非洲馬瘟病毒和西尼羅病毒雙重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應用

摘" 要： 本研究旨在建立一種可同時檢測非洲馬瘟病毒（African horse sickness virus， AHSV）和西尼羅病毒（West Nile virus， WNV）的雙重熒光定量RT-PCR檢測方法。根據AHSV VP7基因序列和WNV Poly Protein基因的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，優(yōu)化反應條件及體系，繪制標準曲線，對其特異性、敏感性和重復性進行測定，并采用該方法對臨床樣品進行檢測驗證。結果顯示：該方法能夠同時檢測AHSV和WNV，且特異性良好，與馬動脈炎病毒、馬皰疹病毒1型、馬傳染性貧血病毒、馬腺疫鏈球菌、馬流感病毒等馬病核酸均無交叉反應；敏感性高，AHSV和WNV最低檢測限均為10 copies·μL-1；組內變異系數為0.04%～0.93%，組間變異系數為0.17%～4.83%，重復性良好；使用該方法對30份馬全血樣品進行檢測，結果均為陰性。本試驗建立的檢測方法對馬屬動物檢疫、非洲馬瘟和西尼羅熱的監(jiān)測與防控具有重要意義。

關鍵詞： 雙重熒光定量RT-PCR；非洲馬瘟病毒；西尼羅病毒

中圖分類號：S852.659.4;S852.659.6

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5873-07

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.048

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2023-12-12

基金項目：外來動物疫病傳入溯源精準診斷技術與產品研究（2022YFD1800503）

作者簡介：錢佳豪（1998-），浙江金華人，主要從事人畜共患病研究，E-mail： 1318672013@qq.com

*通信作者：沈青春，主要從事動物支原體、布魯氏菌病防控及其生物信息學研究，E-mail： shenqingchun@caas.cn；王春鳳，主要從事新型動物微生態(tài)制劑研究，E-mail： wangchunfeng@jlau.edu.cn

Establishment and Application of Dual TaqMan Fluorescence RT-PCR Detection Method for African Horse Sickness Virus and West Nile Fever Virus

QIAN" Jiahao1，2， LIU" Dan1， ZHOU" Shizhong1， ZHANG" Boyuan1， GAO" Jianshuai1， JIANG" Hui1，

FAN" Xuezheng1， ZHANG" Guangzhi1， DING" Jiabo1， WANG" Chunfeng2*， SHEN" Qingchun1*

（1.Key Laboratory of Animal Biosafety Risk Prevention and Control （North）， Institute of

Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China;

2.College of Veterinary Medicine， Jilin Agricultural University， Changchun 130118，" China）

Abstract：" This study aimed to develop a dual-fluorescence quantitative RT-PCR detection method capable of simultaneously identifying African horse sickness virus （AHSV） and West Nile virus （WNV）. Specific primers and probes were designed based on highly conserved regions of the AHSV VP7 gene and WNV Poly Protein gene. The reaction conditions and system were optimized， standard curves were established， and the method's specificity， sensitivity， and reproducibility were assessed. Clinical sample testing was conducted to validate the method. Results demonstrated that the method could effectively detect both AHSV and WNV with excellent specificity. No cross-reactivity was observed with equine arteritis virus （EAV）， equid Herpesvirus-1 （EHV-1）， equine infectious anemia virus （EIAV）， Streptococcus equi subsp. zooepidemicus （SEZ）， equine influenza virus （EIV） and other equine nucleic acids. The method exhibited high sensitivity， with the lowest detection limits for AHSV and WNV both at 10 copies·μL-1. Intra-assay coefficients of variation ranged from 0.04% to 0.93%， inter-assay coefficients of variation ranged from 0.17% to 4.83%， demonstrating good reproducibility. Testing 30 equine whole blood samples using this method yielded negative results. The detection method established in this study holds significant importance for equine animal quarantine， monitoring， and control of African horse sickness and West Nile fever.

