改良育陰方對非洲豬瘟病毒感染PAMs的cGAS-STING通路影響

摘" 要： 旨在為評價(jià)中藥體外對非洲豬瘟病毒的抑制作用，本研究將5種試驗(yàn)用藥：連翹、馬勃、改良育陰方（modified Yuyin decoction，MYY）、復(fù)方魚腥草（復(fù)方2）和銀翹馬勃散（復(fù)方3），通過qPCR檢測不同中藥在被非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages，PAMs）中，對ASFV編碼的衣殼蛋白p72的影響，篩選出可以顯著降低ASFV-p72基因表達(dá)的中藥為改良育陰方（MYY）。采用LC-MS分析檢測出改良育陰方的主要化學(xué)成分；采用CCK8法觀察改良育陰方對豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）活力的影響；熒光定量PCR檢測ASFV-p72基因的表達(dá)；Western blot和ELISA檢測CGAS-STING信號通路蛋白表達(dá)水平；RU.521作為cGAS抑制劑用于驗(yàn)證MYY在cGAS-STING通路中對ASFV的作用。結(jié)果表明，在PAMs中，MYY可以顯著降低ASFV-p72基因表達(dá)，在ASFV感染2 h給藥效果最佳，對ASFV感染PAMs后的細(xì)胞活力具有濃度依賴性改善作用。攻毒后2 h，使用MYY發(fā)現(xiàn)PAMs細(xì)胞上清液中干擾素基因刺激蛋白（STING）、TANK結(jié)合激酶1（TBK1）、干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）、干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3（IFITM3）表達(dá)量的下降，PAMs細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀GMP-AMP合成酶（cGAS）、干擾素β（IFNβ）蛋白量表達(dá)增加，MYY可激活cGAS-STING-TBK1-IRF3-IFNβ信號通路，促進(jìn)IFITM3的表達(dá)。經(jīng)RU.521處理后，MYY仍能提高細(xì)胞活力，降低ASFV-p72基因的表達(dá)。綜上所述，MYY具有抑制ASFV的潛在作用，可能與cGAS-STING信號通路的激活促進(jìn)IFITM3的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 改良育陰方；非洲豬瘟病毒；ASFV-p72基因；CGAS-STING信號通路；LC-MS分析

中圖分類號： S853.1; S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5839-15

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.045

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

收稿日期：2024-01-02

基金項(xiàng)目：廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃 （2019B020211004）

作者簡介：陳曉麗（1992-），女，福建詔安人，博士生，主要從事中藥抗病毒研究，E-mail： xiaolichen@stu.scau.edu.cn

*通信作者： 郭世寧，主要從事中獸醫(yī)藥在畜禽健康養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究，E-mail：shining@scau.edu.cn；呂偉杰，主要從事中獸醫(yī)藥與動(dòng)物腸道菌群關(guān)系研究，E-mail： lvwj@scau.edu.cn

Effect of Modified Yuyin Decoction on cGAS-STING Pathway of African Swine Fever

Virus Infected PAMs

CHEN" Xiaoli1， ZHOU" Jiahao1， ZHOU" Jing1， QU" Qian1， WANG" Zhihua1， XIONG" Ying1， ZHU" Yongqi1， JIA" Weixin1， L Weijie1*， GUO" Shining1，2*

（1.College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China;

2.International Institute of Traditional Chinese Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract：" In order to evaluate the efficacy of Chinese traditional medicine against African swine fever virus （ASFV） in vitro， five experimental drugs were used in this study. The effects of different Chinese herbal medicines on ASFV encored capshell protein p72 in porcine alveolar macrophages （PAMs） infected with African swine fever virus were detected by qPCR. Modified Yuyin decoction （MYY） was selected as a Chinese medicine that could significantly reduce the expression of ASFV-p72 gene. The main components of anti-ASFV were detected by LC-MS analysis. CCK8 method was used to observe the effect of modified Yuyin decoction on the activity of PAMs. The expression of ASFV-p72 gene was detected by fluorescence quantitative PCR. Western blot and ELISA were used to detect CGAS-STING signaling pathway protein expression. RU.521 was used as a cGAS inhibitor to verify the anti-ASFV effect of MYY in the CGAS-STING pathway. The results showed that MYY can significantly reduce the expression of ASFV-p72 gene in PAMs， and the best effect is given at 2 h after ASFV infection， and it has a concentration-dependent improvement effect on the cell viability after ASFV infection of PAMs. The expression levels of interferon gene stimulating protein （STING）， TANK binding kinase 1 （TBK1）， interferon regulatory factor 3 （IRF3） and interferon induced transmembrane protein 3 （IFITM3） in the supernatant of PAMs cells were decreased by MYY 2 h after the challenge. The expression of cyclic GMP-AMP synthetase （cGAS） and interferon β （IFNβ） protein in PAMs cells increased， and MYY could activate the cGAS-STING-TBK1-IRF3-IFNβsignaling pathway and promote the expression of IFITM3. After treatment with RU.521， MYY could still increase cell viability and decrease the expression of ASFV-p72 gene. In summary， MYY has a potential anti-ASFV effect， which may be related to the activation of cGAS-STING signaling pathway to promote the expression of IFITM3.

