加味枳術(shù)散對(duì)斷奶仔兔腸黏膜屏障和抗氧化能力的影響

摘" 要： 旨在探討加味枳術(shù)散對(duì)斷奶仔兔回腸腸黏膜屏障的影響，為仔兔腹瀉疾病的防治提供新思路。試驗(yàn)選取90只35日齡，體重相近的新西蘭白兔，按照雌雄各半的原則隨機(jī)分為5組。其中空白組仔兔飼喂基礎(chǔ)日糧，恩諾沙星組、低劑量組、中劑量組和高劑量組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.2%的恩諾沙星粉劑以及0.1%、0.3%、0.5%的加味枳術(shù)散粉劑，預(yù)飼期7 d，正式試驗(yàn)14 d。試驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)仔兔的腸道屏障完整情況及其抗氧化能力。結(jié)果顯示，添加加味枳術(shù)散中、高劑量組可以顯著降低腸道的病理組織評(píng)分（Plt;0.01）。與空白組相比，其他處理組均顯著升高回腸ZO2（zonula occludens proteins 2）的mRNA表達(dá)量（Plt;0.001）；高劑量組顯著增加了Occludin、Claudin、ZO1（zonula occludens proteins-1）、ZO2以及JAM2 mRNA的水平（Plt;0.05）；加味枳術(shù)散顯著增加回腸MUC2蛋白的表達(dá)水平（Plt;0.05），且高劑量組顯著降低MPO活性（Plt;0.01）；加味枳術(shù)散高劑量組可顯著增強(qiáng)回腸sIgA的分泌，降低促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6與 TNF-α的水平，提高抗炎細(xì)胞因子IL-10與TGF-β的水平；加味枳術(shù)散可提高回腸SOD、GSH、CAT的活性和T-AOC。綜上，加味枳術(shù)散能夠有效改善斷奶仔兔回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)、加強(qiáng)腸道細(xì)胞間的緊密連接，維持腸黏膜通透性，降低腸道的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)腸黏膜屏障功能并發(fā)揮抗氧化能力，可在替抗使用方面發(fā)揮積極作用。

關(guān)鍵詞： 仔兔斷奶腹瀉；加味枳術(shù)散；腸黏膜屏障；炎癥反應(yīng)；抗氧化

中圖分類號(hào)：S853.74

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）12-5825-14

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.044

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

收稿日期：2023-03-02

作者簡(jiǎn)介：

靳茹文（1987-），男，四川達(dá)州人，碩士，主要從事獸用中藥對(duì)畜禽疾病防治研究和腸靶向制劑開(kāi)發(fā)，E-mail：jingruwen123@163.com;

王英杰（1997-），女，河南淮陽(yáng)人，碩士生，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)和毒理學(xué)研究，E-mail：1764720963@qq.com；蔣全興（1998-），男，四川德陽(yáng)人，碩士生，主要從事天然藥物活性研究，E-mail：jiangquanxing27@163.com。靳茹文、王英杰和蔣全興為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：唐華僑，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究，E-mail： turtletang@163.com

Effects of Modified Zhizhu Powder on Intestinal Mucosal Barrier and Antioxidant Capacity

of Weaned Rabbits

JIN" Ruwen1，2， WANG" Yingjie1， JIANG" Quanxing1， LIU" Tianqiang3， DENG Yang4， LUO" Jie5， ZHAO" Ling1， YE" Gang1， SHI" Fei1， LI" Yinglun1， TANG" Huaqiao1*

（1.College of Veterinary Medicine， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130，" China;

2. Sichuan Chuanlong Dongke Pharmaceutical Co.， Ltd.， Chengdu 611230，" China;

3.Tongwei Agricultural Development Co.， Ltd.， Chengdu 610041，" China;

4.Chengdu Animal Genetic

Resources Protection Center， Chengdu 610081，" China;

