具有解磷、解鉀和固氮功能的甘薯莖線蟲生防菌的篩選與鑒定

摘要" 為篩選鑒定出具有解磷、解鉀和固氮能力的甘薯莖線蟲生防菌，本研究采集甘薯莖線蟲發(fā)生地的甘薯根際土樣，采用LB固體培養(yǎng)基分離出HC-6、GS3-X4等6個細菌菌株。通過初篩、復(fù)篩和性能測試，從6個菌株中篩選出一種對線蟲病觸殺效果好，定殖能力強，且解磷、解鉀和固氮能力優(yōu)秀的菌株，為GS4-S2；經(jīng)生理生化特征和16S rDNA序列分析鑒定，該菌株為貝萊斯芽孢桿菌菌株，命名為HM-6。該菌株可作為防治甘薯莖線蟲病的微生物菌肥研發(fā)材料，對于線蟲病害防治和菌肥利用具有重要意義。

關(guān)鍵詞" 甘薯莖線蟲??；生防菌；解磷；解鉀；固氮

中圖分類號" S435.31" " " "文獻標識碼" A" " " "文章編號" 1007-7731（2024）17-0079-05

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.17.019

Screening and identification of biocontrol fungi for sweet potato stem nematodes with hydrolyze phosphorus， potassium， and nitrogen fixation functions

SONG Gen1" " ZHANG Baohai1" " WAMG Xing2" "JIA Zhenhua3" " GUO Dingxin1" " FAN Yafei2" " QIAO Yake2

WU Yanhong1" " FENG Jianlong1" " HAN Lili1" " LIU Mingying1" " GAO Yan1" " SONG Chunguang1" " ZHANG Zhiwei2

（1Qinhuangdao Hemiao Biotechnology Co.， Ltd.， Qinhuangdao 066000， China;

2Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066000， China;

3Institute of Biology， Hebei Academy of Sciences， Shijiazhuang 050081， China）

Abstract" In order to screen and identify biocontrol fungi capable of phosphorus， potassium， and nitrogen fixation in sweet potato stem nematodes， soil samples from the rhizosphere of sweet potato stem nematodes in their habitat was collected. Six bacterial strains， including HC-6 and GS3-X4， were isolated using LB solid medium. Through initial screening， rescreening， and performance testing， a strain with good contact killing effect against nematode disease， strong colonization ability， and excellent phosphorus， potassium， and nitrogen fixation abilities was selected from six strains， which was GS4-S2. Based on physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis， the strain was identified as Bacillus Velezensis， and named HM-6. This strain could be used as a material for the development of microbial fertilizers for the prevention and control of sweet potato stem nematode disease， which was of great significance for the prevention and control of nematode diseases and the utilization of microbial fertilizers.

Keywords" sweet potato stem nematode disease; biocontrol fungi; solutions of phosphorus; solutions of potassium; nitrogen fixation

甘薯莖線蟲病是影響甘薯生長發(fā)育的病害之一，田間受害薯塊出現(xiàn)糠心現(xiàn)象，可使發(fā)病田塊減產(chǎn)20％～50％[1]。該病害在一定程度上限制了甘薯相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近年來，在甘薯生長過程中，針對莖線蟲采取了倒茬、清除病殘體、生產(chǎn)無病種薯和培育無病壯苗等諸多農(nóng)業(yè)防治措施，但殺蟲效果仍有待進一步提高[2]?；瘜W藥劑防治是該病害防治的重要手段之一。陳昆圓等[3]研究表明，45%三氟吡啶胺SC對甘薯莖線蟲病的觸殺活性和盆栽防治效果較好，蟲口減退率超過50%。而長期施用化學藥劑可能會使線蟲產(chǎn)生抗藥性，且可能對環(huán)境造成一定的污染。微生物殺蟲劑具有安全、環(huán)?？沙掷m(xù)、防治效果好且成本低等優(yōu)點，成為當前防治甘薯莖線蟲病的研究熱點之一。

