微生物發(fā)酵法制備核酸酶P1及其性質(zhì)和應(yīng)用

摘要：核酸酶P1又名5′-磷酸二酯酶，是酶法制備5′-核苷酸的關(guān)鍵酶類。文章對(duì)核酸酶P1的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、發(fā)酵工藝及其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，并對(duì)其未來的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：核酸酶P1；性質(zhì)；發(fā)酵；固定化；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：TS201.25""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)：1000-9973（2024）10-0216-05

Preparation of Nuclease P1 by Microbial Fermentation Method and

Its Properties and Application

HU Yang1，2， WAN Ji-lin1， HOU Sha1*， WU Chang-zheng1， TONG Xing3

（1.Guangdong Haitian Innovation Technology Co.， Ltd.， Foshan 528000， China;

2.Tiandian （Guangdong） Biotechnology Co.， Ltd.， Foshan 528200， China;

3.Foshan Haitian Flavoring amp; Food Co.， Ltd.， Foshan 528000， China）

Abstract： Nuclease P1 is also known as 5'-phosphodiesterase. It is the key enzyme for the preparation of 5'-nucleotides by enzymatic method. In this paper， the structure， properties， fermentation technology and application of nuclease P1 in food field are summarized， and its future development direction is prospected.

Key words： nuclease P1; properties; fermentation; immobilization; application

核酸酶P1（EC3.1.30.1）又名5′-磷酸二酯酶，它是一種胞外酶，由Kuninaka等[1]首次從桔青霉中分離鑒定出來。核酸酶P1可作用于RNA和熱變性的DNA，從3′-羥基末端連續(xù)切割，水解產(chǎn)生5′-核苷酸。5′-核苷酸是一類“超級(jí)”食品助鮮劑，它能夠與氨基酸類物質(zhì)發(fā)揮協(xié)同增效作用，使食物的鮮味增加數(shù)倍；還能夠起到突出食物的主味、抑制酸味、腥味和苦味等異味的效果，在食品和調(diào)味品中廣泛應(yīng)用[2]。5′-核苷酸和核酸酶P1被報(bào)道應(yīng)用于菇類調(diào)味品、酵母抽提物和醬油等產(chǎn)品的加工中。柴洋洋等[3]利用核酸酶P1促進(jìn)茶樹菇中呈味核苷酸的釋放，制成了茶樹菇鮮味劑。徐耀文等[4]用抽提酶和核酸酶分步酶解啤酒廢酵母，制備了高核苷酸的酵母抽提物，其中呈味核苷酸（I+G）含量達(dá)到10%～12%。周尚庭等[5]在醬油后期生產(chǎn)中添加I+G型酵母抽提物，彌補(bǔ)了無(wú)添加醬油中5′-呈味核苷酸的缺失，使無(wú)添加醬油的鮮味和口感得到提升。趙悅等[6]在醬油制曲中添加核酸酶進(jìn)行輔助發(fā)酵，研究發(fā)現(xiàn)，添加大曲質(zhì)量0.3%的核酸酶能夠提高醬油發(fā)酵的原料利用率并改善醬油的風(fēng)味。核酸酶P1通常被用于酶解核酸等原料生產(chǎn)5′-核苷酸，或直接應(yīng)用于食品和調(diào)味品的深加工中，是一種重要的食品加工用酶。它可通過微生物發(fā)酵法制備，也可從植物和動(dòng)物組織中提取，但從規(guī)模化生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)性方面考慮，微生物發(fā)酵法制備核酸酶P1是目前最具優(yōu)勢(shì)的生產(chǎn)途徑。本文基于現(xiàn)有的研究對(duì)核酸酶P1的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、生產(chǎn)和應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)。

1 核酸酶P1的結(jié)構(gòu)及酶學(xué)性質(zhì)