5.Tongren Polytechnic College， Tongren

554300，" China）

Abstract： The study aimed to investigate the effects of Modified Zhizhu Powder on the ileal intestinal mucosal barrier of weaned rabbits， with the goal of providing new ideas for the prevention and treatment of diarrhea diseases in weaned rabbits. Ninety 35-day-old New Zealand white rabbits， with similar body weights， were randomly divided into 5 groups， based on the principle of 50/50 male and female. Rabbits in control group were fed a basal diet， Enrofloxacin group， low-dose group， medium-dose group and high-dose group were fed the basal diet supplemented with 0.2% Enrofloxacin powder and 0.1%， 0.3% and 0.5% Modified Zhizhu Powder， respectively. The pre-test lasted for 7 days， and the formal test lasted for 14 days. The integrity of the intestinal barrier and its antioxidant capacity were measured after the experiment. The results showed that adding Modified Zhizhu Powder could significantly reduce the intestinal pathological tissue score （Plt;0.05）. Compared with the blank group， the other treatment groups all significantly increased the relative expression level of ZO2 （zonula occludens protein 2） mRNA in the ileum （Plt;0.001）. The high-dose group significantly increased the mRNA levels of Occludin， claudin， ZO1 （zonula occludens protein 1）， ZO2， and JAM2 （junctional adhesion molecule 2） （Plt;0.001）. Modified Zhizhu Powder significantly increased the expression of MUC2 （Mucin 2） protein in the ileum （Plt;0.05） and the high-dose group significantly reduced MPO （myeloperoxidase） activity （Plt;0.01）. Modified Zhizhu Powder high-doce group could significantly enhance the secretion of sIgA， reduce the levels of pro-inflammatory cytokines IL-1β， IL-2， IL-6， and TNF-α， and increase the levels of anti-inflammatory cytokines IL-10 and TGF-β. Modified Zhizhu Powder could also improve the activity of antioxidant enzymes （SOD， GSH， T-AOC， CAT）. In conclusion， the Modified Zhizhu Powder could effectively improve the morphology and structure of the ileum of weaned rabbits， strengthen the tight connection between intestinal cells， maintain the permeability of intestinal mucosa， reduce the inflammatory response of the intestinal tract， enhance the function of the intestinal mucosal barrier， and play an antioxidant role， which can have a positive effect on the use of substitute antibodies.

Key words： weaning diarrhea of young rabbits; Modified Zhizhu Powder; intestinal mucosal barrier; inflammatory response; antioxidation

*Corresponding author： TANG Huaqiao，E-mail： turtletang@163.com

仔兔的繁育被視為養(yǎng)兔生產(chǎn)的基礎(chǔ)以及養(yǎng)兔過(guò)程中最為關(guān)鍵的飼養(yǎng)管理階段。因此，斷奶初期仔兔的飼養(yǎng)管理和疾病防治尤為重要。消化系統(tǒng)的傳染病目前占所有兔疾病的70%［1］。其中，斷奶腹瀉是早期斷奶仔兔中最常見(jiàn)的一類問(wèn)題，輕者會(huì)導(dǎo)致仔兔生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，體質(zhì)和免疫力降低；嚴(yán)重者將直接造成仔兔的死亡。因此，仔兔斷奶腹瀉的預(yù)防成為飼養(yǎng)管理中的重中之重?？刂茢嗄谈篂a的發(fā)生發(fā)展被認(rèn)為是養(yǎng)殖的成功關(guān)鍵，其關(guān)系到養(yǎng)兔業(yè)的持續(xù)、健康和穩(wěn)定發(fā)展。

仔兔的腸道器官及其免疫系統(tǒng)要到4～7周齡才能基本發(fā)育成熟［2］。在仔兔斷奶初期，由于免疫功能低下、消化道發(fā)育不全、飲食變化和環(huán)境等因素，仔兔易發(fā)生腹瀉等消化道疾?。?］。腹瀉仔兔的腸道屏障受損，腸道上皮細(xì)胞遭受細(xì)菌的黏附與侵襲［4］。部分細(xì)菌和毒素穿過(guò)破損的屏障進(jìn)入體內(nèi)，影響腸道健康及機(jī)體的正常發(fā)育［5］。腸黏膜屏障的作用始于腸腔，通過(guò)黏膜保護(hù)上皮免受機(jī)械、化學(xué)和酶損傷以及細(xì)菌黏附［6］。一旦失去這種保護(hù)，免疫系統(tǒng)開(kāi)始工作，維持腸黏膜的結(jié)構(gòu)和功能，確保消化道消化、吸收等功能的正常發(fā)揮［7］。所以，在飼養(yǎng)斷奶仔兔期間，要維護(hù)腸黏膜屏障的完整性，提高仔兔的免疫力。由此，保護(hù)腸道健康已成為防治仔兔斷奶腹瀉的新策略，這已在一些研究中得到驗(yàn)證［8-10］。

