一株鴨源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

摘 要：為確認(rèn)山東省德州市某肉鴨場(chǎng)疑似為鴨多殺性巴氏桿菌感染的病原菌，本試驗(yàn)對(duì)于送檢病死鴨進(jìn)行剖檢、細(xì)菌分離培養(yǎng)、菌落觀察、生化試驗(yàn)、PCR鑒定、16S rRNA基因測(cè)序分析以及藥敏試驗(yàn)等方法鑒定該病原菌。結(jié)果顯示：分離得到的病原菌在含有5%胎牛血清的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中呈現(xiàn)為圓形、濕潤(rùn)、光滑的灰白色菌落，革蘭氏染色為陰性短桿菌，瑞氏染色呈現(xiàn)兩極濃染；分離菌株的生化特性可以發(fā)酵葡萄糖、蔗糖以及甘露醇，硫化氫、氧化酶等試驗(yàn)陽(yáng)性；細(xì)菌特異性PCR擴(kuò)增片段與預(yù)期條帶大小一致；16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示與多殺性巴氏桿菌同源性為99%；分離菌株對(duì)于新霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟、林可霉素具有耐藥性，對(duì)于氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素、粘桿菌素B、卡那霉素、大觀霉素敏感。本研究結(jié)果為鴨源多殺性巴氏桿菌病的防治提供一定參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鴨；多殺性巴氏桿菌；分離鑒定；16S rRNA；耐藥性

中圖分類號(hào)：S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2024）07-0023-08

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是一種重要的革蘭氏陰性人畜共患致病菌，可引起人類和動(dòng)物嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率，造成畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。多殺性巴氏桿菌具有莢膜和芽孢，無(wú)鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧菌[3-4]。多殺性巴氏桿菌引起的常見(jiàn)疾病包括家禽霍亂、牛出血性敗血癥和豬萎縮性鼻炎[5-6]。

鴨巴氏桿菌病是由巴氏桿菌引起的一種急性、敗血性傳染病。該病的主要特征是肝臟、心臟、腎臟等器官的實(shí)質(zhì)性病變和彌漫性出血。該病在養(yǎng)鴨業(yè)中較為常見(jiàn)，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)造成了較大的威脅[7-8]。鴨巴氏桿菌病可發(fā)生于各品種的鴨，但以肉用型鴨多發(fā)。該病主要通過(guò)呼吸道和消化道傳播，也可通過(guò)直接接觸傳播。病鴨和帶菌鴨是該病的主要傳染源，健康鴨通過(guò)與病鴨接觸或食用被污染的飼料和水源而感染。該病一年四季均可發(fā)生，但以春季和秋季多發(fā)。根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化可對(duì)鴨巴氏桿菌病進(jìn)行初步診斷，但確診需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查[9-11]。實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、血清學(xué)診斷等。

2023年11月，山東德州某肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)29日齡肉鴨出現(xiàn)大批死亡現(xiàn)象，病程短，死亡率較高。鴨群主要表現(xiàn)精神沉郁，采食量低，行動(dòng)緩慢；發(fā)病鴨常常聚集成堆，不愿活動(dòng)，羽毛潮濕，有時(shí)出現(xiàn)腹瀉，排黃綠色稀便。對(duì)病死鴨進(jìn)行剖檢，可見(jiàn)肝臟表面有大量針尖狀白色壞死灶；心臟淤血，心包積液；肺臟淤血、水腫；脾臟腫大，花斑狀；腸道腫脹，腸系膜出血等。根據(jù)臨床癥狀和解剖特點(diǎn)，初步懷疑患病鴨可能是感染鴨多殺性巴氏桿菌引起的。為了進(jìn)一步確認(rèn)病原，本試驗(yàn)對(duì)患病鴨進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定，并對(duì)分離菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，以期為該病的防治提供一定的參考依據(jù)。

1 "材料與方法

1.1 "病料采集

無(wú)菌采集山東省德州市某肉鴨場(chǎng)29～30日齡發(fā)病死亡肉鴨的肝臟、脾臟組織，送至山東和康源生物育種股份有限公司動(dòng)物保健研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 "試驗(yàn)試劑及主要儀器

主要試劑：營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）購(gòu)于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；2 × PCR mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA Marker、核酸染料購(gòu)于北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；藥敏紙片購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒、瑞氏染色試劑盒購(gòu)于金克隆（北京）生物技術(shù)有限公司；小牛血清購(gòu)于平睿生物科技（北京）有限公司。

主要儀器：醫(yī)用潔凈工作臺(tái)購(gòu)于濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱購(gòu)于天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；N-300M顯微鏡購(gòu)于寧波永新光學(xué)股份有限公司；164-5050型電泳儀購(gòu)于Bio-Rad Laboratories，Inc；Y04S-3D型凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)于北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；T30型三槽梯度PCR儀購(gòu)于杭州朗基科學(xué)儀器有限公司。