Key words： modified Yuyin decoction; African swine fever virus; ASFV-p72 gene; CGAS-STING signaling pathway; LC-MS analysis

*Corresponding authors：" GUO Shining， E-mail： shining@scau.edu.cn; L Weijie，E-mail： lvwj@scau.edu.cn

非洲豬瘟（African swine fever）被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health， WOAH）列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國將非洲豬瘟列為重點(diǎn)防范的一類動(dòng)物疫病，是一種由外界傳入的烈性動(dòng)物疫病，感染該病毒的豬死亡率接近100%［1］。從2018年8月，我國暴發(fā)第一例非洲豬瘟疫情，僅2019年就給我國造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，損失金額達(dá)1 110億美元。截至2023年5月，ASF已經(jīng)影響18個(gè)國家，如中國、越南、韓國和蒙古國等［2］。迄今為止，尚未開發(fā)出安全有效的ASF疫苗和商品化抗病毒藥物，因此迫切需要開發(fā)針對非洲豬瘟的有效疫苗或抑制病毒藥物。

中醫(yī)將由病毒引起的傳染病被稱為“瘟疫”。在傳染病的防治方面，中醫(yī)已有幾千年的歷史，不僅經(jīng)驗(yàn)豐富，還有成熟的理論體系。傳統(tǒng)中醫(yī)防治疾病的基本原則：“未病先防、既病防變和標(biāo)本兼治”。中醫(yī)藥作為我國幾千年流傳下來的瑰寶，并且在病毒病防治方面也積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。從中醫(yī)的角度來看ASF屬于“溫病”，本研究選用5種具備清熱解毒功效的試驗(yàn)用藥：連翹、馬勃、改良育陰方（MYY）、復(fù)方魚腥草（復(fù)方2）和銀翹馬勃散（復(fù)方3）進(jìn)行抑制病毒篩選，其中3個(gè)復(fù)方中藥的組方中均含有金銀花、連翹藥物。研究發(fā)現(xiàn)，一些清熱類藥物，比如金銀花、板藍(lán)根等對流感病毒具有較好的抑制作用［3］。大青葉能夠抑制流感病毒的生物合成［4］。白及提取物能夠提高小鼠機(jī)體免疫力［5］。漢黃芩素和黃芩素是黃芩的主要組成成分，能夠抑制流感病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合［6］。冰香散對流感病毒影響的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流感病毒的復(fù)制能力受到了顯著抑制［7］。雙黃連能夠很好地修復(fù)由甲型H1N1流感病毒所引起的MDCK細(xì)胞損傷［8］。紅景天苷和黃芪甲苷具有抑制柯薩奇B組病毒復(fù)制的作用［9］。柴胡能夠在病毒感染早期，對小鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)［10］。除此之外，中藥在防控ASF方面也起到了積極的影響。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物芹菜素和金雀異黃素能夠在體外對ASFV的復(fù)制發(fā)揮抑制作用［11］。含金銀花的復(fù)方中藥提取物方劑可以在非洲豬瘟的防控中發(fā)揮作用，其主要作用表現(xiàn)在降低豬感染發(fā)病的機(jī)率［12］。中藥復(fù)方“新溫康”有清熱解毒、益氣生津、涼血散瘀的功效，配合有清熱解毒、益氣生津、涼血散瘀功效的佐劑“解霉紅景天”聯(lián)合使用對非洲豬瘟有獨(dú)特治療效果［13］。TSN能有效抑制ASFV體外復(fù)制。其抗病毒作用歸因于TSN上調(diào)宿主IFN刺激基因IRF1［14］。因此，開發(fā)防治非洲豬瘟的中藥制劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和研究價(jià)值。