核酸酶P1是一種含鋅金屬酶，其等電點(diǎn)為4.5，分子量約為44 000 Da，每分子酶中含有17%的糖。Kazuhiko等[7]研究了其一級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)核酸酶P1由270個(gè)氨基酸殘基組成，且含有較多的疏水性氨基酸。富含疏水性氨基酸使酶具有較優(yōu)的耐熱和抗變形性質(zhì)。Fujimoto等[8]測(cè)定其二級(jí)結(jié)構(gòu)，得到核酸酶P1的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占29%～31%，β-折疊占6%，無(wú)規(guī)則卷曲占63%。富含α-螺旋結(jié)構(gòu)使核酸酶P1在蛋白變性劑存在的條件下仍能保持穩(wěn)定。一些學(xué)者通過X射線衍射技術(shù)研究得到核酸酶P1的活性中心含有3個(gè)鋅離子，其中單核鋅位（Zn3）是酶的催化活性中心，雙核鋅位（Zn1和Zn2）僅是酶的輔助催化位點(diǎn)，起到維持結(jié)構(gòu)功能的作用[9-10]。

邵帥[11]研究了核酸酶P1的部分酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)溫度為65 ℃，較一般的酶蛋白更高；最適反應(yīng)pH值為6.0，且在pH值5.5～7.5時(shí)酶活力較高；同時(shí)還研究了金屬離子對(duì)核酸酶P1水解酵母RNA的影響，研究表明，在10-6～10-3 mol/L的濃度下，Zn2+和Mn2+對(duì)反應(yīng)有顯著的促進(jìn)作用，低濃度的Fe2+也表現(xiàn)出激活作用；而Fe3+、Pb2+和Cu2+ 3種離子隨著濃度的增加均表現(xiàn)出抑制作用增強(qiáng)。除這些常見的酶學(xué)性質(zhì)外，筆者基于擴(kuò)大核酸酶應(yīng)用范圍考慮，篩選出了耐鹽、耐酒精的核酸酶P1，其經(jīng)5%～22%的NaCl和10%～30%的酒精處理后仍能保留85%以上的相對(duì)酶活，此為文獻(xiàn)和專利中首次報(bào)道，詳細(xì)的耐鹽和耐酒精特性見圖1[12]。

Zn2+是核酸酶P1的活性中心金屬離子，對(duì)于維持核酸酶P1的結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用。研究表明，核酸酶P1的Zn2位離子可被CoCl2的Co（Ⅱ）取代，這會(huì)對(duì)核酸酶P1的催化活性產(chǎn)生影響[13]。Rokugawa等[14]研究鋅在核酸酶P1中發(fā)揮的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)去除酶中的1個(gè)鋅時(shí)，其水解RNA的活性下降了50%，熱穩(wěn)定性也急速下降。Gangadhara等[15]研究了變性劑尿素和鹽酸胍對(duì)核酸酶P1酶活力的影響，結(jié)果表明，在0.05 mol/L鹽酸胍或1 mol/L尿素存在的條件下，核酸酶P1的酶活力分別提升了3倍和3.9倍，并且在金屬離子Cu2+和Co2+存在的條件下，尿素和鹽酸胍仍能不同程度地增強(qiáng)核酸酶P1的活力。

2 核酸酶P1的發(fā)酵菌種及其選育

2.1 核酸酶P1的發(fā)酵菌種

目前報(bào)道的用于發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶P1的天然菌種主要是桔青霉，其也是GB 2760—2024中規(guī)定的用于生產(chǎn)核酸酶的微生物來源。Okado等[16]通過體內(nèi)和體外的標(biāo)準(zhǔn)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估了桔青霉來源的核酸酶P1在食品中使用是安全的。另外，也有一些通過基因工程構(gòu)建使核酸酶P1在大腸桿菌、黑曲霉和酵母等中表達(dá)和發(fā)酵的研究。陳筱儀等[17]以黑曲霉Bdel4為宿主菌，通過將目的基因的拷貝數(shù)增加至9個(gè)，提高了核酸酶的表達(dá)水平，構(gòu)建出一株適合工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的菌株。王亞楠[18]構(gòu)建了核酸酶的表達(dá)載體，將其首次成功在大腸桿菌中表達(dá)，獲得的重組核酸酶具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性和高比活力；同時(shí)以畢赤酵母為表達(dá)載體，也獲得了能夠高效表達(dá)重組核酸酶的菌株。

