獼猴桃潰瘍病菌Ⅲ型效應(yīng)蛋白HopAH1的三維結(jié)構(gòu)與生化功能分析

摘要：獼猴桃潰瘍病危害嚴重，影響獼猴桃的產(chǎn)量。對獼猴桃潰瘍病菌14個保守的Ⅲ型效應(yīng)蛋白進行了功能域預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)HopAH1屬于糖基水解酶超級家族。搜索同源蛋白并結(jié)合進化樹分析發(fā)現(xiàn)，HopAH1與丁香假單胞菌番茄致病變種的效應(yīng)蛋白親緣關(guān)系較近，而與其他同源蛋白的親緣關(guān)系相對較遠。Alpha Fold2 預(yù)測三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，HopAH1具有糖基水解酶GH5家族典型的桶狀結(jié)構(gòu)。酶活性測定試驗發(fā)現(xiàn)HopAH1不能水解槐樹豆膠、羧甲纖維素鈉以及對硝基苯基-β-D半乳糖苷等3種底物，推測可能存在其他特異性底物。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蛋白瞬時表達體系在本氏煙中表達HopAH1，發(fā)現(xiàn)不能引起煙草細胞壞死。研究結(jié)果將為HopAH1的作用機制研究提供參考。

關(guān)鍵詞：獼猴桃潰瘍病菌；效應(yīng)蛋白；三維結(jié)構(gòu)；生化功能

中圖分類號：S436.634.1+9 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）12-0121-07

獼猴桃富含維生素C等多種營養(yǎng)物質(zhì)，被譽為“水果之王”，是重要的園藝經(jīng)濟作物［1］。獼猴桃潰瘍病危害嚴重，病原為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）［2］。獼猴桃潰瘍病在我國獼猴桃產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，特別是在四川和陜西等獼猴桃主產(chǎn)區(qū)，發(fā)病率可達20%，嚴重影響了我國獼猴桃產(chǎn)量［3］。目前針對獼猴桃潰瘍病菌發(fā)病成災(zāi)機制的研究非常少，也加大了對其采取有效防治措施的難度。因此，深入研究獼猴桃潰瘍病菌的致病機理，對制定獼猴桃潰瘍病防治新策略，進而有效地控制病害、提高獼猴桃產(chǎn)量具有重要意義。

植物病原細菌利用Ⅲ型分泌系統(tǒng)將效應(yīng)蛋白導(dǎo)入寄主細胞，通過影響寄主免疫反應(yīng)及多種生物學進程導(dǎo)致寄主感?。?］。據(jù)報道，在Psa中至少有30個效應(yīng)蛋白可以通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)進入寄主細胞，并且一部分效應(yīng)蛋白的功能已經(jīng)被研究［5］。比如，效應(yīng)蛋白AvrE1和HopR1被發(fā)現(xiàn)是Psa的2個重要致病因子，二者缺失后均會嚴重影響Psa的致病力［6］；效應(yīng)蛋白HopZ5是一個YopJ家族的乙酰轉(zhuǎn)移酶，其酶活性是其觸發(fā)本氏煙和擬南芥上的過敏性壞死反應(yīng)所必需的［7］；張晉龍等通過基因敲除的方法獲得了缺失19個效應(yīng)蛋白基因的Psa突變體ΔAFELOM，致病性試驗顯示突變體ΔAFELOM的致病力完全喪失，表明這19個效應(yīng)蛋白在Psa致病過程中發(fā)揮了重要作用［8］；朱俏眉等發(fā)現(xiàn)敲除效應(yīng)蛋白基因HopAZ1后突變體的致病性顯著上升，并進一步鑒定到HopAZ1的2個互作蛋白Cp1和PR5［9］。