ASFV是一種雙鏈DNA病毒，它可以通過內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，形成內(nèi)體。在這個(gè)階段，發(fā)揮作用的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR），主要是Toll樣受體（toll-like receptors，TLR）［15］，該通路被激活，進(jìn)而激活了干擾素通路產(chǎn)生抗病毒蛋白，將病毒限制在內(nèi)體結(jié)構(gòu)中。當(dāng)病毒毒力太強(qiáng)或者機(jī)體免疫功能下降時(shí)，ASFV可突破內(nèi)體防線，病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合，ASFV進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。此時(shí)，細(xì)胞質(zhì)DNA信號通路就會被激活，即cGAS-STING信號通路，進(jìn)而激活下游干擾素通路，產(chǎn)生抗病毒蛋白，如IFITM3，發(fā)揮抗病毒功能［3］。機(jī)體發(fā)揮抗ASFV功能的主要通路：Toll樣受體通路和cGAS-STING通路。ASFV進(jìn)入細(xì)胞之后，免疫系統(tǒng)監(jiān)測到這種外來的PAMP信號，就激活了細(xì)胞質(zhì)信號通路即cGAS-STING通路，對該通路研究發(fā)現(xiàn)，cGAS監(jiān)測到細(xì)胞質(zhì)中的dsDNA后，就會催化合成cGAMP，即GMP-AMP環(huán)二核苷酸，之后cGAMP離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，到達(dá)高爾基體，在這里cGAMP與干擾素基因蛋白刺激器STING發(fā)生結(jié)合。隨后，招募大量的TBK1并使之磷酸化，同時(shí)也招募大量IRF3，隨后也會發(fā)生相應(yīng)的磷酸化，然后IRF3就會向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用，促使I型IFN-α/β基因的表達(dá)［16］。本試驗(yàn)通過研究MYY對ASFV在APMs細(xì)胞中的抑制作用，以及MYY在天然免疫調(diào)節(jié)過程中（cGAS-STING）對I型IFN通路激活的影響，為中藥對病毒的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 藥物制備

本試驗(yàn)共使用5種試驗(yàn)用藥，包括2種單藥：連翹和馬勃；以及3種復(fù)方中藥：MYY、復(fù)方2、復(fù)方3，試驗(yàn)所用中藥均購自北京同仁堂有限公司。稱取適量的中藥粉碎，稱取粉碎后的中藥20 g，加水400 mL，浸泡15 min后，武火煮沸，文火煎煮至200 mL，收集藥液至50 mL離心管，3 000 r·min-1離心5 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（60 ℃）濃縮至40 mL，使藥液濃度為0.5 g·mL-1，濃縮后藥液高壓蒸汽滅菌（121.3 ℃，15 min）制得中藥原液，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2" 病毒與原代PAMs細(xì)胞的分離

非洲豬瘟病毒毒株（編號：ASFV GZ201801）（GenBank： MT496893.1）為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)張桂紅教授饋贈(zèng)。原代PAMs細(xì)胞的分離：將斷奶仔豬安樂死后，取出完整肺用止血鉗鉗住氣管，置于含5％雙抗的PBS中清洗3遍，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺。向支氣管中加入5％雙抗的PBS進(jìn)行灌洗，每次加入500 mL PBS，灌洗4次。收集灌洗液至50 mL離心管中，將收集到的灌洗液在4℃離心機(jī)中300 g離心10 min，棄去上清液，加入1 mL含5％雙抗的1640吹打沉淀，收集至50 mL離心管內(nèi)，同樣條件離心。棄去上清液，加入凍存液，用臺盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每管1 mL分裝至凍存管，存于液氮備用。本研究所有病毒相關(guān)試驗(yàn)均在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院生物安全三級實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）進(jìn)行。所有動(dòng)物試驗(yàn)均按照華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查的規(guī)定進(jìn)行，批準(zhǔn)號：2023c091。