Key words： duplex real-time RT-PCR; African horse sickness virus; West Nile virus

*Corresponding authors： SHEN Qingchun， E-mail： shenqingchun@caas.cn; WANG Chunfeng， E-mail： wangchunfeng@jlau.edu.cn

非洲馬瘟（African horse sickness， AHS）是由非洲馬瘟病毒（African horse sickness virus， AHSV）引起的馬屬動物急性或亞急性的蟲媒傳染病，死亡率可達95%，主要通過蚊蟲叮咬傳播，感染馬通常表現出呼吸急促、發(fā)熱、浮腫、出血，甚至死亡。1987—1991年，AHSV在歐洲暴發(fā)對歐洲馬業(yè)產生了不可估量的損失［1-4］。AHS主要在非洲地區(qū)廣泛流行，近年來已擴散到亞洲等地區(qū)，給多個國家的馬產業(yè)造成了巨大的損失［5-9］。西尼羅熱（West Nile Fever， WNF）是一種由西尼羅病毒（West Nile virus， WNV）引起的人畜共患傳染性疾病，也主要通過蚊蟲叮咬傳播，人類、鳥類、馬及其他哺乳類動物感染后，主要表現為發(fā)熱、頭痛、腦炎等癥狀。該病具有宿主范圍大、流行性強、致病性高的特點，最初在非洲地區(qū)流行，后來擴散到其他地區(qū)，包括亞洲、歐洲、北美和澳大利亞等地，每次暴發(fā)均能對人類與動物造成嚴重危害［10-15］。2012年，美國多個州出現了歷史性的大規(guī)模西尼羅熱暴發(fā)，據統(tǒng)計當年共確診了5 674例西尼羅病毒病例，其中2 873例報告為西尼羅病毒，死亡人數達286人［16，17］。

我國目前還未出現非洲馬瘟和西尼羅的感染病例，但隨著國際交流的日益頻繁，面臨的風險逐漸加大。我國農業(yè)農村部印發(fā)的關于《國家動物疫病監(jiān)測與流行病學調查計劃（2021—2025年）》的通知中強調要對馬屬動物其中的這兩種疫病進行嚴格監(jiān)測。當前針對這兩種疫病仍沒有有效的治療藥物，主要依靠預防為主，為此有效快速的診斷技術是防止疫病傳播的前沿防線［8，18］。

AHSV和WNV均為RNA病毒，都可感染馬屬動物，且均通過蚊蟲傳播。本研究基于熒光定量RT-PCR檢測方法，針對AHSV的VP7基因和WNV多聚蛋白（poly protein）基因設計并合成檢測引物和探針，建立了一種能夠檢測非洲馬瘟和西尼羅病毒雙重TaqMan 熒光定量 RT-PCR 方法，旨在提高非洲馬瘟和西尼羅病毒感染的診斷和監(jiān)測水平，有望為疫情控制和研究提供技術支持。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 病毒與臨床樣本

病毒包括馬動脈炎病毒（equine arteritis virus， EAV）、馬皰疹病毒1 型（equid Herpesvirus-1， EHV-1）、馬傳染性貧血病毒（equine infectious anemia virus， EIAV），馬腺疫鏈球菌（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus， SEZ）、馬流感病毒 H3N8（equine influenza virus， EIV） 由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所提供，30份馬血樣本采集自天津某馬場。

1.1.2" 主要試劑

Hifair V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR （11142ES60" Yeasen）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，質粒小量提取試劑盒（D6943-01 Omegabiotek）購自廣州飛揚生物工程有限公司，PCR八連管購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。

1.1.3" 主要儀器

熒光定量 PCR 儀（Applied BiosystemsTM 7500）購自賽默飛世爾科技公司，Qubit 4 熒光計購自Thermo Fisher Scientific有限公司，Milli-Q IQ 7000 超純水凈化系統(tǒng)購自Millipore美國，-40 ℃冰箱購自松下電器（中國）有限公司，離心機和移液器均購自德國 Eppendorf公司。