農(nóng)作物生產(chǎn)不僅要求高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，同時也要求品質(zhì)優(yōu)良。在當前生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展背景下，減少化肥施用，采用生態(tài)方法促進土壤磷、鉀溶解，提高有效磷、有效鉀含量，對改善土壤結(jié)構(gòu)，促進作物生長具有重要意義。代志等[4]研究表明，土壤中不僅存在能夠抑制和殺死有害生物的生防菌，也存在能夠固定氮素，促進土壤中難溶性磷、鉀釋放的促生菌。孟麗媛等[5]研究指出，按照微生物的作用機理可將其菌肥分為自生固氮菌肥料、解磷細菌肥料、解鉀細菌肥料、抗生菌肥料以及復(fù)合微生物菌肥。當前研究大多集中在單一菌種的作用或多菌種復(fù)合實現(xiàn)菌株多功能化方面，而對于具有多種功能的微生物菌肥研究相對較少。多功能菌種能夠有效解決單一菌種穩(wěn)定性不高，功能單一，以及復(fù)合菌劑菌種間的拮抗作用、菌種生存條件存在差異性等問題[6-7]。本研究以生物技術(shù)手段分離、篩選出兼具多種功能的菌種并對其進行鑒定，以獲得一種應(yīng)用于甘薯莖線蟲病防治的多功能生物制劑（微生物肥），為防治甘薯莖線蟲病的微生物菌肥研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

培養(yǎng)基：解鉀菌培養(yǎng)基、解磷菌培養(yǎng)基、阿須貝氏（固氮）培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基。

種植區(qū)甘薯莖線蟲發(fā)生地自繁的甘薯莖線蟲母液（約含有莖線蟲1 000條/mL）。

儀器設(shè)備：離心機、搖床、顯微鏡、高壓蒸汽滅菌器、細菌培養(yǎng)箱、真菌培養(yǎng)箱、蒸汽消毒器和超凈工作臺等。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 甘薯莖線蟲生防菌的初篩 取甘薯莖線蟲母液20 mL，加入蒸餾水80 mL，配制成莖線蟲200條/mL的懸液，備用。挑取從種植區(qū)甘薯莖線蟲發(fā)生地分離的細菌單菌落，分別編號為HC-6、GS3-X4、GS4-X2、GS2-X5、GS4-X1和GS5-X1，分別置于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃搖床、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h；取出后將發(fā)酵液在離心機10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，再用0.22 μm濾膜過濾，得到發(fā)酵液清液，備用。在12孔板中加入500 μL莖線蟲懸液（含有甘薯莖線蟲100條左右），再加入500 μL的細菌發(fā)酵液清液后搖勻；以不含菌液的LB液體培養(yǎng)基為對照，試驗設(shè)3次重復(fù)。12 h后在顯微鏡下觀察，若線蟲身體僵直不動，轉(zhuǎn)移到清水中12 h后仍不恢復(fù)視為死亡。線蟲死亡率與校正死亡率計算如式（1）～（2）。

死亡率（%）=死亡的線蟲數(shù)量/線蟲總數(shù)×100 （1）

校正死亡率（%）=（處理組的死亡率-對照組的死亡率）/（1-對照組的死亡率）×100 （2）

1.2.2 甘薯莖線蟲生防菌的復(fù)篩 將初篩細菌菌株分別接入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min條件下進行搖瓶培養(yǎng)，用分光光度計檢測OD600吸光度，篩選出繁殖速度快的細菌。

1.2.3 遺傳穩(wěn)定性測試 采用劃線法將細菌菌株在LB固體培養(yǎng)基平板上進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)10代后，采用12孔平板對峙法測定傳代后的菌株對甘薯莖線蟲觸殺的校正死亡率，以原始菌株對線蟲的觸殺死亡率為對照（CK）。若該細菌菌株經(jīng)過10代培養(yǎng)后與原始菌株具有相近的校正死亡率，說明該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。各處理重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.4 定殖能力測試 將復(fù)篩得到的細菌菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)48 h，再將發(fā)酵液配制成含菌量1.0 × 109 cfu/mL的菌懸液，備用。將無菌土與固體發(fā)酵培養(yǎng)基按4∶1的比例均勻混合，裝于直徑10 cm，高11 cm的花盆中，使混合物的總體積達到150 cm3；澆施200 mL配制好的菌懸液，以淡紫擬青霉（DZ）為對照組，將花盆擺在溫室內(nèi)，控制溫度20～28 ℃，每隔4 d澆一次無菌水，15 d后從6 cm處土壤取樣1.0 g檢測所含有效活菌數(shù)，每個菌株5次重復(fù)。計算各菌株在每克土中的定殖數(shù)量和定殖率，定殖率計算如式（3）。

