某規(guī)?；翀?chǎng)致奶牛乳房炎停乳鏈球菌的分離鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)

摘要：某規(guī)?；翀?chǎng)乳房炎頻發(fā)，為探究引起奶牛乳房炎情況及分析原因，并制定防控方案。本研究采集某規(guī)模化牧場(chǎng)患臨床型乳房炎的奶樣，采用常規(guī)微生物學(xué)方法，通過分離培養(yǎng)、純化、生理生化鑒定、PCR鑒定以確定種屬，然后采用紙片法對(duì)分離菌的藥敏特性進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，分離到4株停乳鏈球菌，藥物敏感性試驗(yàn)表明該菌株對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林、恩諾沙星高度敏感；對(duì)紅霉素中度敏感；而對(duì)大觀霉素、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑、林可霉素耐藥。牧場(chǎng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合臥床管理、環(huán)境改善、擠奶設(shè)備檢修等措施，很快控制了本次疫情。

關(guān)鍵詞：停乳鏈球菌；分離鑒定；奶牛乳房炎；藥敏試驗(yàn)

停乳鏈球菌是一種革蘭陽性球菌，通常以鏈狀或成對(duì)出現(xiàn)[1]。它可以透過身體的創(chuàng)傷、扁桃體或臍帶等路徑入侵動(dòng)物體內(nèi)的血流，造成菌血癥或敗血癥[2]。奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖過程中的常見病多發(fā)病之一，嚴(yán)重威脅母牛的產(chǎn)奶量和質(zhì)量，該病通常由致病菌感染引發(fā)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，引發(fā)奶牛乳房炎的病原微生物多達(dá)200余種，當(dāng)中以細(xì)菌為主，包括葡萄球菌、大腸埃希菌等20余種。停乳鏈球菌是引起乳房炎的一種，其引發(fā)的乳腺炎發(fā)生率占總發(fā)生率的10%～50%[3]。臨床上，這種疾病常造成乳房腫脹和血奶的出現(xiàn)。目前市場(chǎng)上尚無良好的預(yù)防治療手段，因此，及時(shí)準(zhǔn)確地了解養(yǎng)殖場(chǎng)奶牛乳房炎的病原菌特性非常重要。

該規(guī)?；翀?chǎng)常多發(fā)乳房炎病例，并且由于抗生素治療后會(huì)導(dǎo)致牛奶的廢棄，從而會(huì)使奶產(chǎn)量降低，提高飼養(yǎng)管理成本。為此，本試驗(yàn)采集該牧場(chǎng)牛奶樣品，選擇常規(guī)微生物學(xué)方法，分離鑒定乳房炎奶樣中的病原并進(jìn)行藥敏檢測(cè)，最后給該牧場(chǎng)給一個(gè)綜合性的防控方案，以便盡快控制該牧場(chǎng)乳房炎的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材料

1）樣品。病料來自新疆某規(guī)?；翀?chǎng)，采集20余頭奶牛乳房炎奶樣。

2）試劑。試驗(yàn)所需主要藥品和試劑見表1。

3）儀器。試驗(yàn)所用儀器見表2。

1.2方法

1）樣品采集。在采集樣本之前，先選取癥狀典型的乳房炎奶牛，先對(duì)乳頭進(jìn)行消毒，然后將前5～10 mL的牛奶丟棄，最后在無菌條件下取出約5 mL左右奶牛乳液至15" mL無菌離心管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）細(xì)菌分離純化。為了確保獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，純化過程要保證無菌條件。將奶樣混勻，加300 μL到LB肉湯中，并放至搖床中培養(yǎng)12 h。然后將培養(yǎng)好的菌液按照四區(qū)劃線。在其中挑取合適菌落，置于液體培養(yǎng)基中，放置在搖床中培養(yǎng)24 h。經(jīng)過革蘭氏染色后，通過重復(fù)這些步驟，純化目的菌。

3）形態(tài)學(xué)觀察。將菌液均勻涂在載玻片上，使用革蘭染色法，放至顯微鏡下觀察。

4）PCR鑒定。分離菌純化后，采用特異性引物，引物序列見表3，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系見表4，反應(yīng)程序見表5。