1.3 "細(xì)菌分離培養(yǎng)及純化

將采集的病死鴨肝臟、脾臟組織無(wú)菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（含5%胎牛血清），置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài)。選取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色和瑞氏染色、鏡檢，觀察分離菌的形態(tài)特征，并對(duì)疑似菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.4 "細(xì)菌生化鑒定

將分離菌株的純化培養(yǎng)產(chǎn)物分別接種于細(xì)菌生化微量鑒定管，包括葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、枸櫞酸鹽、尿素、硫化氫、氧化酶、過(guò)氧化氫、硝酸鹽還原、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》判定反應(yīng)結(jié)果。

1.5 " PCR鑒定

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中Pm的kmt1基因設(shè)計(jì)引物；F：5’- ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’；R：5’- GCTGTAAACGAACTCGC CAC -3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。無(wú)菌挑取疑似菌落于100 μL的無(wú)菌PBS中，煮沸5 min后以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)表1，擴(kuò)增程序參數(shù)見(jiàn)表2。PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增目的條帶長(zhǎng)度為460 bp。

1.6 "16S rRNA基因序列測(cè)序及分析

挑取分離純化后的菌株，依據(jù)細(xì)菌總DNA提取試劑盒要求，進(jìn)行純化菌株的總DNA提取。16S rRNA基因引物序列：F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；R：5’-TACGGTTACCTTGTTACG ACTT-3’，預(yù)期條帶大小為1 466 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)表3，擴(kuò)增程序參數(shù)見(jiàn)表4。PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將PCR回收產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行同源性分析，選取同源性較高菌株的16S rRNA基因序列，并通過(guò)MEGA 11.0.10軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.7 "藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散（K-B）法對(duì)分離菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，將純化的菌株均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）上，將藥敏片間隔30 mm以上進(jìn)行敏感試驗(yàn)，根據(jù)抑菌圈大小判定菌株的藥物敏感性。分離菌結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表5。

2 "結(jié)果分析

2.1 "細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察

利用病死鴨肝臟、脾臟組織分別進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，該菌株純化后在麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）培養(yǎng)24 h后，呈現(xiàn)為圓形、濕潤(rùn)、光滑的灰白色菌落，菌落形態(tài)見(jiàn)圖1；革蘭氏染色為陰性菌，球桿狀或短桿狀，菌體鈍圓；瑞氏染色呈現(xiàn)兩極濃染，見(jiàn)圖2。該分離菌株與多殺性巴氏桿菌特性一致。

2.2 "細(xì)菌生化鑒定

分離菌株的生化鑒定結(jié)果顯示，該菌株可以發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇，不發(fā)酵乳糖、麥芽糖，無(wú)法分解尿素，硫化氫、氧化酶、過(guò)氧化氫試驗(yàn)均為陽(yáng)性，枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)均為陰性，符合多殺性巴氏桿菌生化特征。分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

2.3 " kmt1基因擴(kuò)增結(jié)果

以分離純化菌株總DNA為模板，使用kmt1基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。擴(kuò)增目的片段大小約為460 bp，與預(yù)期擴(kuò)增條帶大小結(jié)果相符。

2.4 "16S rRNA基因序列分析結(jié)果

分離菌株16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序后，將測(cè)序序列利用GenBank進(jìn)行Blast序列對(duì)比，之后使用MEGA 11.0.10軟件綜合分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖4。進(jìn)一步分析確定分離菌株與多殺性巴氏桿菌（GenBank登錄號(hào)：MG597100.1）的同源性為99%，說(shuō)明該分離菌株為多殺性巴氏桿菌。

2.5 "細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)紙片擴(kuò)散（K-B）法的結(jié)果顯示，分別測(cè)量抑菌圈直徑，菌株藥敏結(jié)果見(jiàn)表7。該菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)新霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟、林可霉素耐藥；對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素、粘桿菌素B、卡那霉素、大觀霉素表現(xiàn)高敏性。

3 "討論分析

多殺性巴氏桿菌是一種常見(jiàn)的動(dòng)物病原菌，可引起動(dòng)物嚴(yán)重的出血性敗血癥。在自然界中，多殺性巴氏桿菌可感染多種動(dòng)物，包括家禽、野禽、家畜和水生動(dòng)物[12-14]。特別是在養(yǎng)鴨業(yè)中，多殺性巴氏桿菌的感染更為常見(jiàn)，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。有研究表明多殺性巴氏桿菌感染鴨的最初階段，在鴨的肝組織中誘導(dǎo)出血和壞死病變，促進(jìn)炎癥小體的組裝和釋放，引發(fā)炎癥，造成鴨肝臟損傷。依據(jù)多殺性巴氏桿菌莢膜多糖抗原成分的不同，可以分為A、B、D、E以及F共5個(gè)血清型，其中A型多殺性巴氏桿菌是引起禽霍亂的主要血清型[15-16]。目前，抗生素依舊是防治多殺性巴氏桿菌的有效治療方法，但是由于過(guò)度和不合理地使用抗菌藥物，加速了這些微生物中編碼耐藥性基因表達(dá)的選擇性壓力，從而增加了耐藥分離株的出現(xiàn)[17-18]。另外，多重耐藥菌株也時(shí)常被廣泛報(bào)道，其中多殺性巴氏桿菌的耐藥基因可通過(guò)可移動(dòng)質(zhì)粒進(jìn)行整合或拼接，促進(jìn)了多重耐藥菌株的出現(xiàn)[19]。免疫接種也是防治多殺性巴氏桿菌病的一種重要手段，其中滅活疫苗與弱毒疫苗對(duì)防治多殺性巴氏桿菌病也發(fā)揮了重要作用[20]。