編碼效應(yīng)蛋白的基因在植物病原細菌與寄主互作過程中往往受到選擇壓力而出現(xiàn)變異或缺失等現(xiàn)象［4］。在Psa中有14個效應(yīng)蛋白在獼猴桃潰瘍病菌的所有生物型中均存在，包括AvrD1、AvrE1、AvrPto5、HopAH1、HopAS1、HopAU1、HopAZ1、HopD1、HopN1、HopQ1、HopR1、HopS2、HopY1和HopZ3，這種保守性暗示了它們可能在獼猴桃潰瘍病菌致病過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［7］。然而絕大多數(shù)效應(yīng)蛋白的三維結(jié)構(gòu)與生化功能尚不清楚，目前僅有報道對AvrE1、HopAZ1和HopR1的功能開展了相關(guān)研究。本研究通過生物信息學方法對獼猴桃潰瘍病菌的14個保守效應(yīng)蛋白的功能域進行了預(yù)測，然后對HopAH1的三維結(jié)構(gòu)及其生化功能進行了分析，以期為其致病機理的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃潰瘍病菌株分離自江蘇省南京市六合區(qū)紅陽獼猴桃園，保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物細菌創(chuàng)新團隊。試驗于2023年7—11月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物細菌創(chuàng)新團隊實驗室完成。載體構(gòu)建所用的菌株為大腸桿菌DH5α；蛋白原核表達所用的菌株為大腸桿菌BL21（DE3），蛋白植物表達所用的菌株為農(nóng)桿菌GV3101。誘導(dǎo)細胞壞死試驗使用4～6周的本氏煙，溫室培養(yǎng)條件為25 ℃，光—暗比為18 h—6 h。

載體構(gòu)建所用的聚合酶與連接酶均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；抗生素和蛋白層析柱、鎳珠填充材料以及其他生化試劑（包括異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、乙酰丁香酮、槐樹豆膠、羧甲纖維素鈉、對硝基苯基-β-D半乳糖等）均購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白上樣緩沖液與蛋白分子量標準均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 效應(yīng)蛋白的功能域預(yù)測分析

使用NCBI的保守功能域數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）搜索14個保守效應(yīng)蛋白的氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域。

1.3 HopAH1的進化分析

在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/blast）中利用BLAST搜索HopAH1的同源蛋白，選取同源性較高的蛋白用于進化樹的構(gòu)建。使用MEGA 7.0構(gòu)建進化樹。

1.4 HopAH1的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測及結(jié)構(gòu)分析

利用Alpha Fold2（https：//github.com/google-deepmind/alphafold）預(yù)測HopAH1的三維結(jié)構(gòu)。通過Dali服務(wù)器（http：//ekhidna2.biocenter.helsinki.fi/dali/）在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB）中進行同源結(jié)構(gòu)搜索。使用Pymol軟件對HopAH1與其同源蛋白進行結(jié)構(gòu)比對。

1.5 基因克隆與表達載體構(gòu)建

1.5.1 HopAH1基因克隆

以獼猴桃潰瘍病菌為模板，擴增HopAH1基因片段。引物用BioMX 2.7.1軟件設(shè)計（表1），PCR條件為95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，34個循環(huán)；72 ℃ 8 min。使用OMEGA Cycle-pure kit試劑盒按照說明書純化PCR產(chǎn)物得到基因片段HopAH1。

1.5.2 原核表達載體構(gòu)建

將基因片段HopAH1與載體pGEX-4T-2連接，連接反應(yīng)體系為：基因片段 3 μL，載體2 μL，2×Uniclone seamless 5 μL，50 ℃ 連接15 min。隨后將得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，42 ℃熱擊90 s，37 ℃搖床培養(yǎng)2 h，涂LB（氨芐青霉素50 μg/mL）平板，取單菌落進行PCR驗證。將驗證正確的菌落用LB（氨芐青霉素50 μg/mL）液體培養(yǎng)基在37 ℃搖床中培養(yǎng)，按照天根生化科技（北京）有限公司的質(zhì)粒小提中量試劑盒說明書提取質(zhì)粒后測序驗證。

1.5.3 植物表達載體構(gòu)建

將基因片段HopAH1、XopN與載體pBIN-GFP連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，涂LB（卡那霉素50 μg/mL）平板，37 ℃培養(yǎng)12 h后，挑選單菌落進行PCR驗證，將驗證正確的單菌落再培養(yǎng)并按照天根生化科技（北京）有限公司的質(zhì)粒小提中量試劑盒說明書提取質(zhì)粒后測序驗證。