2.2 核酸酶P1發(fā)酵菌種的選育

為獲得產(chǎn)酶量高、性狀和穩(wěn)定性好的工業(yè)菌種，發(fā)酵行業(yè)中通常會(huì)采用誘變的方式對(duì)生產(chǎn)菌種進(jìn)行選育。誘變育種是通過采用紫外線、微波、X射線等物理方式或氯化鋰、烷化劑、亞硝酸等化學(xué)誘變劑來改變微生物的遺傳物質(zhì)，再結(jié)合高效的篩選方法從大量的突變菌種中選出目標(biāo)菌種。

缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、產(chǎn)酶水平高的工業(yè)菌種一直是限制國(guó)內(nèi)核酸酶生產(chǎn)企業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素，國(guó)內(nèi)的學(xué)者和企業(yè)在選育高產(chǎn)核酸酶的菌種方面做了很多研究。田利飛等[19]通過土壤初篩，再依次采用不同劑量的紫外線、微波和LiCl進(jìn)行復(fù)合誘變，獲得一株產(chǎn)酶水平達(dá)360.7 U/mL的突變株，其產(chǎn)酶水平較原始菌株提高了183.3%。近年來，一些新興的誘變方法如常壓室溫等離子體（ARTP）和離子束誘變也常用于菌種選育。梁劍光等[20]運(yùn)用ARTP誘變，結(jié)合菌落形態(tài)變化、發(fā)酵初篩和復(fù)篩，篩選獲得了3株高產(chǎn)酶菌株，其中CK-3-9的產(chǎn)酶活力達(dá)到1 232 U/mL，經(jīng)中試生產(chǎn)驗(yàn)證達(dá)到工業(yè)化的要求。李兆飛等[21]先對(duì)氯化鋰和離子束的最佳誘變條件進(jìn)行探索，確定氯化鋰誘變濃度為1.4%，離子束注量為10 keV、1.5×1015 ions/cm2；而后進(jìn)行復(fù)合誘變，篩選出一株高產(chǎn)、穩(wěn)定的突變株L-I-4-f，其在搖瓶中的發(fā)酵水平達(dá)到1 166 U/mL。同時(shí)，也有學(xué)者研究菌種的高效篩選方法。鄭美娟等[22]通過對(duì)甲苯胺藍(lán)濃度、RNA濃度等進(jìn)行優(yōu)化，建立了甲苯胺藍(lán)-RNA（TB-RNA）平板篩選方法，經(jīng)驗(yàn)證，核酸酶P1的酶活力與酶解圈的直徑呈正相關(guān)，可將此方法應(yīng)用于產(chǎn)核酸酶P1菌株的高效篩選。

3 核酸酶P1的發(fā)酵及分離純化工藝

3.1 核酸酶P1的發(fā)酵工藝

目前報(bào)道的核酸酶P1的發(fā)酵工藝主要有固態(tài)發(fā)酵法、液態(tài)發(fā)酵法和固定化細(xì)胞培養(yǎng)法。核酸酶的固態(tài)發(fā)酵主要是以麩皮等農(nóng)作物為發(fā)酵原料，具有設(shè)備投資少、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。龐宗文等[23]優(yōu)化了桔青霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)核酸酶P1的工藝，獲得的最佳條件為以麩皮為發(fā)酵基料，料水比采用1∶0.9，補(bǔ)加4%的蔗糖作為碳源，在30 ℃下培養(yǎng)72 h，此條件下發(fā)酵酶活力可達(dá)到5 783.41 U/g干基。但因固態(tài)發(fā)酵過程的控制較粗放，生產(chǎn)量難以放大，此方法在工業(yè)化生產(chǎn)中較少應(yīng)用。