5）生化鑒定。在進(jìn)行細(xì)菌分離和純化擴(kuò)增之后，將取得的菌液接種于過氧化氫酶（CAT）、VP、水楊素、甘露醇、馬尿酸鹽水解酶、乳糖和精氨酸雙水解酶等酶系統(tǒng)中，并在37℃的溫箱中培養(yǎng)36～48 h，以觀察它們的生化特性。

6）藥敏試驗(yàn)。將培養(yǎng)好的菌液使用紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。取100 μL稀釋菌液涂布于瓊脂平板上，待菌液干燥后貼上藥敏試紙，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。記錄抑菌環(huán)直徑，藥敏試驗(yàn)結(jié)果取平均值，據(jù)此判斷對(duì)不同藥物的敏感程度。所用常見10 類抗生素包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、酰胺醇類、喹諾酮類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、硝基呋喃類。

2 結(jié)果與分析

2.1平板培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，細(xì)菌呈現(xiàn)出了圓柱狀，表面光滑，凸出，呈β溶血環(huán)狀（圖1）。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

挑取菌落，純菌培養(yǎng)，經(jīng)過革蘭氏染色，顯微鏡下呈陽性，成雙，單個(gè)，短鏈排列，見圖2。

2.3 PCR鑒定結(jié)果

4株分離菌擴(kuò)增片段大小與目的條帶405bp大小一致（圖3），經(jīng)GenBank對(duì)比，該基因與NCBI數(shù)據(jù)庫上多數(shù)停乳鏈球菌基因同源率高達(dá)98%以上，因此確定該菌為停乳鏈球菌。

2.4 生化鑒定結(jié)果

4株分離株的生理生化特性經(jīng)過CAT、CAMP、VP等實(shí)驗(yàn)測(cè)定，該分離菌與停乳鏈球菌生化特性相同，試驗(yàn)結(jié)果見表6。

2.5" 藥敏試驗(yàn)

4株分離菌如表7所示，菌株均對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林、恩諾沙星敏感度高；對(duì)羅紅霉素敏感度中等；對(duì)大觀霉素、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑、林可霉素表現(xiàn)出耐藥性。

3 分析與討論

奶牛乳房炎是奶牛生產(chǎn)中常見的疾病，嚴(yán)重影響著乳品質(zhì)量和養(yǎng)殖效益[5]。本研究針對(duì)該規(guī)模化牧場(chǎng)中牛群的乳房炎進(jìn)行了病原菌的分離與鑒定。通過結(jié)果，可以更好地了解該疾病的病原菌種類和感染情況，為制定針對(duì)性的防治措施提供依據(jù)。

停乳鏈球菌是奶牛乳房炎的主要致病菌之一，其對(duì)奶牛乳房組織的侵害能力較強(qiáng)，容易引發(fā)炎癥反應(yīng)，并且具有非常強(qiáng)的傳染性和環(huán)境性的特性[6]。盡管目前尚無商品化的有效預(yù)防疫苗。但是通過藥敏試驗(yàn)和一定的預(yù)防手段，可以控制和減少停乳鏈球菌乳房炎的發(fā)生。停乳鏈球菌通過多種代謝途徑對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥，對(duì)一些常見的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制主要是由于攜帶大量耐藥基因[7]。藥敏試驗(yàn)表明該牧場(chǎng)致奶牛乳房炎主要致病菌停乳鏈球菌對(duì)該菌株對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林、恩諾沙星、敏感度高；對(duì)羅紅霉素敏感度中等；對(duì)大觀霉素、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑、林可霉素表現(xiàn)出耐藥性。耐藥性的出現(xiàn)可能與抗生素的濫用或者誤用有關(guān)，因此，合理使用抗生素并制定科學(xué)的防控策略是防止停乳耐藥性進(jìn)一步擴(kuò)散的關(guān)鍵。通過了解鏈球菌的藥敏特性對(duì)于選擇合適的治療方案至關(guān)重要。通過藥敏試驗(yàn)結(jié)果，為該牧場(chǎng)提供合理、科學(xué)用藥，取得了較好的效果。

綜上所述，本研究通過分離、鑒定和藥敏試驗(yàn)對(duì)該規(guī)?；翀?chǎng)中奶牛乳房炎致病菌進(jìn)行了初步研究，為控制乳房炎提供了重要的數(shù)據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)：

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