T/CI 004-2022《高麥黃酮小麥籽粒中游離態(tài)麥黃酮及總麥黃酮含量指標(biāo)和測定方法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)解讀

摘 要：T/CI 004-2022《高麥黃酮小麥籽粒中游離態(tài)麥黃酮及總麥黃酮含量指標(biāo)和測定方法》于2022年2月發(fā)布并正式實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布首次提出了高麥黃酮小麥品種（系）的游離態(tài)和總麥黃酮的含量指標(biāo)并規(guī)范了簡便準(zhǔn)確的測定方法，這將有利于高麥黃酮小麥新品種開發(fā)和營養(yǎng)導(dǎo)向型農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展。為了更好地使相關(guān)人員正確理解和使用該團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，本文對編制背景、主要內(nèi)容、測定方法的優(yōu)勢等進(jìn)行了詳盡介紹。

關(guān)鍵詞：小麥，高麥黃酮，標(biāo)準(zhǔn)解讀

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.08.026

0 引 言

《高麥黃酮小麥籽粒中游離態(tài)麥黃酮及總麥黃酮含量指標(biāo)和測定方法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)由中國國際科技促進(jìn)會標(biāo)準(zhǔn)化工作委員會提出并歸口，該標(biāo)準(zhǔn)是當(dāng)前功能小麥育種領(lǐng)域的一項(xiàng)重要指標(biāo)。該標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布首次確定了高麥黃酮小麥品種的游離及總麥黃酮含量指標(biāo)并對其測定方法進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范，這將有利于高麥黃酮小麥新品種開發(fā)和營養(yǎng)導(dǎo)向型農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展。

1 標(biāo)準(zhǔn)編制背景

小麥富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸以及多種微量元素，是人類和動(dòng)物最主要的營養(yǎng)來源之一，小麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展直接關(guān)系到世界糧食安全和社會穩(wěn)定。小麥不僅僅為人類、動(dòng)物活動(dòng)提供能量來源，而且特殊用途類型的小麥具有一定的藥用價(jià)值。特殊用途品種除了黑色小麥和糯小麥外，也包括高麥黃酮和富硒、富鋅等特殊營養(yǎng)物質(zhì)的品種。黃酮類物質(zhì)包含游離態(tài)麥黃酮、其他黃酮苷元及糖苷衍生物，具有很強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的能力，同時(shí)具有改善心血管疾病癥狀、抗菌抗炎、增強(qiáng)人體免疫力等多重功效。相關(guān)研究表明，含有較高麥黃酮小麥，其抗氧化能力能夠降低心血管疾病發(fā)生的概率，因此，麥黃酮含量較高的小麥?zhǔn)欠浅Ｖ匾墓δ苄云贩N。

近年來，國內(nèi)外多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)開展了高麥黃酮小麥的育種、鑒定技術(shù)研究，但通過廣泛調(diào)研發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外至今仍沒有關(guān)于高麥黃酮小麥品種的游離態(tài)麥黃酮及總麥黃酮含量指標(biāo)定義和規(guī)范，其檢測方法也無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因此，本標(biāo)準(zhǔn)的制定，將首次提出高麥黃酮小麥的游離態(tài)麥黃酮及總麥黃酮含量指標(biāo)，制定高效、準(zhǔn)確且統(tǒng)一的測定標(biāo)準(zhǔn)，對服務(wù)育種家培育更優(yōu)品質(zhì)的高麥黃酮小麥新品種，滿足人民群眾對生活質(zhì)量和健康水平的新需求，確保我國營養(yǎng)導(dǎo)向型農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展來說意義重大。

2 標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容解讀

2.1 術(shù)語及定義

游離態(tài)麥黃酮（Tricin， C17H14O7），又稱麥黃酮、苜蓿素、小麥黃素，化學(xué)名稱為5 ，7， 4 '-三羥基-3'，5'-二甲氧基黃酮。

總麥黃酮（Total wheat flavonoid），即小麥中黃酮類物質(zhì)的總含量。

高麥黃酮小麥，定義為小麥生長發(fā)育過程自然產(chǎn)生和積累的游離態(tài)麥黃酮含量大于0.5 mg/kg（含）或者總麥黃酮含量大于1 g/kg（含）的小麥品種（系）（不含黑、紫、藍(lán)等彩色小麥）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了游離態(tài)麥黃酮、總麥黃酮和高麥黃酮小麥的術(shù)語、定義、范圍，高麥黃酮小麥籽粒中麥黃酮含量指標(biāo)的科學(xué)確定以及小麥籽粒及制品中游離態(tài)麥黃酮含量（高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法）和總麥黃酮含量（分光光度比色法）的檢測方法。