隨著養(yǎng)殖行業(yè)飼料全面禁抗政策的推進(jìn)，各種中藥替抗產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用已成為目前的研究熱點(diǎn)。中獸醫(yī)將腹瀉稱為泄瀉［11］。仔兔斷奶腹瀉依據(jù)其發(fā)生的病因不同共分為三類，即脾虛濕盛型、胃熱積滯型、腸寒濕滯型［12］。此外，仔兔斷奶后與母兔分離，導(dǎo)致情緒不暢，產(chǎn)生焦慮、憤怒等情緒，最終造成肝氣郁結(jié)，從而影響仔兔脾胃的消化功能。枳術(shù)散，出自龔信的《古今醫(yī)鑒》卷六［13］。由枳實(shí)、白術(shù)二味藥組成。此方健脾消滯，消補(bǔ)并重。早有文獻(xiàn)證明，枳術(shù)散具有健胃補(bǔ)脾的作用［14］。臨床常用來(lái)治療消化系統(tǒng)疾病和緩解某些疾病出現(xiàn)的胃腸道癥狀［15］。中獸醫(yī)將仔兔斷奶腹瀉歸為肝郁脾虛，虛實(shí)寒熱錯(cuò)雜。因此，本研究在枳術(shù)散的基礎(chǔ)之上，加上柔肝養(yǎng)陰的白芍和理氣健脾的陳皮，得到“加味枳術(shù)散”，共使諸藥可達(dá)到疏肝健脾、化濕消食的功效，從而緩解斷奶仔兔消化不良、胃腸不適等問(wèn)題，進(jìn)一步保護(hù)仔兔腸黏膜屏障的正常發(fā)育和完整性，減少腸道疾病的發(fā)生。本研究將通過(guò)試驗(yàn)評(píng)估加味枳術(shù)散對(duì)斷奶仔兔腸道功能的改善作用，并通過(guò)檢測(cè)腸道屏障功能探討其作用機(jī)制。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)選用35日齡，體重 850～900 g的新西蘭""" 白兔90只，雌雄各半，由四川省金堂縣兔場(chǎng)提供。

1.2" 中藥來(lái)源及飼料組成

加味枳術(shù)散由枳實(shí)、白術(shù)、白芍、陳皮按照1∶2∶2∶2的比例組成，藥材購(gòu)自于成都荷花池中藥材市場(chǎng)，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)教研室鑒定為正品，藥材樣品保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中。按比例打磨成粗粉后加入基礎(chǔ)飼料中制成顆粒，添加量分別為0.1%、0.3%和0.5%。飼喂斷奶仔兔的基礎(chǔ)飼糧參考兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制［16］ ，組成及各組添加成分見(jiàn)表1。

1.3" 主要儀器與設(shè)備

主要儀器與設(shè)備有：病理切片機(jī)（上海徠卡儀器1.302肉兔核心料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet： Fe 70 mg，Cu 20 mg，Zn 70 mg，Mn 10 mg，Co 0.15 mg，I 0.2 mg，Se 0.25 mg，VA 10 000 IU，VD 900 IU，VE 50 mg，VK 2 mg，VB1 2 mg，VB2 6 mg，VB5 50 mg，VB6 2 mg，VB12 0.02 mg，膽堿 choline 1 000 mg，生物素 biotin 0.2 mg。2.消化能為計(jì)算值，其余均為實(shí)測(cè)值

1.The premix provided the following per kg of the diet：Fe 70 mg，Cu 20 mg，Zn 70 mg，Mn 10 mg，Co 0.15 mg，I 0.2 mg，Se 0.25 mg，VA 10 000 IU，VD 900 IU，VE 50 mg，VK 2 mg，VB1 2 mg，VB2 6 mg，VB5 50 mg，VB6 2 mg，VB12 0.02 mg，choline 1 000 mg，

biotin 0.2 mg.2.DE was a calculated value， while the others were measured values

有限公司，RM2016）；正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康，NIKON Eclipse si）；成像系統(tǒng)（日本尼康，NIKON DS-U3）；多功能熒光化學(xué)發(fā)光免疫儀（美國(guó)Thermo Scientific公司，Varioskan Flash）；伯樂(lè)T100 PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司，T100）；超微量核酸測(cè)定蛋白儀（美國(guó)Thermo Scientific公司，Nanodrop One）；正置熒光顯微鏡（日本尼康，NIKON ECLIPSE TI-SR）；高通量熒光PCR儀（上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司，LightCycle 480II）。

1.4" 主要試劑

主要試驗(yàn)試劑有：一抗ZO1蛋白（江蘇親科生物研究中心有限公司，AF5145）；一抗Occludin蛋白（江蘇親科生物研究中心有限公司，DF7504）；蘇木素染液套裝（武漢谷歌生物科技有限公司，G1005）；熒光二抗（CY3山羊抗兔）（Jackson，111-165-003）；DAPI（碧云天，C1002）；二抗（HRP標(biāo)記山羊抗兔鼠通用二抗）（DAKO，K5007）；組化試劑盒DAB顯色劑（DAKO，K5007）；抗熒光淬滅封片劑（southbiotech，0100-1）。

