基于氫氧化鈣為中和劑的大腸桿菌丁二酸發(fā)酵

摘要：氫氧化鈣因其價(jià)格相對(duì)低廉且與其配套的有機(jī)酸分離純化工藝成熟，常作為中和劑應(yīng)用于有機(jī)酸發(fā)酵中。但在丁二酸發(fā)酵中，因其不能提供丁二酸合成所必需的二氧化碳，存在發(fā)酵產(chǎn)量低的問(wèn)題。文章建立并優(yōu)化了以氫氧化鈣為中和劑結(jié)合二氧化碳脈沖補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。發(fā)酵初期不添加中和劑，pH值自然下降至5.7時(shí)，立即流加23%氫氧化鈣溶液使pH值升至7.5，然后停止添加中和劑，通入0.2 m3/（m3·min）二氧化碳?xì)怏w至pH值降至6.5時(shí)停止通氣使發(fā)酵液自然發(fā)酵，當(dāng)pH值下降至5.7時(shí)，再循環(huán)上述操作。使用該方法時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)量為88.47 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為96.03%，平均生產(chǎn)強(qiáng)度為2.21 g/（L·h），相較于以氫氧化鈣為中和劑不補(bǔ)入或者連續(xù)通入二氧化碳的方式，糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高了298%和95%。該方法為解決使用氫氧化鈣作中和劑發(fā)酵丁二酸產(chǎn)量低的問(wèn)題提供了新思路，也為利用現(xiàn)有有機(jī)酸分離設(shè)備大規(guī)模生產(chǎn)丁二酸打下了良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；丁二酸；氫氧化鈣；二氧化碳；中和劑

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.1 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)：1000-9973（2024）10-0009-05

Succinic Acid Fermentation by Escherichia coli Based on

Calcium Hydroxide as Neutralizing Agent

CHEN Si-yu1， SUN Rui-xue1， BAO Chen-peng1， WANG Jin-hua1，2，3，

GAO Wa1，2，3， WANG Yong-ze1，2，3*

（1.School of Biotechnology and Food， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China;

2.Key Laboratory of Fermentation Engineering， Ministry of Education， Hubei University

of Technology， Wuhan 430068， China; 3.Industrial Fermentation Collaborative

Innovation Center Co-constructed by Province and Ministry of Education，

Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： Calcium hydroxide is often used as neutralizing agent in the fermentation of organic acids due to its relatively low price and mature matched organic acid separation and purification process. However， in the fermentation of succinic acid， there is a problem of low fermentation yield due to its inability to provide the necessary carbon dioxide for succinic acid synthesis. In this paper， with calcium hydroxide as the neutralizing agent， combined with carbon dioxide pulse feed fermentation， a method for producing succinic acid is established and optimized. When no neutralizing agent is added in the initial stage of fermentation to naturally lower the pH value to 5.7， 23% calcium hydroxide solution is immediately added to raise the pH value to 7.5.Then stop adding neutralizing agent， 0.2 m3/（m3·min） carbon dioxide gas is introduced until the pH value drops to 6.5， and stop ventilation to make the fermentation broth naturally ferment. When the pH value drops to 5.7， repeat the above operation. Using this method， the fermentation yield， sugar acid conversion rate， average production intensity are 88.47 g/L， 96.03% and 2.21 g/（L·h） respectively. The sugar acid conversion rate increases by 298% and 95% respectively

compared" to using calcium hydroxide as neutralizing agent， without adding or continuously introducing carbon dioxide. This" method has provided a new approach to solve the problem of low yield of succinic acid fermentation using calcium hydroxide as neutralizing agent， and also laid a good foundation for the large-scale production of succinic acid using existing organic acid separation equipment.

Key words： Escherichia coli; succinic acid; calcium hydroxide; carbon dioxide; neutralizing agent

丁二酸（succinic acid）又被稱(chēng)為琥珀酸，是一種重要的四碳二羧酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化學(xué)等領(lǐng)域[1]。在醫(yī)藥行業(yè)中，丁二酸可用于合成維生素和抗生素等保健品[2]。而在食品加工行業(yè)中，丁二酸的應(yīng)用更廣泛，首先，由于丁二酸具有獨(dú)特的貝類(lèi)風(fēng)味，故可被制成我國(guó)食品添加劑中唯一許可使用的有機(jī)酸類(lèi)鮮味劑——丁二酸二鈉（干貝素），可用于增強(qiáng)肉制品和海鮮制品的鮮味，是醬料、方便面、奶制品和膨化食品等食品中鮮味的主要來(lái)源[3-4]，丁二酸鈉鹽還可用作強(qiáng)化劑增強(qiáng)餅干等食品的韌性[2]；其次，丁二酸在啤酒、醋、醬油等產(chǎn)品中也發(fā)揮著重要的風(fēng)味作用[5-7]，此外，丁二酸衍生物辛烯基琥珀酸酯可用作乳化增稠劑增加色拉油調(diào)味品的穩(wěn)定性[8]。

