從lncRNA NEAT1/miRNA-377-3p調(diào)控角度探討烏頭湯改善骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的實驗研究

【摘 要】目的：探討烏頭湯通過調(diào)控lncRNA NEAT1/miRNA-377-3p對骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的作用機制。方法：飼養(yǎng)C57BL/6小鼠48只，隨機分為空白對照組12只和造模組36只。采用Hulth法制備骨關(guān)節(jié)炎模型，模型建立后，再隨機分為模型對照組、烏頭湯組和硫酸氨基葡萄糖組，每組12只，番紅-固綠染色進行骨關(guān)節(jié)炎模型鑒定。待干預完成后，采用Micro-CT觀察膝關(guān)節(jié)形態(tài)變化，采用Real-time PCR檢測軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1、miRNA-377-3p、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Aggrecan水平變化。結(jié)果：Micro-CT結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型對照組小鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)變形明顯，關(guān)節(jié)間隙嚴重狹窄，骨關(guān)節(jié)面破壞程度高且伴有骨贅形成；與模型對照組比較，烏頭湯組、硫酸氨基葡萄糖組小鼠關(guān)節(jié)變形及損害程度發(fā)生顯著改善。與空白對照組比較，模型對照組lncRNA NEAT1、MMP-9、

MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5水平顯著增高，miRNA-377-3p、Aggrecan相對表達水平顯著降低（P lt; 0.05）；而烏頭湯組可顯著降低lncRNA NEAT1、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5水平，并上調(diào)miRNA-377-3p、Aggrecan水平（P lt; 0.05）。結(jié)論：烏頭湯可改善骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變，與調(diào)控lncRNA NEAT1/miRNA-377-3p有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；烏頭湯；軟骨退變；細胞外基質(zhì)；小鼠

Experimental Study on the Improvement of in Osteoarthritis Cartilage Degenerationby Wutou Tang（烏頭湯）

from the Perspective of lncRNA NEAT1/miRNA-377-3p Regulation

WANG Xiao-ming，TAN Jie，XIE Xin-yu，WANG Hong-xing，LI Peng，JIANG Yun，HU Wei-jian，CHEN Bin

【ABSTRACT】Objective：To investigate the mechanism of Wutou Tang（烏頭湯）in regulating the expres-

sion of lncRNA NEAT1/miRNA-377-3p in osteoarthritis cartilage degeneration.Methods：Forty-eight

C57BL/6 mice were randomly divided into a blank control group（12 mice）and a model group（36 mice）.The Hulth method was used to prepare the osteoarthritis model.After the model was established，it was randomly divided into a model control group，a Wutou Tang group，and a glucosamine sulfate capsule group，with 12 animals in each.The osteoarthritis model was identified using safranin-fast green staining.After the intervention，Micro-CT was used to observe the changes in the morphology of the knee joint，and Real-time PCR was used to detect the changes in the levels of lncRNA NEAT1，miRNA-377-3p，MMP-9，MMP-13，ADAMTS-4，ADAMTS-5，and Aggrecan in cartilage tissues.Results：Micro-CT results show：compared with the blank control group，the joint structure of the model control group was significantly deformed，with severe narrowing of the joint space，high degree of destruction of the bone articular surface，and accompanied by osteophyte formation;compared with the model control group，the degree of joint deformation and damage in mice was significantly improved in the Wutou Tang group and the glucosamine sulfate capsule group.Compared with the blank control group，the levels of lncRNA NEAT1，MMP-9，MMP-13，ADAMTS-4，and ADAMTS-5 in the model control group were significantly increased，while the relative expression levels of miRNA-377-3p and Aggrecan were significantly decreased

（P lt; 0.05）;in the Wutou Tang group，the levels of lncRNA NEAT1，MMP-9，MMP-13，ADAMTS-4，and ADAMTS-5 were significantly reduced，and the levels of miRNA-377-3p and Aggrecan were upregulated

（P lt; 0.05）.Conclusion：Wutou Tang can improve cartilage degeneration in osteoarthritis，which is related to the regulation of lncRNA NEAT1/miRNA-377-3p.