1.2" 方法

1.2.1" 引物設計與合成

根據GenBank中收錄的AHSV所有VP7基因序列和近三年世界范圍內流行的WNV全序列，應用SnapGene（V6.0.2）軟件進行序列比對，分析共有序列并設計AHSV和WNV的特異性引物和探針，熒光修飾選擇FAM以及VIC熒光基團，引物和探針均由北京睿博興科生物技術有限公司合成，引物、探針序列見表1。

1.2.2" 標準質粒的構建

根據在NCBI搜集到AHSV以及WNV的序列，針對AHSV的VP7基因以及WNV的多聚蛋白（poly protein）基因，選擇可以覆蓋熒光定量擴增區(qū)域的基因片段序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并連接至pUC57 載體構建重組質粒，測序鑒定序列正確。重組質粒分別命名為pAHSV-VP7、pWNV-Poly。使用Qubit4測定pAHSV-VP7、pWNV-Poly重組質粒的濃度均為40 μg·mL-1，根據公式：6.02×1023copies·mol-1×（濃度）/［MW（g·mol-1）］=copies·mL-1。其中，平均分子質量（MW）：dsDNA=堿基數×660道爾頓/堿基，計算出標準質粒pAHSV-VP7、pWNV-Poly濃度分別為1.2×1010、1.0×1010 copies·μL-1。

1.2.3" 反應體系的建立與優(yōu)化

以標準質粒為模板，制備總體積為20μL的反應體系，并分別對各引物濃度（0.1～1.0 μmol·L-1）、探針濃度（50～250 nmol·L-1）、退火溫度（56～60 ℃）進行優(yōu)化。反應程序：50 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，退火 30 s（采集FAM以及VIC熒光信號），45 個循環(huán)。

1.2.4" 標準曲線的建立

分別將2種質粒標準品10倍倍比稀釋后，取101～108稀釋度，即含1.2×108～1.2×101 copies·μL-1 pAHS-VP7、1.0×108～1.0×101 copies·μL-1 pWNV-POLY的質粒以及二者混合物分別作為模板，采用優(yōu)化的TaqMan熒光定量RT-PCR體系進行擴增，以不同濃度的質?？截悢档膶抵?lg（X）為 X軸，以與其所對應的 Ct值作為 Y 軸，繪制標準曲線，計算擴增效率，E=［10-（1/slope）-1］×100%。

1.2.5" 特異性測試

分別以 EAV、EHV-1、EIAV、 SEZ、EIV的病毒核酸作為樣本，采用上述優(yōu)化好的方法進行 RT-PCR擴增，檢測該方法的特異性。

1.2.6" 敏感性檢驗

取濃度為1.0×108～1.0×101 copies·μL-1的兩種重組質?；旌虾笞鳛槟０?，按照建立的雙重RT-PCR方法擴增，每個陽性質粒做3次重復，確定本研究建立的方法的敏感性以及最低檢出限。

1.2.7" 重復性試驗

分別用1.0×108～1.0×101 copies·μL-1的質粒標準品混合物稀釋液，每個濃度設置3個重復，每個試驗重復3次，計算組內和組間的標準差及變異系數，評價方法的重復性。

1.2.8" 臨床樣本檢測

提取30份馬血樣本中的核酸，并用已優(yōu)化的雙重實時熒光定量RT-PCR進行檢測，對該方法的敏感性、特異性進行驗證。

2" 結" 果

2.1" 最佳反應條件

經過對引物、探針濃度及退火溫度分別進行優(yōu)化，獲得最佳反應體系：2×Hifair Ⅲ P buffer 10 μL，Hifair UH Ⅲ Enzymes 1 μL ，Hieff 50×Low Rox 0.4 μL ，AHS（10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL，10 μmol·L-1探針0.5 μL），WNV（10 μmol·L-1上、 下游引物各1 μL，10 μmol·L-1探針0.5 μL），AHS、WNV模板各1 μL，ddH2O 1.6μL；最佳退火溫度為58 ℃。

2.2" 標準曲線的建立

AHS以及WNV的標準曲線見圖1。結果顯示，兩組拷貝數與Ct值均有良好的線性關系，擴增效率較高：AHS（R2=0.999 6，E=95.49%），WNV（R2=0.998 9，E=97.43%）。