1.3" MYY的LC-MS分析

本試驗(yàn)篩選出的最佳抑制ASFV中藥為改良育陰方（MYY），作為一個(gè)復(fù)雜的方劑，使用液相質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)對其中藥成份分析進(jìn)行分析是必要的。將“1.1”制備的MYY原液在0.22 μm濾膜過濾后，將過濾液置于上樣瓶中，用于LC-MS上機(jī)檢測，檢測后將數(shù)據(jù)進(jìn)行以下處理和分析。首先，通過Proteowizard軟件包（v3.0.8789）［17］中MSConvert工具將原始質(zhì)譜下機(jī)文件轉(zhuǎn)換為mzXML文件格式。采用R XCMS（v3.12.0）軟件包［18］進(jìn)行峰檢測、峰過濾、峰對齊處理，參數(shù)設(shè)置為bw=2，ppm=15，peakwidth=c（5， 30），mzwid=0.015，mzdiff=0.01，method=”centWave”，得到代謝物定量列表。然后，通過總峰面積歸一化的方法實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)矯正，消除系統(tǒng)誤差。采用公共數(shù)據(jù)庫HMDB［19］、massbank［20］、LipidMaps［21］、mzcloud［22］、KEGG［23］及諾米代謝自建標(biāo)準(zhǔn)品庫等譜圖數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物質(zhì)鑒定（搜庫），得到代謝物定性結(jié)果。具體原理是根據(jù)一級質(zhì)譜中母離子的質(zhì)荷比（m/z）確定代謝物的分子量、加合離子等信息進(jìn)行分子式預(yù)測，然后與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較、匹配，實(shí)現(xiàn)代謝物的一級定性鑒定；同時(shí)，在定量列表中，檢測到二級譜圖的代謝物與數(shù)據(jù)庫中每個(gè)代謝物的碎片離子等信息進(jìn)行比較、匹配，實(shí)現(xiàn)代謝物的二級定性鑒定。

1.4" 中藥的細(xì)胞毒性評價(jià)

采用CCK8法評價(jià)5種中藥作用于PAMs細(xì)胞48 h對細(xì)胞活力的影響。簡單地說，在96孔板中接種PAMs，設(shè)置10個(gè)濃度的藥物干預(yù)（0.975、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250和500 mg·mL-1）和空白對照組，每組設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔。去除培養(yǎng)基后，加入100 μL 10% CCK8繼續(xù)孵育2 h。用酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光值。計(jì)算細(xì)胞存活率，確定中藥安全濃度。細(xì)胞活力的計(jì)算公式：細(xì)胞活力（％）=［A（加藥）-A（空白）］/［A（0加藥）-A（空白）］×100。

1.5" 不同濃度中藥抑制病毒分析

在96孔板中，PAMs在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。試驗(yàn)細(xì)胞分為空白組，模型組，不同濃度梯度中藥組。稀釋5種中藥濃度用于本試驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁后，棄去培養(yǎng)液?？瞻捉M加入維持培養(yǎng)基、模型組加入病毒進(jìn)行造模、中藥組加入中藥和病毒的混合液，2 h后棄去每孔溶液，洗滌，加入維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.6" 添加時(shí)間測定

將PAMs接種于RPMI-1640培養(yǎng)基中的96孔板中，在37℃和5%二氧化碳下孵育24 h，用于添加時(shí)間測定。試驗(yàn)細(xì)胞分為空白組、模型組和不同時(shí)間給藥方式組。設(shè)計(jì)了攻毒前2 h給藥，同時(shí)給藥，攻毒后2、4、8、16、24 h給藥，共7種給藥方式用于本次試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如圖1。

1.7" TCID50檢測

將PAMs接種于RPMI-1640培養(yǎng)基中的96孔板中，在37℃和5% CO2下孵育24 h，棄去96孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液，加入100 μL PBS輕柔清洗2次，加入不含血清、不含雙抗、含不同病毒濃度的1640培養(yǎng)基（100 μL病毒+900 μL的1640培養(yǎng)基10倍稀釋），每個(gè)濃度8個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空白對照組。病毒37℃孵育2 h后，輕柔棄去病毒液，加入不含雙

抗、含10％血清的1640培養(yǎng)基，每孔100 μL，繼續(xù)孵育24 h。加入20 μL豬紅細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，觀察血凝現(xiàn)象并記錄。