定殖率（%）=定殖數(shù)量/接種數(shù)量×100 （3）

1.2.5 解磷、解鉀和固氮能力測試 在無菌操作下將低溫保存的生防菌分別取一環(huán)，在LB固體培養(yǎng)基上劃線置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細菌37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2 d，真菌28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)4 d，備用。用200 μL移液槍在純化后的菌株平板上打出大小一致的菌餅，備用。將菌餅分別放在解鉀菌選擇性培養(yǎng)基、解磷菌選擇性培養(yǎng)基和阿須貝氏培養(yǎng)基平板上，并做好標記，細菌于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～7 d，真菌于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～5 d。

1.2.6 菌種鑒定 將最終篩選出的細菌菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線單獨培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征；挑取培養(yǎng)基中的單菌落，經(jīng)過革蘭氏染色后于光學顯微鏡下觀察其顏色和特征，并對其進行NaCl耐受度、甲基紅反應(yīng)等生理生化特征試驗；對所篩選的菌株進行16S rDNA基因擴增、測序結(jié)果對比，并建立系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選

2.1.1 初篩 校正死亡率可以反映細菌或真菌對甘薯莖線蟲的觸殺效果，對線蟲校正死亡率高于70%的菌株視為具有觸殺甘薯莖線蟲的能力。各拮抗菌對線蟲病菌的觸殺作用如表1所示，各菌株對線蟲的校正死亡率從大到小依次為HC-6（81.5%）、GS4-X2（81.3%）、GS3-X4（79.7%）、GS4-X1（79.5%）、GS5-X1（77.8%）和GS2-X5（77.6%），均具有良好的觸殺甘薯莖線蟲的能力。

2.1.2 復(fù)篩 菌株繁殖速度越快，發(fā)酵液生物量越高，吸光度越大。細菌菌株發(fā)酵液吸光度檢測結(jié)果如表2所示，繁殖速度較快的3個細菌菌株為HC-6、GS4-X2和GS5-X1，其吸光度分別為5.48、5.73和4.95。

2.2 生防菌的性能測試

為充分發(fā)揮各菌株的生防功能、促生作用，對復(fù)篩獲得的3個優(yōu)良菌株進行了遺傳穩(wěn)定性和定殖能力測試。

2.2.1 遺傳穩(wěn)定性測試 將復(fù)篩菌株培養(yǎng)10代，對比傳代后的菌株對甘薯莖線蟲觸殺的校正死亡率與原始菌株（CK）觸殺死亡率，以評價菌株的遺傳穩(wěn)定性。由表3可知，GS4-X2對線蟲的校正死亡率為81.7%，與原始菌株（82.9%）接近，說明該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.2.2 定殖能力測試 菌株的定殖率越大，則定殖能力越強。與對照相比，若菌株定殖率低于對照組，則說明其定殖能力較差。由表4可見，細菌菌株GS4-X2、GS5-X1的定殖率分別為138%、133%，均高于對照組；細菌菌株HC-6的定殖率為84%，低于對照組。說明GS4-X2和GS5-X1具有較強的定殖能力。

2.2.3 生防菌解磷、解鉀和固氮能力測試 由統(tǒng)計結(jié)果（表5）可知，GS4-X2在具有固氮能力的同時亦具有較高的解磷、解鉀功能，而GS5-X1不具有解磷的功能。GS4-X2的解磷、解鉀以及固氮效果如圖1所示，該菌株能夠在解磷菌選擇性培養(yǎng)基以及解鉀菌選擇性培養(yǎng)基上形成較大且明顯的解磷圈和解鉀圈，進一步說明了其具有優(yōu)秀的解磷、解鉀能力。結(jié)合生防菌的初篩、復(fù)篩以及性能測試結(jié)果，得出GS4-X2為優(yōu)秀促生生防菌。