1.5" 試驗(yàn)動(dòng)物分組

預(yù)飼期為斷奶前7 d，飼喂仔兔不含藥物的基礎(chǔ)飼料。正式試驗(yàn)為斷奶后14 d，將斷奶仔兔按表2分為5個(gè)組，分別飼喂不同處理的飼料。

1.6" 樣品的采集與處理

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)組隨機(jī)選取 6 只仔兔，進(jìn)行采樣。完整分離出回腸，并在兩端結(jié)扎，在固定位置的腸段采樣，分離出相應(yīng)腸段后，剪刀剔除腸段表面的系膜，從同一端將其剪碎后裝入凍存管，標(biāo)記好組別和腸段名稱。選取一部分腸段泡入4% 多聚甲醛并放室溫保存。最后，將其余樣品放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7" 回腸形態(tài)學(xué)分析

回腸樣品在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，經(jīng)""" 過(guò)修塊、脫水、透明和石蠟包埋后，將包埋有樣品的石蠟塊切成5 μm厚的切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后晾干，使用倒置顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察和分析，擬定病理評(píng)分（表3）；對(duì)腸道組織切片進(jìn)行拍照，利用ImageJ軟件測(cè)量小腸絨毛長(zhǎng)度及隱窩深度。垂直測(cè)量從隱窩開(kāi)口到絨毛頂端的距離記為絨毛高度；從隱窩開(kāi)口至隱窩基部的距離記為隱窩深度，并做好記錄。

1.8" RT-PCR 測(cè)定緊密連接蛋白的轉(zhuǎn)錄水平

使用全式金TRIzol試劑提取總RNA，接著用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的 RNA 迅速反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 作為模板加入無(wú)酶ddH2O稀釋10倍待用，將合成好的10 μmol·L-1的引物（有康生物合成），1∶1取上游引物原液和下游引物原液各50 μL，混勻，熒光定量反應(yīng)按照如下所示順序在384 孔PCR板中加好樣品，封板膜密封后混勻瞬時(shí)離心。

反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性 30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，進(jìn)行 40次循環(huán)；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。所有樣品做 3 個(gè)平行，反應(yīng)結(jié)束后以獲取熔解曲線，觀察數(shù)據(jù)并分析，擴(kuò)增體系和RT-PCR引物信息分別見(jiàn)表4、5。

1.9" 免疫熒光檢測(cè)ZO1、Occludin蛋白的水平

石蠟切片脫蠟至水，組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。用PBS（pH7.4）洗滌3次，每次5 min。在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜。用PBS（pH7.4）洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。用PBS（pH7.4）洗滌3次，每次5 min。DAPI復(fù)染細(xì)胞核，避光室溫孵育10 min。用PBS（pH7.4）洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.10" MPO活性的測(cè)定

采用南京建成試劑盒檢測(cè)仔兔腸組織中髓過(guò)氧化物酶（MPO）的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.11" 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)黏蛋白的表達(dá)

石蠟切片脫蠟至水，切片用EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH8.0）進(jìn)行抗原修復(fù)。與PBS（pH7.4）中洗滌3次，每次5 min。切片放入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS（pH7.4）中洗滌3次，每次5 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，4℃孵育過(guò)夜。用PBS（pH7.4）洗滌3次，每次5 min。滴加組化試劑盒內(nèi)與一抗相應(yīng)種屬的二抗（HRP標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育50 min。用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5 min。滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，自來(lái)水沖洗切片終止顯色。Harris蘇木素復(fù)染細(xì)胞核3 min左右，自來(lái)水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。將切片依次放入75%酒精6 min-85%酒精6 min -無(wú)水乙醇Ⅰ6 min -無(wú)水乙醇Ⅱ6 min -二甲苯Ⅰ5 min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.12" 腸組織分泌型免疫球蛋白A水平

根據(jù)酶聯(lián)免疫吸咐試驗(yàn) （ELISA） 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)腸黏膜中分泌型免疫球蛋白A （Secreted immunoglobulin A， sIgA）的水平；用石蠟切片免疫組化法檢測(cè)回腸組織中sIgA蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.13" 腸道中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平

取各組仔兔回腸組織，制備成10%組織勻漿，采用博邁德BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組仔兔腸組織勻漿蛋白濃度，按南京建成總抗氧化能力（T-AOC）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行各組腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的檢測(cè)。