1.8" 熒光定量PCR檢測

PAMs在6孔板中培養(yǎng)，每孔感染103 TCID50 ASFV，感染2 h后，用PBS洗滌細(xì)胞，并在添加所測中藥的RPMI-1640培養(yǎng)基中孵育。對處理過和模擬處理過的細(xì)胞進(jìn)行DNA提取。使用離心柱式動(dòng)物RNA抽提試劑盒提取樣本總RNA后，用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)NCBI基因庫中登錄的目的基因mRNA序列，引物由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)，特異性引物序列見表2。按ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）說明書配制反應(yīng)體系，在Light Cycler480 型熒光定量PCR儀器上進(jìn)行反應(yīng)，應(yīng)用2－△△Ｃｔ法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.9" Western blot法檢測IFNβ和cGAS蛋白表達(dá)量

將收集的細(xì)胞按照每100 μL裂解液加入1 μL苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyL fluoride，PMSF）的比例配制適量裂解液。充分裂解后，在4 ℃、12 000 g離心5 min，并將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定細(xì)胞樣本的蛋白濃度，并用PBS將每份樣品調(diào)至相同濃度。根據(jù)蛋白濃度配制樣品，加入5×蛋白上樣緩沖液，用移液槍反復(fù)抽吸，充分混合，沸水加熱5 min使蛋白變性，-20 ℃保存?zhèn)溆?。充分清洗玻璃板后按說明書步驟制備SDS-PAGE凝膠，按蛋白總量每孔10 μL等體積上樣，并加入蛋白maker。首先80 V恒定電泳30 min，然后100 V恒定電泳，至溴酚藍(lán)到底膠板下沿。切取凝膠中含目的蛋白的條帶，按照黑膠白膜的順序夾好聚偏氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVDF）膜與凝膠，PVDF膜使用前先用甲醇活化3 min。以150 mA轉(zhuǎn)膜90 min。用稀釋后的TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min，隨后用含有5％脫脂奶粉的封閉液封閉90 min。封閉結(jié)束后TBST洗滌3次，每次10 min。孵育一抗IFNβ（1∶1 000），cGAS（1∶1 000），4℃ 16 h以上。一抗孵育結(jié)束后TBST清洗3次，每次10 min，孵育二抗（1∶5 000）室溫1 h；TBST清洗3次，每次10 min，加入發(fā)光液顯影。

1.10" ELISA檢測

將細(xì)胞上清樣品在2 500 r·min-1離心取上清，然后加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。根據(jù)說明書檢測豬干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）、豬干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3（IFITM3）、豬干擾素基因刺激蛋白（STING）和豬TANK結(jié)合激酶1（TBK1），以上試劑盒均購自江蘇酶免生物科技有限公司。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量各孔的吸光值（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IRF3、IFITM3、STING和TBK1水平。

1.11" RU.521抑制劑試驗(yàn)

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，將PAMs分為CON組，MOD組，MOD+RU.521組，MOD+RU.521+中藥組，MOD+中藥組。具體操作：細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁后，棄去培養(yǎng)液。以加入病毒的時(shí)間定位0 h。CON組：加入維持培養(yǎng)基。MOD組：加入病毒進(jìn)行造模，病毒作用2 h后，棄去毒液，洗滌，加入維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至所需時(shí)間。MOD+RU.521組：提前加入RU.521對細(xì)胞預(yù)處理30 min，加入病毒進(jìn)行造模，病毒作用2 h后，棄去毒液，洗滌，加入維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至所需時(shí)間。MOD+RU.521+中藥組：提前加入RU.521對細(xì)胞預(yù)處理30 min，之后病毒作用2 h，棄去毒液，洗滌，加入含中藥的維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至所需時(shí)間。MOD+中藥組：病毒作用2 h后，棄去毒液，洗滌，加入含中藥的維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至所需時(shí)間。48 h后棄去每孔溶液，洗滌。

1.12" 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示，兩組數(shù)據(jù)比較通過獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素ANOVA分析各組間差異性，通過最小顯著差數(shù)法（LSD）和Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行各組間的多重比較。

2" 結(jié)" 果

2.1" 5種中藥的細(xì)胞毒性

在本試驗(yàn)中，CCK-8法分別檢測MYY、復(fù)方2、復(fù)方3、連翹和馬勃對PAMs細(xì)胞活力影響。如圖2所示，所有藥物在125～500 mg·mL-1濃度下對APM細(xì)胞均具有細(xì)胞毒性作用。相比之下，5種中藥各在以下濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞活性沒有毒性作用：MYYlt;62.5 mg·mL-1 （A）、復(fù)方2lt;31.25 mg·mL-1 （B）、復(fù)方 3lt;31.25 mg·mL-1 （C）、連翹lt;1.95 mg·mL-1 （D），馬勃lt;15.63 mg·mL-1 （E）。