本文件適用于小麥籽粒中游離態(tài)麥黃酮及總麥黃酮含量的精確定量測定。企業(yè)在制定企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)可參照使用，相關(guān)機(jī)構(gòu)在選育、審定和應(yīng)用高黃酮小麥及其制品時(shí)可參照使用。

2.3 小麥籽粒中麥黃酮含量的測定方法（高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法）

2.3.1 原理

試樣用80%乙醇溶液提取，經(jīng)離心濃縮后復(fù)溶，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。根據(jù)麥黃酮的特定分子量和化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過離子碎片質(zhì)譜圖進(jìn)行定性，同時(shí)使用麥黃酮標(biāo)準(zhǔn)品制定定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用外標(biāo)法精確定量。

2.3.2 樣品準(zhǔn)備步驟

小麥籽粒使用震動(dòng)球磨儀（GRINDER GT200）磨碎，過1.0 m m篩，密封并標(biāo)明標(biāo)記。將試樣置于-80℃冰箱保存。

稱取100 mg試樣（精確至0.01 mg）2 mL離心管中，加入1 mL 80%乙醇水溶液，在渦旋混合器上渦旋2 min，超聲處理40 min，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上混勻8 h，13000 r/min離心5 min，取全部上清液至另一干凈離心管中，加入1 mL甲醇，超聲40 min，13000 r/min離心5 min，合并兩次上清液，在氮?dú)獯蹈蓛x上常溫吹干，加入100 μL甲醇復(fù)溶，0.22 μm濾膜過濾后供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

2.3.3 測定

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參考條件（按照GB/T 6041質(zhì)譜分析方法通則和GB/T 16631-2008 高效液相色譜法通則操作）

a） 色譜柱：Hypersil Gold C18（美國 ThermoScientific 公司），3.5 μm，100 mm ×2.1 mm（內(nèi)徑）或相當(dāng)者；

b） 流動(dòng)相及梯度洗脫條件見表1；

c） 柱溫：35 ℃；

d） 進(jìn)樣量：5 μL；

e） 電離源模式：電噴霧離子化；

f） 電離源極性：負(fù)離子模式；

g） 霧化氣：氮?dú)猓?/p>

h） 離子噴霧電壓：2500 V；

i） 霧化氣溫度：317 ℃；

j） 離子傳輸管溫度：333 ℃；

k） 監(jiān)測離子對及碰撞氣能量見表2。

2.3.4 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別稱取5.0 mg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配得500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（標(biāo)準(zhǔn)溶液避光-40℃保存，保存期為一年）。用甲醇稀釋得到濃度為0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5μg/mL的系列溶液，0.22 μm濾膜過濾后供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。以峰面積為縱坐標(biāo)，麥黃酮濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.5 結(jié)果計(jì)算和表述

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量結(jié)果按公式（1）計(jì)算：

式中：X i—試樣中被測組分含量，mg/kg；c i—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的被測組分溶液濃度，μg/mL；V—樣品溶液定容體積，mL；m —樣品溶液所代表試樣的重量，g。

結(jié)果保留三位有效數(shù)字，絕對差值不得超過平均數(shù)的5%。

2.4 總黃酮含量的測定方法 （分光光度比色法）

2.4.1 原理

試樣用80%乙醇溶液提取后，溶于乙醇的黃酮類物質(zhì)與鋁離子顯色劑結(jié)合，形成有色物質(zhì)，在510nm波長附近產(chǎn)生最大吸收，一定濃度范圍內(nèi)，吸光度與總黃酮含量成正比，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對獲得總黃酮含量。

2.4.2 樣品準(zhǔn)備步驟

小麥籽粒使用震動(dòng)球磨儀磨碎，密封并標(biāo)明標(biāo)記。將試樣置于-80 ℃冰箱保存。

稱取1.0 g試樣（精確至0.01 g）于15 mL離心管中，加入10 mL 60%乙醇溶液，混勻，超聲處理60min，期間每20 min搖勻溶液一次，9500 r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，加4%氫氧化鈉溶液4 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻后放置15 min，以不加樣品液為空白，搖勻后用5cm的比色皿，在510 nm處測定吸光度。