1.14" 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均用Excel 2013進(jìn)行初步整理，再用 SPSS25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行 One-way-ANOVA 分析，再用LSD法進(jìn)行多重比較，并繪圖。試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x-±SEM）” 表示，Plt;0.05表示顯著差異，Plt;0.01表示極顯著差異。

2" 結(jié)" 果

2.1" 回腸形態(tài)學(xué)分析結(jié)果

回腸形態(tài)學(xué)HE染色結(jié)果如圖1A～1E所示。""" 圖1A顯示，仔兔腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞，上皮細(xì)胞大量脫落壞死，碎屑聚集腸腔（黑色箭頭所示）；固有層炎細(xì)胞浸潤(rùn)（紅色箭頭所示）。圖1B顯示，固有層毛細(xì)管擴(kuò)張充血，伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)（黑色箭頭所示）；上皮紋狀緣消失，部分上皮細(xì)胞脫落（紅色箭頭所示）。圖1C可見(jiàn)腸絨毛上皮脫落壞死（黑色箭頭所示）；固有層毛細(xì)管擴(kuò)張充血伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)（紅色箭頭所示）。圖1D可觀察到，腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，固有層炎細(xì)胞浸潤(rùn)，輕微（黑色箭頭所示）。圖1E則可見(jiàn)上皮紋狀緣萎縮消失，輕微（黑色箭頭所示）；其他未見(jiàn)明顯病變。

回腸的組織損傷評(píng)分結(jié)果如圖1F所示。結(jié)果表明，加味枳術(shù)散可顯著改善回腸的損傷，減輕腸道損傷程度。與空白組相比，中、高劑量組的仔兔回腸病理學(xué)評(píng)分呈極顯著降低（Plt;0.01）。

回腸的絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度的結(jié)果如圖1G所示，與空白組相比，低、中、高劑量組的小腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度的比值都極顯著增加（Plt;0.001），恩諾沙星組小腸的絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度的比值極顯著的大于空白組（Plt;0.01）。與恩諾沙星組相比，中、高劑量組的小腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度的比值均極顯著的增加（Plt;0.001）。

2.2" 回腸緊密連接蛋白的表達(dá)水平

回腸緊密連接蛋白的基因表達(dá)水平結(jié)果如圖2A～2E所示。由圖2A、2D、2E可知，與空白組相比，中、高劑量組處理組空腸ZO1、Occludin和 JAM2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于空白組顯著升高（Plt;0.05），其中，中、高劑量組空腸Occludin mRNA 和JAM2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量極顯著的上升（Plt;0.05）；由圖2B可知，處理組的ZO2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量都極顯著的高于空白組（Plt;0.001）；由圖2C可知，與空白組相比，各處理組空腸Claudin mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于空白組，其中，除了且高劑量組和空白組相比顯著上調(diào)（Plt;0.05），其他組均無(wú)顯著性（Pgt;0.05）。與恩諾沙星組相比，各水平加味枳術(shù)散處理可顯著上調(diào)ZO2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.001）。

回腸緊密連接蛋白的蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖2F～2G所示。由圖2F可知，與空白組相比，各處理組仔兔的回腸中ZO1的蛋白表達(dá)量均顯著升高（Plt;0.01），與恩諾沙星組相比，中、高劑量加味枳術(shù)散處理組的回腸中ZO1的蛋白表達(dá)量顯著升高（Plt;0.01）；由圖2G可知，與空白組相比，加味枳術(shù)散處理組仔兔的回腸中Occludin的蛋白表達(dá)量均極顯著升高（Plt;0.001），且均極顯著高于恩諾沙星組，加味枳術(shù)散處理組仔兔的回腸中Occludin的蛋白表達(dá)量也均顯著升高（Plt;0.001）。

2.3" 回腸組織中MPO與MUC2的水平

回腸中MPO的活性水平結(jié)果如圖3A所示，與空白組相比，不同處理組的回腸中 MPO 的活性均降低，其中，高劑量組的MPO活性與空白組相比呈現(xiàn)極顯著降低（Plt;0.01）?；啬c中MUC2蛋白的表達(dá)量結(jié)果如圖3B、3C所示，空白組和各處理組回腸黏膜表面均有MUC2蛋白的表達(dá)，與空白組相比，中、高劑量組腸道黏膜表面MUC2的表達(dá)量顯著增高（Plt;0.05）。