【Keywords】 osteoarthritis;Wutou Tang（烏頭湯）;cartilage degeneration;extracellular matrix;mice

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種好發(fā)于中老年人群的退行性關(guān)節(jié)疾病，其顯著病理特點主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的進行性變性、退化，給社會造成嚴重負擔［1-2］。因此，改善OA患者病情，緩解臨床癥狀是當前亟需解決的關(guān)鍵問題之一［3］。

OA屬中醫(yī)學“骨痹”范疇［4］，伴隨天癸至，肝腎日漸虧虛，正氣失盈，出現(xiàn)腠理空虛，筋骨有失濡養(yǎng)，于外則因風寒濕邪雜至而聚，浸淫關(guān)節(jié)，致使關(guān)節(jié)處經(jīng)絡(luò)痹阻，出現(xiàn)歷節(jié)脹痛，故對骨痹的施治宜行扶正祛邪、祛寒除濕、溫經(jīng)通絡(luò)之法［5］。烏頭湯（源自《金匱要略》）是臨床治療骨痹的常用經(jīng)方，臨床治療OA具有良效［6］。

研究證實，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS）等分泌異常，對包括蛋白聚糖（Aggrecan）等在內(nèi)的細胞外基質(zhì)（ECM）成分造成降解和破壞，進而加劇軟骨退變［7-8］。lncRNA NEAT1作為一種與OA發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的非編碼長鏈RNA［9］，在影響OA進程方面充當了重要的角色［10］。此外有研究證實，miR-377-3p的表達受lncRNA NEAT1的調(diào)控，且兩者間可能存在競爭性關(guān)系［11-12］。但烏頭湯通過調(diào)控lncRNA NEAT1/miRNA-377-3p途徑，影響與關(guān)節(jié)軟骨ECM相關(guān)的MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5和Aggrecan表達，進而延緩OA軟骨退變的作用機制尚需進一步探討。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 48只健康SPF級C57BL/6小鼠，雄性，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017-0005；飼養(yǎng)條件為濕度65%，溫度20～25 ℃，實驗動物實行分籠飼養(yǎng)，自由飲水，標準飼料喂養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK（閩）2019-0007。實驗全部過程及操作均符合福建中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會要求。

1.2 實驗藥物 烏頭湯（制川烏6 g、黃芪9 g、麻黃9 g、白芍9 g、炙甘草 9 g）購于福州市中醫(yī)院；硫酸氨基葡萄糖（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號72011031）。

1.3 實驗試劑和儀器 ChamQ Universal SYBR qPCR

Master Mix（南京諾唯贊，批號027E2201CA）；PCR引物設(shè)計與合成（福州尚亞生物技術(shù)有限公司，批號SY002185）。DNA擴增儀（美國PE公司，型號9600）；無菌操作臺（蘇州安泰有限公司，型號AIRTECH）；小動物Micro-CT（美國PerkinElmer公司，型號Quantum GX2）；電子顯微鏡（德國徠卡公司，型號DM2700P）。

2 方 法

2.1 藥物制備 將烏頭湯組方中制川烏6 g，麻黃、白芍、炙甘草、黃芪各9 g進行純水煎煮制備，煎煮濃縮至含生藥量為4.2 g·mL-1溶液。硫酸氨基葡萄糖膠囊（每粒0.25 g）灌胃前用蒸餾水配至所需濃度［13］。

2.2 動物分組、造模與干預 48只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為空白對照組

12只和造模組36只。造模組動物經(jīng)吸入麻醉（質(zhì)量分數(shù)為5%的異氟醚）后，采用Hulth法誘導OA［14］，即在麻醉狀態(tài)下切斷小鼠膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶、后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，并切除內(nèi)側(cè)半月板。待建立OA動物模型后，再隨機分為模型對照組、硫酸氨基葡萄糖組、烏頭湯組，每組12只。依據(jù)臨床等效劑量換算［6］，烏頭湯組予烏頭湯8.4 g·kg-1·d-1灌胃，硫酸氨基葡萄糖組予硫酸氨基葡萄糖膠囊溶液300 mg·kg-1·d-1灌胃［13］；空白對照組常規(guī)喂養(yǎng)，模型對照組予等量生理鹽水灌胃，灌胃劑量依據(jù)體質(zhì)量（小鼠）按周計算調(diào)整；給藥頻次為每周6次，干預4個療程（2周為1個療程），共計8周。