2.4.3 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱量13.2 mg蘆丁，用60%乙醇定容到25 mL容量瓶作為標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液。

準(zhǔn)確吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，放入10 mL容量瓶內(nèi)（寫明標(biāo)記），分別加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL的60%乙醇溶液；再加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，放置6 min后；加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，加60%乙醇定容，搖勻后，放置15 min；以不加蘆丁對照品溶液為空白，采用分光光度法在510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.4 結(jié)果計(jì)算和表述

總黃酮含量（干基）按蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，按公式（2）進(jìn)行計(jì)算：

式中：ω—總黃酮含量，g/kg；m —由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品溶液中蘆丁質(zhì)量，mg；W—樣品的質(zhì)量，g；d —稀釋比例。

結(jié)果保留三位有效數(shù)字，絕對差值不得超過平均數(shù)的5%。

3 確定高麥黃酮小麥品種中的游離麥黃酮及總麥黃酮含量

關(guān)于小麥中游離態(tài)麥黃酮含量的測定，僅2009年趙善倉[1]等人采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定了14個(gè)小麥品種（系）籽粒中游離態(tài)麥黃酮含量，發(fā)現(xiàn)游離態(tài)麥黃酮含量最高的品種為黑小麥76，達(dá)379 μg/kg，最低的品種為VICTO，僅含有47.1 μg/kg，且品種間游離態(tài)麥黃酮含量存在極顯著差異。

本團(tuán)隊(duì)使用上述液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對四十余種常見小麥品種的游離態(tài)麥黃酮含量進(jìn)行了精確定量檢測，結(jié)果表明，這些小麥籽粒中游離態(tài)麥黃酮含量最低的品種僅為50.33 μg/kg，最高的品種為577.48 μg/kg，進(jìn)一步確認(rèn)了不同品種間游離態(tài)麥黃酮含量的差異性。

而本文件主要研究材料“山農(nóng) 101”（區(qū)試號：山農(nóng)黃酮麥 1 號）于2020 年通過山東省農(nóng)作物品種審定委員會審定（魯審麥 20206035），是國內(nèi)審定的第一個(gè)高黃酮小麥新品種。經(jīng)山東省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所以蘆丁比色法測定，其總麥黃酮含量1.013 g/kg，是普通小麥平均含量的3.5～5倍。

綜合考慮國內(nèi)外小麥品種（含育種資源）中的麥黃酮含量范圍，同時(shí)也照顧到實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上種植高麥黃酮小麥品種產(chǎn)量、抗性及農(nóng)藝性狀的要求，本標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為，將游離麥黃酮含量高于0.5 mg/kg（含）或者總麥黃酮含量高于1 g/kg（含）的小麥品種（系）定義為高麥黃酮小麥品種（系）是合適的。

4 測定方法優(yōu)勢

關(guān)于游離態(tài)麥黃酮含量的測定目前已有一些報(bào)道，如趙善倉[1]、Estiarte[2]、凌俊紅[3]、Tian[4]以及Meng[5]等人均采用高效液相色譜（HPLC）法分別測定了竹葉、大麥芽、小麥葉片和小麥籽粒中的游離態(tài)麥黃酮含量。而國內(nèi)關(guān)于游離態(tài)麥黃酮的檢測標(biāo)準(zhǔn)只有一個(gè)廣西地方標(biāo)準(zhǔn)DB45/T 1177-2015《山銀花中苜蓿素的測定 高效液相色譜法》，其中涉及的檢測方法耗時(shí)較長（25分鐘/樣品），且單純采用的是液相方法，難于應(yīng)用于小麥籽粒復(fù)雜基質(zhì)中微量游離態(tài)麥黃酮的精確定性定量。國外方面，歐盟、英國和美國則沒有查詢到關(guān)于麥黃酮的任何檢測標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)建立了一種精確檢測小麥籽粒中游離態(tài)麥黃酮含量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法基于2009年田紀(jì)春課題的方法進(jìn)行改造，利用三重四極桿高效液相質(zhì)譜法進(jìn)行定量檢測，并針對小麥籽粒進(jìn)行了提取方法優(yōu)化改進(jìn)，大大簡化檢測步驟，提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，單位樣品檢測耗時(shí)小于10分鐘。