1.6 蛋白表達與純化

將構(gòu)建好的原核表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中，42 ℃熱擊90 s后涂LB（氨芐青霉素 50 μg/mL）平板。挑取單菌落用LB（氨芐青霉素 50 μg/mL）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至D600 nm為0.6～0.8，然后加入0.3 mmol/L IPTG在20 ℃條件下培養(yǎng)8～10 h。4 ℃ 5 000 r/min 條件下離心5 min收集大腸桿菌菌體，并用提前預(yù)冷的ddH2O和1×PBS分別在上述條件下清洗1次并收集菌體。將菌體用 10 mL 1×PBS重新懸浮后用細胞破碎儀300 W破碎 30 min，將超聲破碎后的菌液用離心機離心 20 min，離心條件為4 ℃、8 500 r/min，收集上清液。將上清液流過裝有谷胱甘肽瓊脂糖樹脂的親和層析柱富集HopAH1，用洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、5 mmol/L谷胱甘肽）對富集蛋白的瓊脂糖珠進行洗脫。洗脫后的含有HopAH1的蛋白溶液用考馬斯亮藍染色法驗證。

1.7 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與煙草瞬時表達外源基因

將含有PB-HopAH1-GFP、PB-XopN-GFP、PB-GFP的質(zhì)粒分別加入農(nóng)桿菌GV3101中混勻，依次于冰上靜置5 min、液氮靜置5 min、37 ℃水浴 5 min、冰浴5 min。在28 ℃搖床中復(fù)蘇2～3 h，涂LB（卡那霉素50 μg/mL、利福平50 μg/mL）平板并放入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d。

從LB平板上挑取含有PB-HopAH1-GFP、PB-XopN-GFP、PB-GFP的GV3101單菌落，用LB液體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)至D 600 nm為2.0。將培養(yǎng)好的菌液5 000 r/min離心3 min收集菌體，用煙草緩沖液（含10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2、200 μmol/L 乙酰丁香酮，pH值為5.6）清洗2次并收集菌體，再用煙草緩沖液重新稀釋菌體至D600 nm為0.6。將稀釋好的農(nóng)桿菌菌液用無針頭的一次性注射器緩慢打入煙草葉片，將注射好的葉片放入 28 ℃ 溫室中培養(yǎng)48 h。

1.8 蛋白提取與免疫印跡檢測

將培養(yǎng)48 h的注射PB-HopAH1-GFP、PB-XopN-GFP、PB-GFP煙草分別收集，用液氮迅速冷凍并用研缽研磨成粉末狀，加入含有1 mL 蛋白裂解液和10 μL蛋白酶抑制劑的離心管中，渦旋混勻，4 ℃、20 000 r/min離心10 min，將上清液吸出再重復(fù)1次，放入-80 ℃保存。

將80 μL蛋白和20 μL SDS蛋白上樣緩沖液，在100 ℃下反應(yīng)5 min，冰上放置2 min，取20 μL蛋白用 12%SDS-PAGE凝膠進行電泳檢測，電壓 80～130 V，電泳時間100 min。電泳結(jié)束后將膠取出，從負極開始將海綿、濾紙、膠、PVDF膜（甲醇浸泡）、濾紙、海綿按照順序放入夾板，80 V轉(zhuǎn)膜3 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜正面朝上用含有4%脫脂奶粉的TBST（三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）封閉40 min，后用TBST清洗3次，每次5 min。加入GFP抗體避光孵育2 h，再用TBST清洗3次，每次5 min。用全自動化學發(fā)光分析儀觀察結(jié)果。

1.9 β-1，4-葡聚糖酶活性檢測

將純化的蛋白HopAH1與底物0.5%槐樹豆膠、1%羧甲基纖維素鈉、5 mmol/L對硝基苯基-β-D半乳糖苷進行反應(yīng)，反應(yīng)體系300 μL：50 mmol/L pH值為7.4的磷酸鈉緩沖液、0.5 mol/L NaCl、底物、15 μL HopAH1；37 ℃孵育1 h后加入300 μL顯色劑，100 ℃顯色5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 14個保守T3SE的功能域預(yù)測分析