液態(tài)發(fā)酵法主要有分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵3種類型，其發(fā)酵條件易于控制且發(fā)酵量大、占地面積小，因此液態(tài)發(fā)酵法是工業(yè)化生產(chǎn)核酸酶P1的主流方法。固定化細(xì)胞是利用物理吸附或截留等方法將微生物細(xì)胞固定在合適的載體上進(jìn)行重復(fù)使用，進(jìn)一步提高發(fā)酵性能和降低生產(chǎn)成本，一些學(xué)者嘗試以此技術(shù)改進(jìn)核酸酶P1的發(fā)酵生產(chǎn)。Zhao等[24]構(gòu)建了以活性炭過濾海綿為載體的固定化發(fā)酵系統(tǒng)，并在氣升式發(fā)酵罐中對(duì)比了游離細(xì)胞發(fā)酵、重復(fù)分批固定化發(fā)酵和半連續(xù)固定化發(fā)酵下的發(fā)酵性能，結(jié)果表明，半連續(xù)固定化發(fā)酵下核酸酶P1的產(chǎn)率達(dá)到8.76 U/（mL·h），較重復(fù)分批發(fā)酵和游離細(xì)胞發(fā)酵分別提高了33.3%和80.2%。宋威等[25]以聚乙烯醇、明膠和瓊脂分別與海藻酸鈉混合制成桔青霉固定化發(fā)酵的載體，從復(fù)合載體的產(chǎn)酶性能、傳質(zhì)和機(jī)械性能、重復(fù)發(fā)酵性能等方面進(jìn)行評(píng)估，確定海藻酸鈉和聚乙烯醇以1∶2混合時(shí)，固定化細(xì)胞的性能最佳；進(jìn)行了20個(gè)周期的發(fā)酵，發(fā)酵的酶活力穩(wěn)定保持在468.3～501.4 U/mL之間。

3.2 核酸酶P1液態(tài)發(fā)酵優(yōu)化及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

采用液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)核酸酶P1是目前工業(yè)化生產(chǎn)中常用的方法，如何提高核酸酶P1的產(chǎn)量一直是其研究的重點(diǎn)。許多學(xué)者圍繞發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化、環(huán)境參數(shù)的調(diào)控和發(fā)酵動(dòng)力學(xué)開展了很多研究，以期為核酸酶P1的工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)。梁劍光等[26]優(yōu)化了核酸酶P1的發(fā)酵工藝，獲得的最佳工藝為接種種齡為24 h的種子、接種量10%、發(fā)酵溫度26 ℃、初始pH值6.50；進(jìn)一步研究了影響發(fā)酵的因素，發(fā)現(xiàn)鋅離子在接種前添加最好，其最佳添加量為0.2 g/L；幾種表面活性劑都可促進(jìn)產(chǎn)酶，添加0.2%的吐溫-80可使產(chǎn)酶量增加30%；另外，還發(fā)現(xiàn)植酸類物質(zhì)和核酸類物質(zhì)都對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有一定的抑制作用。梁新樂等[27]優(yōu)化了核酸酶P1發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源，篩選出有顯著影響的因素為葡萄糖、可溶性淀粉和玉米漿干粉；并進(jìn)一步通過響應(yīng)面分析得到三者添加量分別為30.89，42.46，11.60 g/L時(shí)發(fā)酵的水平更高，預(yù)測(cè)得到核酸酶P1的產(chǎn)量為1 687.16 U/mL，實(shí)際的產(chǎn)量為1 672.6 U/mL，表明優(yōu)化的參數(shù)具有參考價(jià)值。喻晨等[28]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了核酸酶P1的發(fā)酵培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)表明，顯著影響發(fā)酵的幾種成分為硫酸鋅、酵母粉和復(fù)合磷酸鹽，最終優(yōu)化得到的配方為葡萄糖4%、酵母粉0.681%、黃豆餅粉0.45%、玉米漿0.4%、硫酸鋅0.042%、氯化鈣0.06%、硫酸鎂0.06%、磷酸二氫鉀0.034%、磷酸氫二鉀0.034%，此配方下發(fā)酵的酶活力達(dá)563 U/mL，較原配方提高了64%。

田呂明等[29]對(duì)桔青霉發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶P1的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，建立了菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成和底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型。模型顯示桔青霉的生長(zhǎng)呈典型的S形曲線，產(chǎn)酶與菌體的生長(zhǎng)呈部分偶聯(lián)型；從底物的消耗模型來看，推薦采用分批補(bǔ)料的措施來提高發(fā)酵的水平。廖明義等[30]用30 L的發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，也建立了幾種動(dòng)力學(xué)模型；底物消耗的動(dòng)力學(xué)曲線較好地反映了發(fā)酵中氮素的消耗情況，底物氮素隨著菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶快速消耗，而后，隨著達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期及伴隨產(chǎn)酶速率下降，底物的消耗量也逐漸減小，最后趨于穩(wěn)定。對(duì)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究能夠幫助了解核酸酶P1的發(fā)酵規(guī)律，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵過程的預(yù)測(cè)和優(yōu)化，對(duì)于指導(dǎo)生產(chǎn)具有重要的意義。