目前發(fā)酵法是丁二酸生產(chǎn)的主要方式[9]，而二氧化碳含量和發(fā)酵液pH值是影響丁二酸發(fā)酵的關(guān)鍵因素[10]，因此在發(fā)酵過(guò)程中常通過(guò)添加碳酸鹽的方法，在提供二氧化碳的同時(shí)維持發(fā)酵液pH的穩(wěn)定。碳酸鎂被普遍認(rèn)為是最能提高丁二酸產(chǎn)量的中和劑[11-12]，但是由于碳酸鎂價(jià)格昂貴且鎂離子在后續(xù)丁二酸分離工藝中難以被去除，最終使丁二酸的生產(chǎn)成本居高[13]，因此碳酸鎂不適用于丁二酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。與碳酸鎂相比，氫氧化鈣作為傳統(tǒng)的有機(jī)酸發(fā)酵中和劑，不但成本較低，而且發(fā)酵液中的鈣離子可以轉(zhuǎn)化為硫酸鈣沉淀去除，成為很多有機(jī)酸發(fā)酵工廠首選的中和劑，成熟的配套工藝大大降低了有機(jī)酸的發(fā)酵成本。

只使用氫氧化鈣作為中和劑會(huì)導(dǎo)致丁二酸發(fā)酵產(chǎn)量極低，這與用氫氧化鈣作為中和劑不能提供丁二酸合成所需的二氧化碳有關(guān)。使用碳酸鈣作為中和劑似乎能解決這個(gè)問(wèn)題，但我們又發(fā)現(xiàn)碳酸鈣堿性太弱，對(duì)發(fā)酵液pH無(wú)法實(shí)現(xiàn)很好的控制。使用氫氧化鈣作為中和劑時(shí)持續(xù)補(bǔ)入二氧化碳的方法看起來(lái)是一種較合理的解決方案，但實(shí)際發(fā)酵時(shí)卻發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中有大量沉淀生成，發(fā)酵液持續(xù)酸化，丁二酸產(chǎn)量仍然較低。

本文擬建立以氫氧化鈣為中和劑結(jié)合二氧化碳脈沖補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，將氫氧化鈣和二氧化碳交替以脈沖方式補(bǔ)入發(fā)酵液中，期望達(dá)到更好的發(fā)酵液pH控制和二氧化碳補(bǔ)充的效果，從而達(dá)到以氫氧化鈣為中和劑時(shí)也能高產(chǎn)丁二酸的目的，進(jìn)而降低丁二酸的生產(chǎn)成本，為利用現(xiàn)有成熟的有機(jī)酸發(fā)酵及分離純化設(shè)備大規(guī)模生產(chǎn)丁二酸打下了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）WS100[14]：由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2 試劑

酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、十二水磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銨、葡萄糖、丁二酸、氫氧化鈣（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸鎂：上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

一級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉18 g/L，pH自然，121 ℃滅菌15 min。

二級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，十二水硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.14 g/L，硫酸銨0.3 g/L，十二水磷酸氫二鉀0.9 g/L，pH自然，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，玉米漿干粉3 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，十二水硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.14 g/L，硫酸銨0.3 g/L，十二水磷酸氫二鉀0.9 g/L，pH自然，121 ℃滅菌15 min。

1.2 主要儀器與設(shè)備

ZWY-2102C恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司；Waters-e2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；DNP-9022電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SBA-40D型生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所；SW-CJ-2FB超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；37070發(fā)酵罐 Sartorius Stedim Biotech GmbH。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件及方法

一級(jí)種子培養(yǎng)方法：將保存在－80 ℃冰箱中的菌種在LB固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)，在平板上挑選單菌落接種至250 mL三角瓶裝液量為50 mL的LB液體培養(yǎng)基中活化菌種，40 ℃ 200 r/min培養(yǎng)10～12 h。

二級(jí)種子培養(yǎng)方法：將一級(jí)種子液以5%接種量接種至二級(jí)種子培養(yǎng)基中，40 ℃ 200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h至發(fā)酵液OD600 nm值為15左右，以此作為二級(jí)種子液。