2.2" ASFV的TCID50測定

如圖3A所示，觀察豬紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，記錄陽性孔，Karber法計(jì)算TCID50，Karber公式為lgTCID50=L-d（s-0.5），其中，L=最高稀釋度的對數(shù)；d=稀釋度對數(shù)之間的差；s=陽性管比率總和。ASFV的TCID50的測定結(jié)果為TCID50 = 10-5.625，后續(xù)試驗(yàn)攻毒劑量為103 TCID50。如圖3 B所示，在ASFV病毒滴度大小為103 TCID50時(shí)，對PAMs細(xì)胞活力影響接近半數(shù)致死（P＜0.05）。

2.3" 抑制非洲豬瘟病毒的中藥篩選

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，連翹、馬勃、MYY、復(fù)方2和復(fù)方3在ASFV大小為103 TCID50時(shí)，MYY具有較好的抑制效果，后續(xù)以MYY作為主要抑制ASFV用藥進(jìn)行深入研究。

2.4" MYY的UPLC-MS分析

MYY作為復(fù)雜的方劑，對MYY中的化合物進(jìn)行鑒定是很有必要的。采用UPLC-MS技術(shù)分析了MYY的成分，其陰性和陽性基峰色譜圖如圖5A和5B所示，可以看出MYY物質(zhì)成分豐富。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫生信分析，共鑒定出9 307個(gè)化合物，其中次生代謝產(chǎn)物776個(gè)。根據(jù)峰面積大小排序，排在前面的物質(zhì)主要有1， 2-benzoquinone、L-prolinamide、1-O-（4-coumaroyl）-β-D-glucose、D-octopine、nopaline、deoxycytidine、androst-5-ene-3，17-dione、androstanedione、11-dehydrocorticosterone、cholesterol sulfate（表3）。如圖5C所示，776種次生代謝物中，包括109種羧酸及其衍生物，85種苯類，萜類，57種脂肪酸?；?9種類固醇，48種醇類，45種碳水化合物，41種酚類，類固醇類25種，戊烯醇脂類23種，17種糖苷，16種有機(jī)氮化合物，13個(gè)有機(jī)氧化物、12種咪唑嘧啶、12種吡啶、11種醇及其衍生物、10種香豆素、9種氮環(huán)化合物、7種苯丙酸、6種重嗪、5種喹啉及其衍生物、4種嘧啶核苷、4種萜烯（圖5C）。進(jìn)一步總結(jié)了MYY組方中，每個(gè)單藥所含化學(xué)物質(zhì)的數(shù)（圖5D）。綜上所述，MYY對ASFV病毒具有良好的抑制作用，可能是因?yàn)槠湄S富的天然化合物可以抑制該病毒。

2.5" MYY對非洲豬瘟病毒的作用

在細(xì)胞顯微觀察中，空白組細(xì)胞狀態(tài)良好，模型組細(xì)胞折光性增加、變圓、黏連、破碎、脫落、死亡，中藥組細(xì)胞相比較于模型組狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)。MYY在不同濃度對ASFV的影響研究中，與病毒模型組相比，MYY濃度在7.8 mg·mL-1時(shí)差異顯著，PAMs細(xì)胞活力呈升高趨勢（圖6A）。MYY在不同時(shí)間給藥對ASFV的研究中，結(jié)果顯示在攻毒后2 h給藥具有較好的增強(qiáng)PAMs細(xì)胞活力效果（圖6B）。

2.6" MYY對豬 cGAS-STING 信號通路的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖7），與空白組相比使用中藥復(fù)方后cGAS、STING、TBK1、IRF3表達(dá)量上升，說明中藥復(fù)方通過激活cGAS-STING信號通路。此外，對IFNβ蛋白表達(dá)檢測試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，中藥組明顯增加了PAMs細(xì)胞內(nèi)IFNβ蛋白表達(dá)，說明中藥可以激活細(xì)胞產(chǎn)生大量的IFNβ，并且中藥組抗病毒蛋白IFITM3蛋白表達(dá)量也顯著升高，說明該中藥復(fù)方會直接增加PAMs細(xì)胞內(nèi)的抑制病毒功能，在后面ASFV入侵時(shí)，可能會發(fā)揮出更好的抑制效應(yīng)。

