分析沙門氏菌致病性差異的原因。

諸多研究均已表明，沙門氏菌的致病性與攜帶毒力基因的種類存在一定關(guān)聯(lián)[14]。SPI-1～SPI-5是沙門氏菌具有高致病性的分子基礎(chǔ)[15]。殷俊磊等[16]毒力試驗結(jié)果表明，SPI-2毒力島sifA基因缺失后，沙門氏菌的毒力下降，說明sifA基因與沙門氏菌的毒力相關(guān)。曹莉等[17]研究證實SPI-3毒力島基因mgtC與沙門氏菌的致病性密切相關(guān)。戚帥等[18]研究表明SPI-5毒力島基因sopB缺失可促進(jìn)巨噬細(xì)胞壞死。謝曉蕾等[19]毒力試驗結(jié)果顯示，與野生株、回補(bǔ)株相比，sipC基因缺失菌株對BALB/c小鼠的毒力沒有顯著差異。本研究中，7株沙門氏菌含有兩種以上的SPI-1～SPI-5關(guān)鍵毒力基因，且均表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病性，據(jù)此可推測，這些沙門氏菌的致病性與SPI-1～SPI-5的毒力基因密切相關(guān)。沙門氏菌可通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移獲得新的毒力基因，其水平方向的傳遞可使菌株毒力發(fā)生改變，從而改變沙門氏菌對宿主的致病性，毒力質(zhì)粒上的毒力基因更加具有危害性[20]。王德寧[13]對含有毒力質(zhì)?；騭pvC的沙門氏菌進(jìn)行質(zhì)粒消除，結(jié)果表明，質(zhì)粒消除后，菌株的致病性有減弱趨勢。但劉曉艷等[21]研究結(jié)果顯示，spvB/spvC基因缺失對沙門氏菌毒力影響不明顯。研究中發(fā)現(xiàn)，不攜帶spvB、spvC的SE39株的致病性高于攜帶這兩個毒力質(zhì)粒的SE60、SE62株，表明毒力質(zhì)粒spvB、spvC對腸炎沙門氏菌的致病性影響不大。本研究中沙門氏菌的毒力質(zhì)粒spvB檢出率略低于吳植等[22]的檢出率，但高于王喜等[23]和KHOO等[24]的研究結(jié)果，這表明在不同血清型和菌株來源之間，spvB基因的檢出率存在差異。SE56株攜帶基因avrA、misL、ssaB和毒力質(zhì)粒spvB、spvD，致死率較低，為12.5%，這表明基因avrA、misL、ssaB對致病性有一定影響。本研究中所檢測分離株普遍攜帶多重毒力基因，毒力基因攜帶情況復(fù)雜多樣，進(jìn)一步表明本研究所檢測的腸炎沙門氏菌具有較強(qiáng)的致病性。

毒力基因的攜帶數(shù)量對致病性也具有很大影響。本研究中，SE56株攜帶4種毒力基因，表現(xiàn)出最低的致病性；而SE63株攜帶20種毒力基因，致病性最高，表明毒力基因的攜帶數(shù)量能夠直接影響沙門氏菌的致病性。SE56株的低致病性以及攜帶的少量毒力基因，為后續(xù)弱毒疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。SE60、SE62、SE63菌株之間的致死率有差異，但均攜帶20種毒力基因，針對此現(xiàn)象，推測可能是由于毒株存在其他毒力基因、毒力基因出現(xiàn)變異或毒力基因之間相互協(xié)同導(dǎo)致致病性改變造成的。除毒力基因以外，沙門氏菌的致病性還受多種因素控制，包括宿主的免疫狀態(tài)、宿主的飼養(yǎng)條件、混合感染等因素[25]。后續(xù)試驗，可對7株沙門氏菌致病性差異的原因進(jìn)行深入探究。

4 結(jié)論

本實驗室分離鑒定的7株腸炎沙門氏菌的致病性存在顯著差異，且致病性與攜帶的毒力基因種類和數(shù)量有密切關(guān)系。

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Research on the Relationship between the Pathogenicity Variations of Salmonella Enteritidis in Ducklings and the Presence of

Virulence Genes

LIU Zhihui1，2， YAN Zhaoyang1， WEI Kexin2， LI Jitong2， LV Junfeng2， GAO Yuehua2，

HU Feng2 ， LIU Guanhui1

（1.School of Life Science and Food Engineering， Hebei University of Engineering， Handan 056004， China; 2.Shandong Provincial Key Laboratory of Immunity and Diagnosis of Poultry Diseases，

Jinan 250100， China）

Abstract： In order to investigate the pathogenicity of duck-derived Salmonella enteritidis， in this study， animal experiments were carried out with seven strains of duck-derived S. enteritidis and the virulence genes （avrA， sipA， sipC， sopA， ssaB， mgtC， misL， orf319， sopB， siiE， pipC， stn， fimA， spvB， spvD， spvC， sitC， sefA， sifA， pefA） in different strains were detected， then the correlation between strain pathogenicity and virulence genes was analyzed. The results showed that S. enteritidis strains showed different pathogenicity to ducklings， with the lethality ranging from 12% to 87.5%. The results of virulence genes detection showed that different S. enteritidis strains carried various virulence genes. Among them， SE115 and SE161 strains both carried genes of avrA， sipA， sipC， sopA， sopB， ssaB， mgtC， misL， siiE， pipC， stn， fimA， orf319， spvB， spvC， sitC， sefA， sifA， pefA. Despite the genes above， SE60， SE62， and SE63 strains also carried spvD gene. SE39 strain carried 17 virulence genes including avrA， sipA， sipC， sopA， sopB， ssaB， mgtC， misL， siiE， pipC， stn， fimA， orf319， sitC， sefA， sifA， pefA. SE56 strain only carried 5 virulence genes， including avrA， misL， ssaB， spvB， spvD. The results of this study revealed that S. enteritidis strains exhibited different pathogenicity to ducklings， and this pathogenicity was correlated with the amount and type of virulence genes they carried. The results of the study would provide bases for further research on the pathogenic mechanism of S. enteritidis.

Keywords： Salmonella enteritidis; Pathogenicity; Virulence gene; Correlation