發(fā)酵罐培養(yǎng)方法[15]：按照10%接種量將二級(jí)種子液接種到發(fā)酵罐培養(yǎng)液（裝液量4 L）中，全程恒溫40 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min。發(fā)酵培養(yǎng)基中初始添加葡萄糖80 g/L，以23%氫氧化鈣作為中和劑。發(fā)酵罐培養(yǎng)的初期階段不流加氫氧化鈣溶液，使發(fā)酵液的pH值自然下降，當(dāng)pH值下降至5.4～6.0時(shí)，立即流加23%氫氧化鈣使發(fā)酵液pH值上升至7.0～8.0，停止添加中和劑后，通入二氧化碳?xì)怏w0.1～0.6 m3/（m3·min）使pH值下降至6.3～6.7，隨后立即停止通入二氧化碳，使發(fā)酵液自然發(fā)酵，當(dāng)pH值自然下降至5.4～6.0時(shí)，再流加23%氫氧化鈣，并重復(fù)上述操作。發(fā)酵過(guò)程示意圖見(jiàn)圖1。

1.3.2 檢測(cè)方法

OD600 nm值的測(cè)定：取1 mL發(fā)酵液，使用稀鹽酸按體積比1∶1處理，再用純水稀釋至合適倍數(shù)后，用分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值，即OD600 nm值。

葡萄糖的測(cè)定：取1 mL發(fā)酵液，10 000 r/min離心2 min后取上清，用純水稀釋至合適倍數(shù)后，使用SBA-40D型生物傳感分析儀進(jìn)行測(cè)量。

有機(jī)酸含量的測(cè)定：用6%的硫酸水溶液按體積比1∶1處理發(fā)酵液，靜置數(shù)分鐘，以10 000 r/min離心10 min，用超純水稀釋后，用0.22 μm濾膜過(guò)濾備用，使用高效液相色譜儀測(cè)量發(fā)酵液中有機(jī)酸的含量。HPLC 條件：色譜柱：Xtimate Sugar-H；流動(dòng)相：5 mmol/L H2SO4溶液；流速：0.5 mL/min；柱溫：45 ℃；檢測(cè)器：PDA；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

糖酸轉(zhuǎn)化率（SA）參考張震等[16]的方法，計(jì)算公式如下：

SA（%）=ρ×Vm×100%。

式中： ρ為丁二酸濃度（g/L）；V為發(fā)酵液總體積（L）；m為總耗糖量（g）。

使用Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；使用SPSS 26進(jìn)行方差分析，Plt;0.05表示有顯著性差異，Plt;0.01表示有極顯著性差異。多重比對(duì)采用Duncan法，組間差異用字母法標(biāo)記；使用Origin 2022作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氧化碳補(bǔ)入方式的選擇

碳酸鹽可以為丁二酸生產(chǎn)提供不可或缺的二氧化碳，而氫氧化鈣不是碳酸鹽，因此需要在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)入二氧化碳。本文對(duì)比了3種二氧化碳的補(bǔ)入方式對(duì)丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響：發(fā)酵全程不補(bǔ)入；連續(xù)補(bǔ)料；以氫氧化鈣溶液結(jié)合二氧化碳?xì)怏w脈沖補(bǔ)料的方法將整個(gè)過(guò)程中pH值穩(wěn)定在6.0～8.0范圍內(nèi)：當(dāng)發(fā)酵液pH值自然下降至6.0時(shí)，流加23%氫氧化鈣溶液至pH值升至8.0，然后停止添加中和劑，通入0.1 m3/（m3·min）二氧化碳?xì)怏w使pH值降至6.7時(shí)停止通氣使發(fā)酵液自然發(fā)酵，當(dāng)pH值下降至6.0時(shí)，再循環(huán)上述操作，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，不同的二氧化碳補(bǔ)入方式對(duì)丁二酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率的影響極顯著（Plt;0.01），發(fā)酵過(guò)程中不通入二氧化碳，僅靠氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值，得到的丁二酸產(chǎn)量極低，這是因?yàn)槎《岬那绑w物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）需要固定一分子二氧化碳羧化為草酰乙酸，氫氧化鈣不能提供所需的二氧化碳，因此在不補(bǔ)入二氧化碳的情況下厭氧發(fā)酵，幾乎不生產(chǎn)丁二酸，丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率僅有12.32 g/L和24.14%。

連續(xù)補(bǔ)入二氧化碳，丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率也不高，僅為25.37 g/L和40.33%，但對(duì)比不通入二氧化碳的方式，丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別提升了106%和67%。雖然丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率有所提升，但是仍處于較低水平，這可能是由于二氧化碳連續(xù)補(bǔ)入時(shí)二氧化碳和氫氧化鈣反應(yīng)生成碳酸鈣，碳酸鈣堿性較弱，發(fā)酵液的pH值難以控制，氫氧化鈣流加量過(guò)多，鈣離子濃度過(guò)高也會(huì)影響菌體的正常生長(zhǎng)代謝。