2.4" 回腸中細(xì)胞炎癥因子與sIgA的水平

回腸中細(xì)胞炎癥因子的mRNA水平如圖4A～4F所示。由圖4A可知，加味枳術(shù)散處理組和恩諾沙星組均極顯著的抑制IL-1β mRNA的表達(dá)量（Plt;0.001）；由圖4B可知，處理組均可以抑制IL-2 mRNA的表達(dá)量，其中，中、高劑量組呈現(xiàn)顯著性顯著抑制IL-2 mRNA的表達(dá)（Plt;0.05，Plt;0.01）；由圖 4C、4E可知，加味枳術(shù)散處理組以劑量依賴的方式抑制IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)，其中，與空白組相比，中、高劑量組呈現(xiàn)顯著性差異（Plt;0.05，Plt;0.01）；由圖4D可知，加味枳術(shù)散處理組以劑量依賴的方式促進(jìn)IL-10 mRNA的表達(dá)，其中，低、高劑量組呈現(xiàn)顯著性差異（Plt;0.05，Plt;0.01）；由圖4F可知，加味枳術(shù)散處理組以劑量依賴的方式促進(jìn)TGF-β1 mRNA的表達(dá)，其中，與空白組相比，低、高劑量組均呈現(xiàn)差異顯著（Plt;0.05），且與恩諾沙星組相比，低、高劑量組均呈現(xiàn)顯著高于恩諾沙星組（Plt;0.05）?；啬c中sIgA的表達(dá)量如圖4G～4I所示。高劑量組顯著促進(jìn)回腸sIgA蛋白表達(dá)（Plt;0.05）。

2.5" 腸道中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的水平

由圖5A、5B可知，飼料中糧添加加味枳術(shù)散可以提高SOD 的活性，降低MDA 的水平，除高劑量組SOD 的水平呈現(xiàn)顯著差異外（Plt;0.05），其他均無(wú)顯著性（Pgt;0.05）；由圖5C可知，與空白組相比，加味枳術(shù)散處理組可提高GSH 的水平，中、高劑量組極顯著提高GSH 的水平活性（Plt;0.001），與恩諾沙星組相比，加味枳術(shù)散處理組均極顯著提高GSH 的活性（Plt;0.001）；由圖5D、E可知，飼料中添加加味枳術(shù)散高劑量組還可以顯著提高了T-AOC 和 CAT 的活性（Plt;0.05）。

3" 討" 論

本研究旨在評(píng)估加味枳術(shù)散對(duì)飼喂無(wú)抗生素日糧的斷奶仔兔的腸道形態(tài)、腸屏障功能以及抗氧化能力的影響。本研究的初衷和重點(diǎn)是為斷奶仔兔尋找抗生素替代品。飼料中添加抗生素能夠保護(hù)仔兔的腸道形態(tài)及功能的正常發(fā)育，本研究選擇恩諾沙星粉劑作為陽(yáng)性藥，與各加味枳術(shù)散處理組的效果作對(duì)比，在符合廣泛認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的添加效應(yīng)前提下，為斷奶仔兔尋找抗生素替代品提供參考。

3.1" 加味枳術(shù)散對(duì)斷奶仔兔腸道機(jī)械屏障的影響

眾所周知，保持腸道屏障的完整性和功能對(duì)人類和動(dòng)物的健康至關(guān)重要［17］。未成熟的腸道黏膜容易產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性的損害，病原體和毒素就可以穿過(guò)腸道壁進(jìn)入機(jī)體，引起腹瀉等癥狀。腸絨毛形態(tài)及變化可以評(píng)估腸道黏膜結(jié)構(gòu)的變化。黃鵬彭婧等［18］研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的板藍(lán)根多糖可以保護(hù)仔鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。本研究應(yīng)用常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行HE染色，觀察仔兔回腸組織黏膜結(jié)構(gòu)，測(cè)量其絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度值來(lái)研究添加不同水平的加味枳術(shù)散對(duì)斷奶仔兔回腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響。從石蠟切片結(jié)果可看出，加味枳術(shù)散可以保護(hù)仔兔回腸黏膜的結(jié)構(gòu)，抑制炎癥的發(fā)生，顯著降低腸道的病理組織評(píng)分。與恩諾沙星組相比，日糧添加0.3%、0.5%加味枳術(shù)散均能顯著減輕腸道的病變，其保護(hù)效果顯著。