本研究首先從病死鴨的體內(nèi)采集了病料，并通過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、PCR鑒定以及16S rRNA基因序列測(cè)序等手段，成功地分離鑒定了1株鴨源多殺性巴氏桿菌，闡明了該分離菌株的菌落特性、形態(tài)特征、生化特性等生物學(xué)特點(diǎn)。為了更好地了解該菌株的耐藥性，對(duì)該菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株對(duì)多種抗生素具有耐藥性，其中對(duì)新霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟、林可霉素耐藥；對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素、粘桿菌素B、卡那霉素、大觀霉素表現(xiàn)高敏性。在多殺性巴氏桿菌的臨床防治過(guò)程中，抗生素不規(guī)范、不合理的使用導(dǎo)致其對(duì)于多種抗生素具有較強(qiáng)的抗性，并且可能進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)于抗生素的抗性。因此，多殺性巴氏桿菌防治需要按需合理使用抗生素，避免濫用藥物，同時(shí)養(yǎng)殖過(guò)程中加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，合理通風(fēng)，保持適宜的溫度與濕度，加強(qiáng)舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)管，減少多殺性巴氏桿菌病的傳播[21]。本研究為多殺性巴氏桿菌防控與治療提供了一定數(shù)據(jù)參考，也為相關(guān)多殺性巴氏桿菌疫苗株篩選與開(kāi)發(fā)奠定一定基礎(chǔ)。

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Isolation， Identification and Drug Resistance Analysis of a Duck-Origin Pasteurella Multocida Strain

LIU Honggang1， ZHAO Jie1， SHI Yanhong1， ZHANG Xiao1， WANG Jianhua1，XU Mingqing1，

MA Qin1， LIU Zihan1， YU Feifei1， LV Junfeng2，3， ZHU Tong2，3， LIU Liping2，3， LI Yufeng2，3

（1. Shandong Hekangyuan Biological Breeding Co.， Ltd.， Jinan， Shan dong "250001，China;

2. Poultry Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan "250100，China;

3. Poultry Breeding and Disease Prevention and Control Shandong Engineering Research Center，

Jinan "250100，China）

Abstract： "In order to investigate the suspected pathogenic bacteria causing Pasteurella multocida infection in ducks at a meat-type duck farm in Dezhou， Shandong Province， various methods were employed. These methods included necropsy， bacterial isolation and culture， colony observation， biochemical experiments， PCR identification， 16S rRNA gene sequencing analysis， and drug sensitivity testing of deceased ducks. The findings revealed that the isolated pathogenic bacteria cultivated on nutrient agar medium supplemented with 5% fetal bovine serum exhibited characteristics of round， slightly raised， moist， smooth， and translucent colonies.The Gram staining results indicated a negative presence of Brevibacterium， while the Wright staining revealed poles staining. The isolated strains exhibited the ability to ferment glucose， sucrose， and mannitol， and yielded positive results for hydrogen sulfide， oxidase， and other tests. The amplified fragment obtained through bacterial specific PCR was found to be consistent with the expected band size. The phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequence demonstrated a 99% homology with Pasteurella multocida. Furthermore， the isolated strains displayed resistance to neomycin， amoxicillin， ampicillin， cefotaxime， and lincomycin， while exhibiting sensitivity to florfenicol， enrofloxacin， and doxycycline， colistin B， kanamycin， spectinomycin. The findings of this study offer valuable insights for the prevention and treatment of Pasteurella multocida in ducks.

Keywords：Duck; Pasteurella multocida; Isolation and identification; 16S rRNA; Drug resistance

基金項(xiàng)目：山東省農(nóng)業(yè)良種工程：優(yōu)質(zhì)肉鴨育種技術(shù)創(chuàng)新與新品種培育（項(xiàng)目編號(hào)：2022LZGC014）

第一作者：劉洪港（1997—），男，碩士，研究方向?yàn)榧仪菀卟≡\斷與防治，E-mail：LHG2013614@163.com

并列第一作者：趙杰（1988—），女，碩士，獸醫(yī)師，研究方向?yàn)榧仪菀卟≡\斷與防治，E-mail：945975664@qq.com

通信作者：李玉峰（1973—），男，博士，研究員，研究方向?yàn)榧仪莘肿硬≡瓕W(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail：dicpd@163.com