用NCBI保守功能域數(shù)據(jù)庫對Psa的14個保守Ⅲ型效應(yīng)蛋白的功能域進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)有6個效應(yīng)蛋白具有已知的功能域結(jié)構(gòu)，而在另外8個效應(yīng)蛋白中并未發(fā)現(xiàn)已知的功能域結(jié)構(gòu)。其中HopAH1屬于糖基水解酶超級家族；HopAS1屬于ATP酶類超級家族；HopZ3屬于YopJ類絲氨酸/蘇氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶；HopN1屬于C58肽酶類超級家族；HopY1屬于HrpA_pilin超級家族；HopQ1屬于核苷水解酶超級家族（表2）。據(jù)網(wǎng)址https：//www.cazypedia.org/index.php/Glycoside_Hydrolase_Families顯示，糖基水解酶超級家族（glycosyl hydrolases super family，GHs）擁有174個家族（GH1～GH174），包含幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶等成員。GHs的不同家族成員具有不同的酶活特性與底物特異性，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GHs的多個家族成員是病原菌的重要致病因子［10］。雖然HopAH1屬于GHs，但是其具體功能目前并不清楚；因此，接下來對HopAH1的三維結(jié)構(gòu)及生化功能展開研究。

2.2 HopAH1的進化分析

為了分析HopAH1的進化關(guān)系，首先在Uniprot數(shù)據(jù)庫中利用BLAST搜索了HopAH1的同源蛋白，并從中選取了同源性最高的23個蛋白用于進化樹的構(gòu)建。用于分析的23個HopAH1同源蛋白來源于不同種類微生物，包括多種芽孢桿菌、血桿菌、青枯菌等，且大多數(shù)被報道為GH5家族的纖維素酶。進化樹結(jié)果顯示，HopAH1與丁香假單胞菌番茄致病變種的效應(yīng)蛋白HopAH1、HopAH2-1、HopAH2-2的親緣關(guān)系最近，處在同一個大的進化分支上（圖1）。而HopAH1與其他同源蛋白的親緣關(guān)系相對較遠（圖1）， 暗示了它們雖然都屬GHs家族， 但是在功能上可能出現(xiàn)了分化。

2.3 HopAH1的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析

為了分析HopAH1的三維結(jié)構(gòu)，利用Alpha Fold2對其三維結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測。HopAH1的三維結(jié)構(gòu)中包含了8個α螺旋與8個β折疊，其中8個β折疊組成的桶狀結(jié)構(gòu)被8個α螺旋包圍在中間（圖2），而這種桶狀結(jié)構(gòu)正是GH5家族蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征。通過分析結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)HopAH1的93E和194E很可能是它的酶活催化位點。以HopAH1的三維結(jié)構(gòu)為對象，通過蛋白同源結(jié)構(gòu)搜索服務(wù)器Dali在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB）中進行搜索，發(fā)現(xiàn)多個與HopAH1結(jié)構(gòu)類似的蛋白。選取Z分數(shù)gt;15.0（Z 分數(shù)越高，表示二者結(jié)構(gòu)越相似）的蛋白結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛋白被注釋為纖維素酶（表3）。

將PDB中結(jié)構(gòu)最相似的4個蛋白（PDB編號分別為1wky、7vt4、6r2j、4v2x）與HopAH1進行結(jié)構(gòu)比對分析，發(fā)現(xiàn)它們均表現(xiàn)出桶狀結(jié)構(gòu)，并且酶活催化位點在結(jié)構(gòu)上的位置也完全一致（圖3）。上述比對結(jié)果表明，HopAH1可能與這4個蛋白具有類似的酶活特性與作用底物，其中1wky為嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)生的堿性甘露聚糖酶；7vt4為黃山美氏藻產(chǎn)生的GH5家族內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶；6r2j為施氏假單胞菌A1501產(chǎn)生的GH5_5家族內(nèi)切葡聚糖酶；4v2x為耐鹽芽孢桿菌產(chǎn)生的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶［11-14］。