2.3" 敏感性試驗

根據敏感性測試結果并結合檢測臨界值判定，AHSV、WNV最低檢測限可達到10 copies·μL-1，結果如圖2。

1～8. 1×108～1×101 copies·μL-1 WNV 陽性質粒；9～16. 1×108～1×101 copies·μL-1 AHSV 陽性質粒

1-8. 1×108-1×101 copies·μL-1 WNV positive plasmid; 9-16. 1×108-1×101 copies·μL-1 AHSV positive plasmid

2.4" 重復性試驗

以1×108～1×101copies·μL-1的兩種重組質粒混合后作為模板，進行組內和組間的重復性試驗，重復性試驗結果如表2所示。AHSV組內變異系數為0.04%～0.41%，組間變異系數為0.17%～4.83%；WNV組內變異系數為0.09%～0.93%，組間變異系數為1.94%～4.36%。以上數據表明，本方法檢測AHSV以及WNV病毒具有良好的穩(wěn)定性及重復性。

2.5" 特異性試驗

分別以 EAV、EHV-1、EIAV、 SEZ、EIV的病毒核酸作為樣本，采用上述優(yōu)化好的方法進行RT-PCR擴增，檢測該方法的特異性。特異性試驗結果如圖3所示，結果表明該方法特異性良好。

2.6" 臨床樣本檢測

用已優(yōu)化的雙重實時熒光定量RT-PCR方法對天津某馬場采集的30份馬血樣品核酸進行檢測，結果如圖4。結果顯示，30份臨床樣本的檢測結果均為陰性，符合率為100%。

3" 討" 論

非洲馬瘟和西尼羅熱是均能夠以蚊蟲為媒介傳

播的重要傳染病，在全球多個地區(qū)出現流行，對馬屬動物的危害極大，隨著全球一體化的進程加快，非洲馬瘟與西尼羅病毒傳播擴散的風險加大，每次暴發(fā)都對當地馬產業(yè)造成巨大損失，尤其是西尼羅病毒能引起人類感染，是一種嚴重危害公共衛(wèi)生安全的蟲媒病毒，近年來多次導致重大的人類傳染?。?7］。雖然我國沒有出現AHS以及WNV的感染病例，但隨著國內賽馬及馬術俱樂部的開始發(fā)展，國內外馬匹的貿易逐漸興盛，加大了傳入風險，及時有效地對這兩種疫病進行檢測至關重要［19-20］。

實時熒光定量PCR方法能夠從各種樣品中檢測AHSV和WNV，包括血清、腦脊液、蚊子等樣品，與傳統(tǒng)的病毒分離或免疫學檢測等診斷方法相比，該方法縮短了診斷時間，并且具有靈敏度高，特異性強的優(yōu)點，能夠檢測極低濃度的核酸，從而迅速和準確的定量微量的目標核酸，此外該技術還能實現高通量的樣本處理和分析，更有助于批量地進行樣本檢測［17，21］。實時熒光定量PCR技術被廣泛用于多種疫病的聯合診斷，大幅度提高了診斷的效率。趙文華等［22］開發(fā)了一種針對AHSV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測方法，最小檢出量為102copies·μL-1，并且需要兩套引物才能對AHSV所有的血清型進行鑒定。吳江等［23］建立的WNV的RT-RPA檢測方法，最小檢出量為5.25×102 copies·μL-1，檢測時間僅需20 min。

本研究根據AHSV和WNV基因組序列的特點，建立了一種能夠同時檢測AHSV和WNV的TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，最小檢出量可達10 copies·μL-1，經組內與組間重復試驗、特異性驗證和臨床樣本檢測，結果表明本方法對于檢測AHSV以及WNV具有較好的敏感性、穩(wěn)定性和準確性。

4" 結" 論

本研究建立的雙重熒光RT-PCR方法具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性強的特點，能在短時間內同時檢測AHSV和WNV，為非洲馬瘟與西尼羅病的病原監(jiān)測與防控提供重要技術手段。

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（編輯" 白永平）