緊密連接是維持腸道機(jī)械屏障完整性的重要組成部分。緊密連接復(fù)合體位于上皮細(xì)胞周圍頂端，由跨膜蛋白咬合蛋白（Occludin），閉合蛋白（Claudins），連接黏附分子（JAM）以及胞漿蛋白帶狀閉合蛋白家族（ZO1、ZO2、ZO3）等組成［19-20］ 。維持完整的腸上皮細(xì)胞緊密連接對(duì)保護(hù)腸屏障功能、防止細(xì)菌移位及毒性大分子進(jìn)入機(jī)體有重要意義。已有的研究顯示，白術(shù)可通過(guò)上調(diào)Occludin、Claudin-1緊密連接蛋白的表達(dá)起到對(duì)大鼠腸道機(jī)械屏障的保護(hù)作用［21］；白術(shù)還可通過(guò)顯著上調(diào)小腸Claudin-l，Occludin和ZO1的緊密連接蛋白的表達(dá)水平，從而修復(fù)仔鼠受損的腸黏膜［22］。

本研究通過(guò)使用RT-PCR方法和免疫熒光法，評(píng)估了加味枳術(shù)散對(duì)回腸的腸上皮細(xì)胞完整性和通透性的保護(hù)效果。結(jié)果顯示，加味枳術(shù)散可顯著提高ZO1的蛋白表達(dá)水平。其中，高劑量的加味枳術(shù)散可顯著上調(diào)回腸Occludin、Claudin、ZO1、ZO2以及JAM2 mRNA的水平，加強(qiáng)腸道細(xì)胞間的緊密連接，阻止毒素進(jìn)入體內(nèi)，抑制腸炎的發(fā)展。

3.2" 加味枳術(shù)散對(duì)斷奶仔兔腸道化學(xué)屏障的影響

腸道化學(xué)屏障由腸道分泌物和腸道有益菌群等共同形成。腸道分泌的消化液可以清潔腸腔［23］，部分化學(xué)物質(zhì)可以破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁或酶等，從而抵御病原菌的入侵［24］。

合成腸道黏液的主要黏蛋白基因是MUC2和MUC3基因，MUC2主要由腸道杯狀細(xì)胞分泌［25］。黏蛋白的組成和降解的變化可以改變細(xì)菌對(duì)黏膜的黏附［26］。Heczko等［27］研究證實(shí)，黏蛋白可以抑制病原體對(duì)腸細(xì)胞的附著，從而保護(hù)胃腸道免受病原體的侵害。嚴(yán)重的仔兔斷奶腹瀉會(huì)繼發(fā)腸炎。既往研究表明，耶爾森氏菌引發(fā)的兔的結(jié)腸炎會(huì)顯著增加回腸末端和結(jié)腸近端黏蛋白的產(chǎn)生［28］。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了回腸的MUC2蛋白的水平。結(jié)果顯示，加味枳術(shù)散可通過(guò)顯著增加MUC2蛋白的表達(dá)來(lái)減少有害菌對(duì)回腸黏膜的黏附，從而保護(hù)腸道化學(xué)屏障。這與朱春洋等［29］的研究結(jié)果相似，杯狀細(xì)胞數(shù)量的增多和MUC2的表達(dá)的升高能夠改善十二指腸的化學(xué)屏障，治療功能性消化不良。

另外，MPO活性的調(diào)節(jié)對(duì)腸道化學(xué)屏障具有兩面性。一方面，MPO通過(guò)氧化膽堿和亞硝酸鹽等方式破壞腸道化學(xué)屏障，使得腸道內(nèi)的細(xì)菌和毒素等物質(zhì)穿過(guò)腸道壁進(jìn)入血液，引發(fā)炎癥和疾?。?0］。另一方面，腸道內(nèi)的某些益生菌可以調(diào)節(jié)MPO的活性和分泌，減輕腸道炎癥，恢復(fù)腸道化學(xué)屏障的功能，從而維持腸道的健康［31］。因此，MPO與腸道化學(xué)屏障之間存在著密切的關(guān)系，其作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。本研究結(jié)果顯示，高劑量的加味枳術(shù)散可顯著降低MPO的活性。綜合分析，在疾病和病理狀態(tài)下，抑制MPO的活性成為一個(gè)可行的手段［32］。

3.3" 加味枳術(shù)散對(duì)斷奶仔兔腸道免疫屏障的影響

體內(nèi)的非特異性免疫與特異性免疫相互協(xié)同［33］。斷奶前，仔兔主要通過(guò)母兔的Ig傳遞產(chǎn)生被動(dòng)免疫［34］。這種保護(hù)推遲了其自身主動(dòng)反應(yīng)的建立。