2.7" MYY在ASFV感染后對cGAS-STING信號通路的影響

在本試驗(yàn)結(jié)果中，ASFV組PAMs細(xì)胞cGAS、STING、TBK1、IRF3表達(dá)量降低，說明ASFV通過抑制cGAS-STING信號通路來增強(qiáng)自身的復(fù)制能力；使用中藥復(fù)方后，cGAS、STING、TBK1、IRF3表達(dá)量上升，說明中藥復(fù)方通過激活cGAS-STING信號通路，從而抑制ASFV復(fù)制。此外，對IFNβ蛋白表達(dá)檢測試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，模型組IFNβ蛋白表達(dá)量升高，說明病毒本身也會刺激PAMs細(xì)胞產(chǎn)生IFNβ來對抗病毒的入侵；使用中藥后，與模型組相比，中藥組明顯增加了PAMs細(xì)胞內(nèi)IFNβ蛋白表達(dá)，說明中藥可以激活細(xì)胞產(chǎn)生大量的IFNβ，發(fā)揮抑制ASFV作用（圖8）。

2.8" MYY在RU.521作用下對PAMs中cGAS-STING通路蛋白表達(dá)的影響

在本試驗(yàn)結(jié)果中，CON組細(xì)胞狀態(tài)良好；MOD組細(xì)胞產(chǎn)生大量病變，細(xì)胞活力降低 （圖9）；MOD+RU.521組細(xì)胞病變進(jìn)一步加重，活力進(jìn)一步降低；MOD+RU.521+中藥組細(xì)胞活力有所改善，ASFV-p72基因表達(dá)量降低；MOD+中藥組細(xì)胞細(xì)胞活力進(jìn)一步改善，ASFV-p72基因表達(dá)量降低。MOD+RU.521+中藥組ASFV-p72基因表達(dá)量高于MOD+中藥組。這就說明了中藥復(fù)方產(chǎn)生的抑制ASFV效果受到了RU.521的抑制。

3" 討" 論

ASF對豬的危害是巨大的，主要臨床癥狀是高熱和多器官生理功能下降，這是一種死亡率很高的病毒性疾病。目前，還沒有安全有效的ASFV疫苗可以對其進(jìn)行防控。為了預(yù)防和控制ASFV，開發(fā)對該病毒有效的藥物尤為重要。PAMs是ASFV繁殖的主要細(xì)胞類型，是研究抗ASFV藥物的良好模型［23］。在哺乳動(dòng)物中，肺泡巨噬細(xì)胞占支氣管肺泡灌洗液中免疫細(xì)胞的90%，它們在對抗呼吸道感染性疾病中發(fā)揮重要的作用［24］。

中獸醫(yī)辯證非洲豬瘟屬“瘟病”范疇［25-26］，溫病的病因是溫邪，是指由外界中具有溫?zé)嵝再|(zhì)的致病之邪引起的一類疾病，主要包括“六淫”外邪中的風(fēng)熱病邪、暑熱病邪、濕熱病邪、燥熱病邪以及“伏寒化溫”的溫?zé)岵⌒?、溫毒病邪、癘氣等［27］。按照傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，可認(rèn)為非洲豬瘟病毒是中醫(yī)病因中的“癘氣”。癘氣為害頗似火熱之邪致病，具有一派熱盛之象，其毒熱較火熱為甚，而且常夾有濕毒等穢濁之氣，防控“治未病”宜采取清熱解毒、補(bǔ)中益氣、芳香化濕等法來實(shí)現(xiàn)［28］。MYY主要是由12種中草藥組成，主要具有滋腎陰、清胃火、清熱、止痛的作用，是在傳統(tǒng)育陰方的基礎(chǔ)上，減少寸冬、赤芍、黃芩、白芷、懷牛膝、大黃，添加金銀花、連翹、紫蘇葉、大青葉、甘草進(jìn)行改良的方劑，起到增強(qiáng)方劑清熱解毒的效力，以及做到方證對應(yīng)、藥病相當(dāng)?shù)淖饔?。育陰方已被證實(shí)對小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型有一定的保護(hù)作用［29］。在肝纖維化大鼠模型中，育陰方顯著抑制了TGF-1的表達(dá)，提示這可能是其機(jī)制之一［30］。有研究發(fā)現(xiàn)，育陰湯治療原發(fā)性干燥綜合征時(shí)可下調(diào)TLR-IFN-BAFF信號通路，抑制異常B淋巴細(xì)胞激活［31］。改良育陰方體外對ASFV的抑制作用尚未見報(bào)道，在本研究中，首先關(guān)注了MYY在體外抑制非洲豬瘟病毒感染的作用。