2.4 HopAH1的蛋白表達、純化及酶活性分析

為了驗證HopAH1的β-1，4葡聚糖酶活性，將經(jīng)過谷胱甘肽瓊脂糖樹脂純化的HopAH1通過 SDS-PAGE 凝膠電泳分離并用考馬斯亮藍染色法進行驗證，蛋白條帶大小約為55 ku，與HopAH1預(yù)測大小基本一致（圖4-A）。 將純化后并且分子量大小正確的HopAH1進行β-1，4葡聚糖酶活性分析，選取了0.5%槐樹豆膠、1%羧甲基纖維素鈉、5 mmol/L 對硝基苯基-β-D半乳糖苷3種底物分別與HopAH1進行反應(yīng)［15-16］。結(jié)果表明，與陽性對照相比，上述3種底物均沒有被HopAH1水解（圖 4-B）。

2.5 HopAH1誘導(dǎo)煙草細胞壞死能力分析

為了驗證HopAH1是否會引起植物的細胞壞死，首先構(gòu)建了植物表達載體：pBIN-HopAH1-GFP、pBIN-XopN-GFP、pBIN-GFP，并轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101。以GFP作為陰性對照，已知可以引起植物細胞壞死的XopN-GFP作為陽性對照［17］。將上述農(nóng)桿菌注射4～6周煙草葉片，注射后48 h觀察結(jié)果。結(jié)果表明，瞬時表達HopAH1-GFP后煙草葉片無明顯變化，與陽性對照XopN-GFP相比，HopAH1-GFP沒有引起煙草細胞壞死（圖5-A）。免疫印跡檢測結(jié)果顯示HopAH1-GFP、XopN-GFP、GFP在煙草中均已表達（圖5-B）。

3 討論與結(jié)論

效應(yīng)蛋白在調(diào)控寄主免疫和細菌致病性中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。探明效應(yīng)蛋白的三維結(jié)構(gòu)與生化功能，對解析病菌致病性具有重要意義。然而，目前在獼猴桃潰瘍病菌中仍有許多效應(yīng)蛋白的三維結(jié)構(gòu)與生化功能尚不清楚。本研究通過深入分析獼猴桃潰瘍病菌中14個保守效應(yīng)蛋白，發(fā)現(xiàn)6個效應(yīng)蛋白具有已知的功能域結(jié)構(gòu)，可為后續(xù)深入研究效應(yīng)蛋白的作用與機制提供線索。

本研究發(fā)現(xiàn)，HopAH1屬糖基水解酶超級家族，進一步通過Alpha Fold2預(yù)測發(fā)現(xiàn)HopAH1的三維結(jié)構(gòu)表現(xiàn)GH5家族典型的桶裝結(jié)構(gòu)，并且具有保守的酶活催化位點。但是酶活性分析發(fā)現(xiàn)GH5并不能水解常見的槐樹豆膠、羧甲基纖維素鈉、對硝基苯基-β-D半乳糖苷等3種底物。HopAH1的進化分析結(jié)果表明，其除了與丁香假單胞菌番茄致病變種的效應(yīng)蛋白親緣關(guān)系較近外，與其他同源蛋白的親緣關(guān)系相對較遠。因此，推測HopAH1雖然具有GH5家族典型的桶裝結(jié)構(gòu)，但是很可能具有較強的底物特異性。

糖基水解酶家族成員作為病菌的效應(yīng)蛋白通常在細胞外發(fā)揮功能，并且往往會觸發(fā)植物的細胞壞死［10］。HopAH1作為效應(yīng)蛋白被獼猴桃潰瘍病菌導(dǎo)入植物細胞內(nèi)行使功能，這在糖基水解酶家族成員中鮮有報道。在本氏煙中瞬時表達HopAH1并不能引起煙草細胞的壞死，表明HopAH1與胞外糖基水解酶的作用機制可能存在區(qū)別。下一步將鑒定HopAH1的作用底物以及互作蛋白，以期解析HopAH1的作用機制。

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收稿日期：2023-12-14

基金項目：國家自然科學基金（編號：32202261）；江蘇省自然科學基金（編號：BK20210156）。

作者簡介：張馨怡（1997—），女，陜西咸陽人，碩士研究生，從事植物病理學研究。E-mail：zhangxinyi0302@163.com。

通信作者：郭寶佃，博士，助理研究員，從事植物與病原互作研究，E-mail：guo_baodian@163.com；劉鳳權(quán)，博士，教授，從事植物細菌病害研究，E-mail：fqliu20011@sina.com。