使用氫氧化鈣結(jié)合二氧化碳脈沖補(bǔ)料發(fā)酵的效果最佳，不僅縮短了總發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)，而且丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率較高，分別為47.45 g/L和83.46%，對(duì)比不補(bǔ)入二氧化碳分別提升了285%和246%，對(duì)比連續(xù)補(bǔ)入二氧化碳分別提升了87%和107%。使用氫氧化鈣結(jié)合二氧化碳脈沖補(bǔ)料生產(chǎn)過(guò)程中有兩個(gè)重要的影響因素，一是脈沖補(bǔ)料過(guò)程中，二氧化碳?xì)怏w流量及何時(shí)停止通氣的問(wèn)題；二是脈沖補(bǔ)料過(guò)程中，何時(shí)流加氫氧化鈣及何時(shí)停止流加的問(wèn)題。本研究后續(xù)將圍繞這兩個(gè)問(wèn)題，通過(guò)調(diào)整發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)更高的丁二酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率。

2.2 二氧化碳補(bǔ)料的控制

通過(guò)調(diào)整二氧化碳補(bǔ)入流量及停止通氣時(shí)機(jī)兩個(gè)方面優(yōu)化脈沖補(bǔ)料工藝，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，通過(guò)對(duì)氣體流量及停止時(shí)機(jī)的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)二氧化碳的氣體流量對(duì)發(fā)酵有一定的影響，當(dāng)氣體流量為0.1 m3/（m3·min），停止通氣時(shí)發(fā)酵液pH值為6.3時(shí)，丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率最低，僅為39.26 g/L和72.25%。當(dāng)氣體流量為0.2 m3/（m3·min）時(shí)，丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率上升，但隨著氣體流量的上升，丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率并沒(méi)有相應(yīng)地提升，可能是由于發(fā)酵液中可利用的二氧化碳含量已達(dá)到飽和[17]。不同的脈沖補(bǔ)料停止時(shí)機(jī)得到了不同的發(fā)酵結(jié)果，當(dāng)pH值為6.5時(shí)停止通氣，丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率均最高。當(dāng)氣體流量為0.2 m3/（m3·min），pH值為6.5時(shí)停止補(bǔ)料，有最大的丁二酸產(chǎn)量（50.37 g/L）和糖酸轉(zhuǎn)化率（86.37%）。

2.3 氫氧化鈣脈沖補(bǔ)料時(shí)機(jī)及停止時(shí)機(jī)

通過(guò)調(diào)整氫氧化鈣補(bǔ)料時(shí)機(jī)及停止時(shí)機(jī)兩個(gè)方面進(jìn)一步優(yōu)化了該發(fā)酵方法，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，通過(guò)調(diào)整不同的氫氧化鈣脈沖補(bǔ)料時(shí)機(jī)及停止時(shí)機(jī)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值自然下降至5.7時(shí)再補(bǔ)入氫氧化鈣至pH值為7.5，有最大的丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，分別為53.47 g/L和92.46%。當(dāng)反饋補(bǔ)料pH值為5.4時(shí)，所得到的丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率都較低，可能是因?yàn)榉答佈a(bǔ)料pH值過(guò)低，不適宜大腸桿菌的生長(zhǎng)，從而影響了丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。

2.4 優(yōu)化條件的驗(yàn)證

根據(jù)對(duì)脈沖補(bǔ)料條件的優(yōu)化，得到優(yōu)化后的發(fā)酵條件為當(dāng)pH值自然下降至5.7時(shí)，流加23%氫氧化鈣至發(fā)酵液pH值為7.5，再通入二氧化碳（0.2 m3/（m3·min））至pH值為6.5，停止通氣后使發(fā)酵液自然發(fā)酵，當(dāng)pH值降至5.7時(shí)再重復(fù)此操作。依照此條件，對(duì)優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)酵條件為初始葡萄糖含量80 g/L，當(dāng)發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖含量低于10 g/L時(shí)再補(bǔ)加20 g/L葡萄糖。由圖2可知，發(fā)酵40 h結(jié)束時(shí)，丁二酸產(chǎn)量達(dá)到88.47 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為96.03%，副產(chǎn)物乙酸產(chǎn)量?jī)H為3.82 g/L，平均生產(chǎn)強(qiáng)度2.21 g/（L·h）。采用優(yōu)化后的脈沖補(bǔ)料方法，糖酸轉(zhuǎn)化率比優(yōu)化前提升了15.06%，相比于不補(bǔ)入或者連續(xù)通入二氧化碳的方式，轉(zhuǎn)化率分別提高了298%和95%。整個(gè)過(guò)程pH穩(wěn)定在5.7～7.5范圍內(nèi)，達(dá)到了較好的發(fā)酵液pH控制效果。