2.3 菌種鑒定與命名

2.3.1 菌落形態(tài) GS4-X2菌落形態(tài)如圖2所示，該菌落邊緣粗糙且不規(guī)則，起皺呈白色。菌體培養(yǎng)24 h后，未產(chǎn)生色素，培養(yǎng)基顏色無明顯變化。

2.3.2 革蘭氏染色 GS4-X2的革蘭氏染色如圖3所示，觀察到該菌體為桿狀。菌體（1.2～1.5）μm × （2.0～3.0） μm，能運動，有芽孢，革蘭氏染色呈陽性。初步認為該菌株屬于芽孢桿菌。

2.3.3 菌株的生理生化特征 菌株GS4-X2的生理生化特征見表6。該菌株能在各種碳源培養(yǎng)基中生長，其NaCl耐受度、甲基紅反應(yīng)、接觸酶、卵磷脂酶、明膠液化、淀粉水解、阿拉伯糖、溶菌酶抗性、硝酸鹽還原以及檸檬酸鹽利用均呈陽性，吲哚試驗、V-P反應(yīng)呈陰性。

2.3.4 菌株的16S rDNA測序結(jié)果 通過細菌16S rDNA通用引物Primer1：5’-AGAGTTTGATCATG GCTCAG-3’，以及Primer2：5’-TACGGTTACCTTG TTACGACTT-3’以細菌單菌落為模板直接進行PCR擴增。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖4），經(jīng)純化后進行序列測定。結(jié)果顯示，菌株GS4-X2與Bacillus屬的序列有較高的相似性；與OR 551413.1 Bacillus velezensis親緣關(guān)系最近。根據(jù)菌株形態(tài)學構(gòu)建的芽孢桿菌進化樹（圖5）和16S rDNA測序結(jié)果鑒定菌株GS4-X2為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）菌株，命名為HM-6。

3 結(jié)論與討論

貝萊斯芽孢桿菌在自然界分布廣泛，因具有廣譜抗病性，被廣泛關(guān)注[8]。本研究菌株種屬鑒定結(jié)果表明，菌株HM-6為貝萊斯芽孢桿菌。趙曉曼[9]研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌菌株揮發(fā)性有機物熏蒸處理南方根結(jié)線蟲，能夠抑制Re-Mapk-1、Re-flp-18和Mi-ord-1基因的表達，從而殺滅線蟲。本研究細菌觸殺線蟲的試驗中，HM-6的校正死亡率達到81.3%，發(fā)揮了有效殺滅線蟲的作用，與上述研究結(jié)果基本一致。這表明HM-6可能通過抑制基因表達以及產(chǎn)生殺滅線蟲的物質(zhì)以實現(xiàn)對線蟲病的有效防治。

林啟美等[10]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌RGBc13能夠利用各種糖類及淀粉，從空氣中攝取氮素。土壤微生物生命活動時產(chǎn)生的酶、莢膜多糖及有機酸類物質(zhì)可將土壤中的水不溶性無機磷轉(zhuǎn)化為水溶性的無機磷，從而被植物吸收利用，以及將土壤中的礦物鉀、固定鉀分解轉(zhuǎn)化成能被植物吸收的有效鉀[11-13]。本研究將HM-6置于解鉀菌選擇性培養(yǎng)基、解磷菌選擇性培養(yǎng)基和阿須貝氏培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)秀的解磷、解鉀和固氮能力，這可能與其生命活動產(chǎn)生相關(guān)酶有關(guān)。

張雪嬌等[6]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌B151既能夠通過分解秸稈為植株提供養(yǎng)分，又能通過與病原菌的拮抗作用實現(xiàn)病害預(yù)防。本試驗篩選得到的貝萊斯芽孢桿菌HM-6作用與之類似，既能夠?qū)崿F(xiàn)線蟲病的防治，也能夠通過解磷、解鉀和固氮起到促生作用。

本研究以生物技術(shù)手段篩選出兼具多種功能的菌種并對其進行鑒定。篩選出具有觸殺甘薯莖線蟲能力強，解磷、解鉀和固氮能力強，且無拮抗作用的GS4-X2菌株，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌菌株，命名HM-6。該菌株可作為研發(fā)防治甘薯莖線蟲病微生物菌肥的材料，對于甘薯穩(wěn)定生產(chǎn)具有重要意義。

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（責任編輯：李媛）