3.3 核酸酶P1的分離純化

發(fā)酵液中含有一定量的雜蛋白、糖類、色素等雜質(zhì)，為了進(jìn)一步研究酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用，通常需要采用一定的分離純化手段對(duì)酶進(jìn)行純化。李明等[31]采用活性炭脫色、硫酸銨分級(jí)沉淀、脫鹽、凝膠層析等純化手段處理核酸酶P1的發(fā)酵濃縮液，得到了核酸酶P1的純組分，酶的純化倍數(shù)為8.48倍，比活力達(dá)到33 967 U/mg。田淑芳[32]先在70 ℃下加熱核酸酶P1的粗酶液10～20 min，以除去熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，然后用30%和85%的硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀除去雜蛋白，再經(jīng)脫鹽濃縮、葡聚糖凝膠過濾和離子交換層析得到了核酸酶P1的單一組分。通過多步驟、精細(xì)化地純化可得到酶的純組分，但這些分離純化的方式通常處理規(guī)模較小、產(chǎn)率較低、成本較高，限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用。徐禮鵬等[33]研究了工業(yè)化級(jí)別的超濾膜在純化5′-磷酸二酯酶中的應(yīng)用，優(yōu)化后選取截留分子量為13 ku的超濾膜，在膜運(yùn)行溫度30 ℃、膜表面流量20 LPM、膜前壓0.8 MPa的條件下處理，酶的比活力達(dá)到3 018.9 U/mg，較純化前提升了21.2倍，酶活回收率為80.8%，適合于工業(yè)化應(yīng)用。Chen等[34]采用雙水相體系純化核酸酶P1，對(duì)雙水相體系的組成和條件進(jìn)行優(yōu)化，得出在pH 5.0下使用14%的聚乙二醇3000和20%的鳥苷酸二鈉組成的雙水相混合液進(jìn)行萃取，再用超濾膜對(duì)上層液相進(jìn)行分離，即可得到純化的核酸酶P1，酶回收率達(dá)到82.4%，純化倍數(shù)達(dá)到3.59倍。雙水相萃取的操作條件溫和、易于放大和連續(xù)操作，適于大規(guī)模純化生物大分子。

4 核酸酶P1的應(yīng)用

4.1 核酸酶P1游離或固定化水解制備5′-核苷酸

5′-核苷酸在食品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域用途廣泛，酶法生產(chǎn)核苷酸具有綠色、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)，因此利用核酸酶P1酶解是目前生產(chǎn)5′-核苷酸的主要方法。許多學(xué)者針對(duì)核酸酶P1水解條件的優(yōu)化、酶的固定化等方面開展研究，以期提高核酸酶P1的水解效率和降低核苷酸的生產(chǎn)成本，從而獲得高質(zhì)量的5′-核苷酸產(chǎn)品。王端好等[35]優(yōu)化了核酸酶P1水解酵母核糖核酸生產(chǎn)5′-核苷酸的工藝條件，得出在核糖核酸濃度7.5 g/L、水解溫度54 ℃、初始pH值5下水解2 h，核糖核酸的水解率最高。采用固定化酶技術(shù)將酶固定在合適的載體上，提高酶制劑在應(yīng)用中的穩(wěn)定性并能夠使其重復(fù)利用，這也是實(shí)現(xiàn)核苷酸高效生產(chǎn)的一種方法。Huang等[36]合成了活化的多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂載體，并用刀豆蛋白A修飾，發(fā)現(xiàn)以改性的多孔載體固定化核酸酶P1，其耐酸性、熱穩(wěn)定性、重復(fù)使用性和降解效率都顯著提高；在經(jīng)過9批次重復(fù)反應(yīng)后，酶的活性僅損失7%。王天賜[37]優(yōu)化了核酸酶P1的固定化工藝，選擇AER1樹脂為固定化載體，最終確定固定化條件為酶量2.2 mL（3 644.6 U/mL）、戊二醛含量0.25%、交聯(lián)1.5 h、吸附10 h、pH值5.1，此條件下得到的固定化酶的酸堿穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性（4 ℃下）大幅提升；同時(shí)，還研究了固定化核酸酶P1用于生產(chǎn)5′-核苷酸的最佳工藝，得到在RNA濃度7%、溫度70 ℃、pH值6.5下反應(yīng)4 h，RNA的水解量最高，達(dá)到48.3 g/L。何林姣等[38]以氨基樹脂固定化核酸酶P1并設(shè)計(jì)了核苷酸水解的柱連續(xù)反應(yīng)器，在酶和載體的質(zhì)量比為3∶20、酶濃度為0.8 g/L、酶液pH值為6.0的條件下固定10 h，獲得了耐酸性、耐熱性提升的固定化核酸酶P1；另外，還提供了一種工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)5′-核苷酸的方法，使用柱連續(xù)反應(yīng)器，設(shè)定反應(yīng)溫度為60 ℃、進(jìn)料流量為0.75 mL/min，實(shí)現(xiàn)了累計(jì)120 h產(chǎn)物核苷酸的濃度在30 g/L以上。