2.3 番紅-固綠染色進行OA模型鑒定 待手術(shù)造模后2周，選取空白對照組和模型對照組小鼠各3只，將小鼠膝關(guān)節(jié)脛骨平臺通過質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛常溫固定，體積分數(shù)為10%的EDTA脫鈣，制備組織切片。脫蠟至水，蘇木素染色，流水清洗后鹽酸乙醇分化，再次清洗。使用質(zhì)量分數(shù)為0.05%的固綠染色，體積分數(shù)為1%的乙酸酸化。蒸餾水清洗后，使用質(zhì)量分數(shù)為0.5%的番紅O染色，脫水透明，封片。

2.4 Micro-CT觀察軟骨組織病理改變 于末次干預后，隨機選取各組小鼠各3只，使用質(zhì)量分數(shù)為5%的異氟醚麻醉。將各組小鼠右膝關(guān)節(jié)固定在Micro-CT的檢查槽中，設(shè)置條件為：電流666 μA，電壓60 KV，分辨率50 μm，掃描時間30 min。獲取不同斷面的圖片，并對圖像進行重構(gòu)分析。

2.5 Real-time PCR檢測各組軟骨細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1、miRNA-377-3p及相關(guān)基因的相對表達水平 根據(jù)Trizol試劑說明書提取軟骨細胞總RNA，將傳代后的2代軟骨細胞懸液轉(zhuǎn)移到6孔板中，密度為1×105·mL-1，每個孔添加Trizol消化軟骨細胞。隨后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟建立逆轉(zhuǎn)錄體系，設(shè)置條件為37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，最后進行逆轉(zhuǎn)錄。對Real-time PCR擴增曲線和溶解曲線進行確認，使用2－△△CT方法比較目的基因與內(nèi)參基因平均CT值差異，并對結(jié)果進行定量。相關(guān)引物序列見表1。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用雙側(cè)檢驗，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。當結(jié)果具有統(tǒng)計學差異時，進行多重比較。方差齊時采用LSD分析法，方差不齊時采用Games Howell法。以P lt; 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況比較 空白對照組小鼠對外源刺激反應(yīng)迅速，動作靈活，喜活動，膝關(guān)節(jié)處未見異常改變；模型對照組小鼠對外源刺激反應(yīng)緩慢，強化刺激后出現(xiàn)短距離跛行，懶食，手術(shù)造模處膝關(guān)節(jié)腫脹明顯，少活動；烏頭湯組、硫酸氨基葡萄糖組小鼠對外源刺激反應(yīng)相對靈敏，食量增加，此2組小鼠患處膝關(guān)節(jié)腫脹程度均較模型對照組減輕，尤其烏頭湯組改善更明顯。

3.2 番紅-固綠染色鑒定結(jié)果 番紅-固綠染色結(jié)果表明，空白對照組軟骨表面完整，番紅著色均勻，模型對照組小鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨明顯破壞，軟骨表層番紅著色顯著變淺，ECM破壞明顯，提示OA模型造模成功。見圖1。

3.3 Micro-CT比較 與空白對照組比較，模型對照組小鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)變形明顯，關(guān)節(jié)間隙嚴重狹窄，骨關(guān)節(jié)面破壞程度高且伴有骨贅形成；與模型對照組比較，烏頭湯組、硫酸氨基葡萄糖組小鼠關(guān)節(jié)變形及損害程度發(fā)生顯著改善。見圖2。

3.4 各組軟骨細胞中相關(guān)基因水平變化比較 Real-time PCR結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組lncRNA NEAT1、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5表達水平顯著增高，miRNA-377-3p、Aggrecan相對表達水平顯著降低（P lt; 0.05）；與模型對照組比較，烏頭湯組、硫酸氨基葡萄糖組lncRNA NEAT1、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5相對表達水平顯著降低（P lt; 0.05），而miRNA-377-3p、Aggrecan相對表達水平顯著增高（P lt; 0.05）。見表2、表3。