關(guān)于總麥黃酮的檢測已有眾多報(bào)道[6 ]，同時(shí)有三個(gè)已經(jīng)執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 20574-2006、NY/T1295-2007、DB34/T 2743-2016）列出了蜂膠、蕎麥和槐米中總麥黃酮的檢測方法，小麥及其制品中的總麥黃酮尚未有現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)建立了一種檢測小麥籽粒及其制品中總麥黃酮含量的分光光度比色法方法，根據(jù)小麥及其制品的特性對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。

目前，本單位已經(jīng)使用標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并已經(jīng)進(jìn)行了上百個(gè)實(shí)際樣品的檢測和定量分析，驗(yàn)證了方法的可行性和穩(wěn)定性。

5 結(jié) 語

麥黃酮是小麥籽粒中重要的抗氧化劑和生理活性物質(zhì)，可降低環(huán)加氧酶活性的，具有擴(kuò)張血管、抗菌消炎、增強(qiáng)人體免疫力等多重功效。日常飲食中攝入的黃酮類化合物能夠減少心臟病等疾病的發(fā)病率。食用高麥黃酮小麥能夠提高人們自身的免疫力和患者治愈率，減少心臟病等疾病的發(fā)病率[7]，對個(gè)人和社會來說都是最經(jīng)濟(jì)有效的方法。

近年來，膳食不良成為我國導(dǎo)致死亡的第一大因素，因此，全球農(nóng)業(yè)發(fā)展研究的熱點(diǎn)聚焦于探尋農(nóng)業(yè)、營養(yǎng)、健康的關(guān)系。隨著《主要農(nóng)作物品種審定標(biāo)準(zhǔn)》（國品審〔2017〕1號）的發(fā)布，我國的農(nóng)作物育種導(dǎo)向也發(fā)生了重大變化，營養(yǎng)導(dǎo)向型農(nóng)業(yè)和功能作物品種迎來了前所未有的發(fā)展機(jī)遇。本標(biāo)準(zhǔn)的制定，首次提出了高麥黃酮小麥品種（系）的含量指標(biāo)，并使其檢測方法具有明確的依據(jù)。通過標(biāo)準(zhǔn)的解讀，可使小麥育種、種植、檢測行業(yè)相關(guān)單位和機(jī)構(gòu)更好地理解標(biāo)準(zhǔn)中內(nèi)容的確定依據(jù)，為標(biāo)準(zhǔn)的順利實(shí)施和有效推廣奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]趙善倉，趙領(lǐng)軍，谷小紅，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定小麥籽粒中麥黃酮[J].分析化學(xué)，2009 37（6）：873-876.

[2]ESTIARTE M， PENUELAS J， KIMBALL B A， et al. Freeair CO2 e nrichment o f wheat： leaf f lavonoid c oncentration throughout the growth cycle[J]. Physiologia plantarum，1999， 105（3）： 423-433.

[3]凌俊紅，王楠，任玉珍，等. HPLC法測定大麥芽中麥黃酮[J].中草藥，2005（11）：1632-1634.

[4]田向軍，邱宗波，劉曉，等.增強(qiáng)UV-B輻射對小麥葉片黃酮類化合物日變化的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007（3）：516-521.

[5]MENG Y， KRZYSIAK A J， DURAKO M J， et al. Flavones and f lavone glycosides from Halophila johnsonii[J].Phytochemistry， 2008， 69（14）： 2603-2608.

[6]胥倩，苗永輝，劉振，等.特殊顏色谷物研究進(jìn)展和小麥相關(guān)新品種創(chuàng)制[J].糧油食品科技， 2021，29（2）：41-49.

[7]田紀(jì)春，胥倩.功能性小麥品種的概念、類別和發(fā)展前景[J].糧油食品科技，2021，29（2）：1-8.

作者簡介

劉振，碩士，工程師，主要研究方向?yàn)榇x組學(xué)在小麥育種

中的應(yīng)用。

（責(zé)任編輯：張瑞洋）

基金項(xiàng)目：本文受山東省科學(xué)技術(shù)廳省級人才工程項(xiàng)目“泰山產(chǎn)業(yè)專家計(jì)劃”（項(xiàng)目編號：NO. tscy20221172）資助。