將優(yōu)化后的結(jié)果與使用不同中和劑（使用本文實(shí)驗(yàn)菌株）和文獻(xiàn)中其他控制發(fā)酵液pH和二氧化碳通入方式相比的結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，見(jiàn)表4。

由表4可知，無(wú)論是丁二酸產(chǎn)量還是糖酸轉(zhuǎn)化率，優(yōu)化后的發(fā)酵結(jié)果均最佳，僅在總發(fā)酵時(shí)間和平均生產(chǎn)強(qiáng)度上稍遜色于使用碳酸鎂時(shí)的發(fā)酵結(jié)果。然而雖然使用碳酸鎂時(shí)平均生產(chǎn)強(qiáng)度較高，但同時(shí)副產(chǎn)物乙酸含量也較高，達(dá)到4.84 g/L，而本文優(yōu)化后的方法僅積累3.82 g/L的乙酸。碳酸鎂一直被認(rèn)為是生產(chǎn)丁二酸的最佳中和劑[11-12]，但是由于其本身價(jià)格昂貴，且鎂離子對(duì)后續(xù)分離提取工藝有影響，使生產(chǎn)成本過(guò)高，因此不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。而使用氫氧化鈣作為中和劑，發(fā)酵結(jié)束后可以使用成熟的鈣鹽法[18]進(jìn)行分離提取，并且氫氧化鈣價(jià)格相對(duì)低廉，較適用于丁二酸的工業(yè)化生產(chǎn)。通過(guò)對(duì)比可以得出，優(yōu)化后的脈沖補(bǔ)料方法不僅提高了丁二酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率，而且縮短了總發(fā)酵時(shí)間，提升了平均生產(chǎn)強(qiáng)度，副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)量也有所降低。

3 結(jié)論

本文建立了以氫氧化鈣為中和劑結(jié)合二氧化碳脈沖補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。相比于以氫氧化鈣為中和劑不補(bǔ)入或者連續(xù)通入二氧化碳的方式，轉(zhuǎn)化率分別提高了298%和95%。

對(duì)脈沖補(bǔ)料法進(jìn)一步優(yōu)化，優(yōu)化后的工藝將整個(gè)發(fā)酵過(guò)程pH值穩(wěn)定在5.7～7.5范圍內(nèi)，達(dá)到了較好的發(fā)酵液pH值控制效果。脈沖補(bǔ)料法優(yōu)化后的工藝為發(fā)酵初期不添加中和劑使pH值自然下降至5.7時(shí)，立即流加23%氫氧化鈣溶液至pH值升至7.5，然后停止添加中和劑，通入0.2 m3/（m3·min）二氧化碳?xì)怏w使pH值降至6.5時(shí)停止通氣使發(fā)酵液自然發(fā)酵，當(dāng)pH值下降至5.7時(shí)，流加23%氫氧化鈣并重復(fù)上述操作。使用該方法，發(fā)酵40 h時(shí)丁二酸產(chǎn)量為88.47 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為96.03%，平均生產(chǎn)強(qiáng)度為2.21 g/（L·h），乙酸產(chǎn)量?jī)H為3.82 g/L，優(yōu)化后的脈沖補(bǔ)料方法得到的丁二酸糖酸轉(zhuǎn)化率比優(yōu)化前提升了15.06%。

使用優(yōu)化后的工藝發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，對(duì)比使用其他方式，具有丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率高、總生產(chǎn)強(qiáng)度大、副產(chǎn)物乙酸產(chǎn)量低等優(yōu)勢(shì)。并且使用氫氧化鈣作中和劑，便于后續(xù)使用鈣鹽法分離提取丁二酸，為降低丁二酸生產(chǎn)成本、利用現(xiàn)有成熟的有機(jī)酸發(fā)酵及分離純化設(shè)備大規(guī)模生產(chǎn)丁二酸打下了良好基礎(chǔ)。

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收稿日期：2024-03-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31501677）；企業(yè)合作項(xiàng)目（2023077）

作者簡(jiǎn)介：陳思宇（1999—），女，碩士，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者：王永澤（1976—），男，副教授，博士，研究方向：微生物代謝與發(fā)酵。