4 討 論

烏頭湯切合OA病機，具有溫陽通絡(luò)、散寒除濕、除痹止痛之效，故有“病歷節(jié)，不可屈伸，烏頭湯主之”［15］。最近研究發(fā)現(xiàn)，烏頭湯可改善膝OA大鼠軟骨NLRP3、Caspase-1、白細胞介素（IL）-1β、IL-18的表達，抑制軟骨細胞焦亡，延緩軟骨退變［16］。另有研究表明，烏頭湯可通過作用于Nrf2/Keap1途徑，進而抑制OA軟骨細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)［17］。既往研究從常規(guī)形態(tài)學染色（如HE染色等）觀察烏頭湯治療OA的作用，結(jié)果顯示，烏頭湯可顯著改善OA關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)，與模型對照組比較，烏頭湯干預后，關(guān)節(jié)軟骨的淺表層切線與關(guān)節(jié)面基本平行且完整，其他各層次相對清晰可辨［18］。本研究運用小動物Micro-CT的活體成像技術(shù)，首次觀察烏頭湯治療OA的療效，結(jié)果顯示，烏頭湯可顯著改善小鼠關(guān)節(jié)變形及損害程度。以上研究表明，烏頭湯治療OA具有良效。

研究表明，軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡在加劇OA軟骨退變過程中扮演重要角色［19］。Ⅱ型膠原（collagenⅡ）作為軟骨細胞ECM的重要成分之一，呈現(xiàn)為一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其作用可聚集蛋白聚糖等成分，并將其鑲嵌其中，為關(guān)節(jié)軟骨提供較強的拉伸度和抗壓力［20］。而MMPs幾乎能降解軟骨ECM所有成分（包括collagenⅡ、Aggrecan等）［21］，而ADAMTS（ADAMTS4和ADAMTS5）則可加速軟骨中蛋白多糖的降解［22］。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，在Hulth法誘導的OA小鼠模型中，其關(guān)節(jié)軟骨的MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5水平顯著增高，而Aggrecan水平顯著降低。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可通過影響軟骨ECM穩(wěn)態(tài)參與OA病程發(fā)展，其中l(wèi)ncRNA NEAT1在調(diào)控OA軟骨ECM穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用［23］。研究顯示，miR-377-3p與lncRNA NEAT1間存在競爭性調(diào)控關(guān)系［24］。綜上，鑒于其內(nèi)在調(diào)控關(guān)系，通過調(diào)控lncRNA NEAT1/miRNA-377-3p改善軟骨ECM穩(wěn)態(tài)失衡是治療OA的重要途徑。本研究結(jié)果證實，與模型對照組比較，烏頭湯組、硫酸氨基葡萄糖組的lncRNA NEAT1、MMP-9、

MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5水平顯著降低（P lt; 0.05），而miRNA-377-3p、Aggrecan水平顯著增高（P lt; 0.05）。其中在lncRNA NEAT1指標上，烏頭湯對其調(diào)控作用優(yōu)于硫酸氨基葡萄糖，這亦與本研究Micro-CT結(jié)果相一致。烏頭湯可改善OA小鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞程度，其作用機制與烏頭湯調(diào)控lncRNA NEAT1、miRNA-377-3p，并改善MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Aggrecan表達密切相關(guān)，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，烏頭湯可延緩OA小鼠軟骨退變，其機制與下調(diào)OA小鼠軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5基因水平，升高miRNA-377-3p及Aggrecan基因水平有關(guān)。同時，本研究仍存在一定的局限性，即烏頭湯調(diào)控lncRNA NEAT1及miRNA-377-3p的功能機制研究，例如沉默lncRNA NEAT1或過表達miRNA-377-3p對OA中ECM的影響及烏頭湯的作用尚需進一步研究。

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收稿日期：2024-02-04；修回日期：2024-03-27