p72蛋白具有極高的抗原性和免疫原性［32］，ASFV-p72蛋白占病毒粒子的31%～33%［33］，作為病毒的主要結(jié)構(gòu)抗原蛋白［34］，是ASFV抗原檢測的重要指標(biāo)。此外，p72蛋白在病毒感染時(shí)，對病毒吸附到宿主細(xì)胞起促進(jìn)作用［35］。本研究通過ASFV-p72 mRNA表達(dá)的檢測結(jié)果，評價(jià)了5種中藥對ASFV的療效。結(jié)果顯示，在5種中藥中MYY的抑制ASFV效果最佳，MYY顯著抑制了ASFV-p72 mRNA的表達(dá)，并在添加2 h時(shí)顯著提高的APMs的細(xì)胞活性，這說明MYY的抗病毒作用可能作用于病毒的入侵階段，抑制ASFV與豬肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜的融合。

病毒感染后，宿主體內(nèi)會發(fā)生各種基因變化，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的I型和III型干擾素，然后產(chǎn)生數(shù)千種抗病毒基因ISG，發(fā)揮抗病毒作用。ISGs將進(jìn)一步表達(dá)相應(yīng)的抗病毒蛋白，這些蛋白不僅可以抑制病毒復(fù)制過程，還可以以負(fù)反饋調(diào)節(jié)IFN的表達(dá)水平，從而發(fā)揮間接抗病毒作用［36］。IFITM家族中的4個(gè)蛋白，IFITM1、IFITM2、IFITM3和IFITM5，被發(fā)現(xiàn)可以抑制流感病毒感染。研究人員確定了該家族中通過基因組參與各種病毒復(fù)制的蛋白質(zhì)［37］。對于不同類型的病毒感染，IFITM家族顯示不同的能力抑制病毒復(fù)制［38］，IFITM3主要對流感病毒有強(qiáng)拮抗作用，而IFITM1主要抑制冠狀病毒和線性病毒的復(fù)制［39］。本研究采用的給藥方法是對病毒進(jìn)行攻毒2 h，然后加入MYY，這與病毒復(fù)制過程中的入侵階段密切相關(guān)。因此，本研究檢測在病毒入侵階段起關(guān)鍵作用的抗病毒蛋白IFITM3。MYY的使用上調(diào)了PAMs細(xì)胞中IFITM3的水平，表明中藥復(fù)合物可能在病毒復(fù)制過程的早期激活I(lǐng)FITM3，阻斷病毒包膜與細(xì)胞膜的融合。MYY對ASFV感染后cGAS-STING通路的影響，提示MYY可通過激活cGAS-STING通路增加抗病毒干擾素IFITM3的產(chǎn)生。

RU.521作為cGAS的特異性抑制劑，已在自身免疫性疾病模型的體外和體內(nèi)研究中得到證實(shí)［40］。RU.521抑制劑試驗(yàn)表明，中藥顯著改善了ASFV引起的PAMs細(xì)胞活力下降，抑制了ASFV-p72基因的表達(dá)。在RU.521處理后，MYY仍能提高細(xì)胞活力，使ASFV-p 72基因表達(dá)下降，效果不如沒有添加抑制劑組好。這些結(jié)果表明，MYY通過激活cGAS-STING信號通路發(fā)揮抑制ASFV的作用.

MYY可以增強(qiáng)PAMs細(xì)胞活力，降低ASFV-p72基因表達(dá)，濃度依賴性發(fā)揮抑制病毒效果，并且中藥復(fù)方能夠通過激活PAMs細(xì)胞內(nèi)cGAS-STING信號通路并誘導(dǎo)產(chǎn)生I型IFN，表達(dá)抗病毒蛋白IFITM3干擾ASFV的復(fù)制過程，但是cGAS-STING通路并不是該中藥復(fù)方產(chǎn)生抑制ASFV作用的唯一通路。

4" 結(jié)" 論

MYY具有抑制ASFV的潛在作用，可能與cGAS-STING信號通路的激活促進(jìn)IFITM3的表達(dá)有關(guān)。

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（編輯" 白永平）