4.2 核酸酶P1在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

核酸酶P1能夠特異性地水解RNA和熱變性的DNA產(chǎn)生5′-核苷酸，在食品中應(yīng)用，一方面可使酵母、食用菌等的鮮味和風(fēng)味提升，增加產(chǎn)品的價(jià)值；另一方面，水解產(chǎn)生的5′-核苷酸可添加至嬰幼兒配方食品和功能保健食品中起到特殊的營(yíng)養(yǎng)和功效作用。李順峰等[39]優(yōu)化了5′-磷酸二酯酶酶解香菇煮菇水的工藝，結(jié)果表明，香菇煮菇水經(jīng)適度酶解后，其中的5′-AMP和5′-GMP含量顯著增加，等效鮮味含量（EUC）較酶解前提升了1.59倍。安晶晶等[40]利用5′-磷酸二酯酶酶解香菇打漿料制備的香菇風(fēng)味基料中5′-IMP和5′-GMP的含量達(dá)到30.01 mg/g，較未經(jīng)酶處理的基料中的鮮味核苷酸含量提高了3倍。酵母中的核糖核酸含量達(dá)8%～10%，面包酵母和啤酒酵母可作為開發(fā)5′-核苷酸產(chǎn)品的首選，其中啤酒廢酵母作為啤酒廠的副產(chǎn)物之一，為充分利用其價(jià)值，可將啤酒廢酵母中的核糖核酸提取出來，用核酸酶P1水解制備5′-核苷酸，另外，提取后的組分還可用作飼料和培養(yǎng)微生物的氮源。

核苷酸在調(diào)節(jié)嬰幼兒的免疫功能、促進(jìn)身體生長(zhǎng)、提高記憶力和改善腸道菌群等方面起著重要的作用[41]。我國(guó)將5′-核苷酸列為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，允許5′-單磷酸胞苷、5′-單磷酸尿苷、5′-單磷酸腺苷、5′-肌苷酸二鈉、5′-鳥苷酸二鈉、5′-尿苷酸二鈉和5′-胞苷酸二鈉幾種形式的核苷酸以0.12～0.58 g/kg的使用量添加至嬰幼兒配方食品中。高麗芳等[42]通過小鼠實(shí)驗(yàn)探討了外源性5′-核苷酸的保肝作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)口給予5′-核苷酸的受試組較模型對(duì)照組小鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶活性降低、肝細(xì)胞壞死程度減輕，表明外源性5′-核苷酸對(duì)小鼠的非酒精性肝損傷具有潛在的保護(hù)作用。鮑雷等[43]研究了5′-核苷酸對(duì)酒精引起的大鼠結(jié)腸功能損傷的修復(fù)效果，結(jié)果表明，外源性5′-核苷酸能夠有效修復(fù)酒精導(dǎo)致的大鼠結(jié)腸的病理性改變，并能夠調(diào)節(jié)腸道的菌群，從而改善大鼠的結(jié)腸損傷。另外，還有一些研究報(bào)道了外源性5′-核苷酸具有增強(qiáng)免疫功能、抗感染、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化等生理功能[44]，這些研究推進(jìn)了核苷酸在保健和功能性食品中的應(yīng)用。