在特異性免疫中，免疫球蛋白A（IgA）是腸道分泌的主要免疫球蛋白類型［35］。IgA進(jìn)入腸腔后不會(huì)激活補(bǔ)體或炎癥反應(yīng)，這使它們成為保護(hù)黏膜表面的理想選擇［36］。血清型IgA與分泌型IgA（sIgA）的免疫功能不同，sIgA對(duì)管腔內(nèi)的蛋白分解具有抵抗力［37］。sIgA能夠保護(hù)上皮細(xì)胞免受腸道毒素和病原微生物的侵害［38］。有研究指出，腸道內(nèi)高水平的sIgA有助于修復(fù)損傷的黏膜免疫組織［39］。此外，sIgA還能通過(guò)選擇性黏附在腸道細(xì)胞上，從而在免疫屏障中發(fā)揮作用［40］。腸道微生物群，腸道細(xì)胞因子和營(yíng)養(yǎng)素都參與腸道中sIgA的產(chǎn)生［41-42］。

在腸道中，炎癥反應(yīng)作為一種免疫應(yīng)答能夠抵御有害的微生物和其他外部刺激物質(zhì)［43］。但是，當(dāng)炎癥反應(yīng)過(guò)度或長(zhǎng)期存在時(shí)，它可以促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的凋亡與脫落，破壞腸道黏膜屏障和免疫屏障的完整性［44］。此外，炎癥反應(yīng)過(guò)程中，過(guò)度激活的免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子會(huì)進(jìn)一步加劇腸道免疫屏障的損傷［45］。腸道的屏障損傷與腸道炎癥發(fā)生關(guān)系密切，各種原因誘發(fā)的動(dòng)物腸道屏障損傷都有可能使腸道發(fā)生炎癥。為評(píng)估斷奶仔兔的腸道免疫水平以及腸道炎癥水平，本研究檢測(cè)了回腸的sIgA的蛋白水平，并利用 RT-PCR方法檢測(cè)回腸中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)，結(jié)果顯示，加味枳術(shù)散可顯著促進(jìn)腸道內(nèi)sIgA的分泌；通過(guò)RT-PCR檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)3個(gè)劑量的加味枳術(shù)散均可顯著降低IL-1β的水平，中、高劑量組可顯著降低促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6與 TNF-α的水平，降低腸道的炎癥水平。

3.4" 加味枳術(shù)散對(duì)斷奶仔兔回腸抗氧化能力的影響

氧化應(yīng)激是與炎癥緊密相關(guān)的伴隨反應(yīng)，抗氧化能力能夠反映機(jī)體的健康狀況，機(jī)體內(nèi)的氧化-抗氧化系統(tǒng)共同參與調(diào)節(jié)自由基的生長(zhǎng)與消除，抗氧化酶具有較強(qiáng)清除體內(nèi)自由基的活性作用［46］。在炎癥過(guò)程中，機(jī)體易出現(xiàn)氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡［47］。抗氧化酶GSH、SOD和CAT是抗氧化系統(tǒng)中的重要的組成部分［48］。為了抑制氧自由基的積聚，SOD將超氧陰離子催化為過(guò)氧化氫，進(jìn)一步抑制超氧陰離子對(duì)細(xì)胞造成損傷［49］。大量過(guò)氧化氫會(huì)破壞組織細(xì)胞，CAT能將過(guò)氧化氫催化為水和氧氣［50］，減輕機(jī)體損傷。T-AOC 表示機(jī)體總抗氧化能力，MDA 含量直接決定機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度，是機(jī)體評(píng)價(jià)脂質(zhì)氧化損傷的重要指標(biāo)，同時(shí)也可間接反映腸黏膜細(xì)胞的損傷程度［51］。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)腸道的氧化應(yīng)激水平來(lái)評(píng)估仔兔腸道的抗氧化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加味枳術(shù)散主要通過(guò)提高抗氧化酶的活性（SOD、GSH、CAT），維持腸道的正常機(jī)能。

4" 結(jié)" 論

本研究發(fā)現(xiàn)，加味枳術(shù)散能夠有效改善斷奶仔兔回腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)、加強(qiáng)腸道細(xì)胞間的緊密連接，維持腸黏膜的通透性，降低腸道的炎癥水平和氧化水平，保護(hù)斷奶仔兔的腸道健康。0.3%和0.5%的加味枳術(shù)散均對(duì)腸道有不同程度的腸道保護(hù)功效，但在使用傳統(tǒng)中藥進(jìn)行治療時(shí)，還需要綜合考慮仔兔的身體狀況、病情嚴(yán)重程度等。本研究結(jié)果有助于在生產(chǎn)上權(quán)衡中藥的使用量和療效時(shí)作參考。

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（編輯" 范子娟）