5 展望

目前，全球核苷酸的市場(chǎng)需求已達(dá)萬(wàn)噸級(jí)別并持續(xù)增加；呈味核苷酸在調(diào)味品領(lǐng)域的應(yīng)用也推進(jìn)了調(diào)味品向多樣、高檔、健康等方向發(fā)展。核酸酶P1能夠水解核酸產(chǎn)生具有功能特性和呈味特性的5′-核苷酸，在推進(jìn)核苷酸工業(yè)化和調(diào)味品產(chǎn)業(yè)發(fā)展中起著重要的作用。

在我國(guó)，生產(chǎn)核酸酶P1的廠家不多，因缺乏優(yōu)質(zhì)的工業(yè)化發(fā)酵菌株和對(duì)發(fā)酵機(jī)理的研究不夠深入，核酸酶P1的生產(chǎn)成本和應(yīng)用成本都較高。因此，在菌株開發(fā)方面，一方面需要進(jìn)一步研究高通量的篩選方法，從自然界豐富的微生物資源中篩選出無(wú)害、發(fā)酵性能優(yōu)越、遺傳穩(wěn)定性好的產(chǎn)核酸酶P1的菌株；另一方面，可借助基因工程技術(shù)對(duì)菌株代謝和編碼核酸酶P1的基因進(jìn)行深入研究，從分子水平上進(jìn)行改造，達(dá)到提高產(chǎn)酶水平、水解效率和水解特異性等目的。在核酸酶P1的發(fā)酵方面，進(jìn)一步的研究需要著重在產(chǎn)業(yè)化水平上，對(duì)菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行更充分的研究，掌握影響發(fā)酵的關(guān)鍵因素，使菌株生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成和產(chǎn)物的穩(wěn)定性達(dá)到平衡，從而降低核酸酶P1的生產(chǎn)和應(yīng)用成本。

調(diào)味品的開發(fā)已由基本調(diào)味料和使用味精單質(zhì)的時(shí)代向復(fù)合、天然、高度加工的調(diào)味品時(shí)代發(fā)展 [45]。目前已有一些研究將核酸酶P1應(yīng)用于菇類調(diào)味料和醬油產(chǎn)品中，但其應(yīng)用的范圍還不廣泛，關(guān)于應(yīng)用的研究還不夠深入。許多海產(chǎn)品、肉類原料中也含有豐富的核酸，可加強(qiáng)核酸酶P1在這些原料中的應(yīng)用研究，開發(fā)出具有特殊風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)健康的調(diào)味品。另外，可基于酶工程技術(shù)和生物發(fā)酵技術(shù)對(duì)核酸酶P1直接應(yīng)用于原料的水解或與醬等產(chǎn)品的發(fā)酵同步進(jìn)行水解的條件和機(jī)理進(jìn)行更充分的研究，使核酸酶P1能夠更好地發(fā)揮催化作用，提升調(diào)味品產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)。

參考文獻(xiàn)：

[1]KUNINAKA A， KIBI M， YOSHINO H， et al. Studies on 5'-phosphodiesterase in microorganisms. Part II.Properties and application of Penicillium citrinum 5'-phosphodiesterase[J].Agricultural and Biological Chemistry，1961，25（9）：693-701.

[2]陳皓，付雪蓉，鈕成拓，等.高核糖核酸酵母選育的研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品，2022，47（1）：206-210.

[3]柴洋洋，王雨萱，艾凱，等.茶樹菇呈味物質(zhì)的提取及鮮味劑的研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2020，45（3）：5-10.

[4]徐耀文，馬信亮，王丹萍.利用啤酒廢酵母制備高核酸酵母抽提物的應(yīng)用研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2013，38（7）：47-49，53.

[5]周尚庭，李沛，郭輝.谷氨酰胺酶和酵母抽提物對(duì)無(wú)添加醬油的品質(zhì)提升研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2016，41（5）：45-50.

[6]趙悅，丁婷婷，張夢(mèng)麗，等.核酸酶在醬油釀造上的應(yīng)用研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2023，48（8）：6-11.

[7]KAZUHIKO M， SUSUMU T， GABOR D， et al. Primary structure of nuclease P1 from Penicillium citrinum[J].The FEBS Journal，1991，200（3）：651-661.

[8]FUJIMOTO M， KUNINAKA A， YOSHINO H.Secondary structure of nuclease P1[J].Agricultural and Biological Chemistry，1975，39（11）：2145-2148.

[9]VOLBEBA A， LAHM A， SAKIYAMA F， et al.Crystal structure of Penicillium citrinum P1 nuclease at 2.8 A resolution[J].The EMBO Journal，1991，10（7）：1607-1618.

[10]ROMIER C， DOMINGUEZ R， LAHM A， et al. Recognition of single-stranded DNA by nuclease P1： high resolution crystal structures of complexes with substrate analogs[J].Proteins，1998，32（4）：414-424.

[11]邵帥.5′-磷酸二酯酶產(chǎn)生菌的篩選[D].濟(jì)南：齊魯工業(yè)大學(xué)，2011.

[12]胡洋，侯莎，童星，等.一株產(chǎn)核酸酶P1的橘青霉及其應(yīng)用：中國(guó)，202211270813.3[P].2023-03-21.

[13]鄭學(xué)仿，郭明，王靜云，等.核酸酶P1活性中心金屬離子與氯化鈷（Ⅱ）相互作用[J].無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19（4）：377-380.

[14]ROKUGAWA K， FUJIMOTO M， KUNINAKA A， et al. The role of zinc atoms in nuclease P1[J].Agricultural and Biological Chemistry，1980，44（8）：1987-1988.

[15]GANGADHARA B N， KUMAR P R， PRAKASH V. Enhancement of nuclease P1 activity in low concentration of denaturants[J].Enzyme and Microbial Technology，2008，43（4-5）：336-342.

[16]OKADO N， HASEGAWA K， MIZUHASHI F， et al. Safety evaluation of nuclease P1 from Penicillium citrinum[J].Food and Chemical Toxicology，2016，88：21-31.

[17]陳筱儀，王斌，潘力.18S rDNA介導(dǎo)的桔青霉核酸酶P1表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)分析[J].現(xiàn)代食品科技，2019，35（6）：145-153.

[18]王亞楠.核酸酶P1在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá)、純化及活性分析[D].咸陽(yáng)：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

[19]田利飛，涂璇，龔大春，等.高產(chǎn)核酸酶菌株的分離、篩選與誘變育種[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（15）：158-162.

[20]梁劍光，顧秋憶，秦修東，等.利用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變選育高產(chǎn)核酸酶P1菌株[J].食品工業(yè)科技，2015，36（21）：183-186.

[21]李兆飛，姚鵑，余華順，等.氯化鋰-離子束復(fù)合誘變核酸酶P1高產(chǎn)菌株研究[J].食品科技，2013，38（12）：2-4.

[22]鄭美娟，郭金玲，田毅紅，等.桔青霉產(chǎn)核酸酶P1菌種高效選育方法研究[J].化學(xué)與生物工程，2018，35（2）：33-37.

[23]龐宗文，李才，丁猛，等.桔青霉高產(chǎn)核酸酶P1的固態(tài)發(fā)酵條件研究[J].現(xiàn)代食品科技，2012，28（7）：806-809.

[24]ZHAO N， REN H F， LI Z J， et al. Enhancement of nuclease P1 production by Penicillium citrinum YL104 immobilized on activated carbon filter sponge[J].Applied Microbiology amp; Biotechnology，2015，99（3）：1145-1153.

[25]宋威，張芹，李歡慶，等.復(fù)合載體固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶P1的對(duì)比研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，29（3）：51-54.

[26]梁劍光，黃鵬，徐正軍.桔青霉發(fā)酵法生產(chǎn)核酸酶P1工藝條件及影響因素研究[J].中國(guó)釀造，2007（11）：27-30.

[27]梁新樂，黃瑩瑩，張虹，等.響應(yīng)面法優(yōu)化桔青霉F-5-5核酸酶P1發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，25（1）：57-61.

[28]喻晨，張亞雄，趙劼，等.響應(yīng)面法優(yōu)化桔青霉產(chǎn)核酸酶P1培養(yǎng)基[J].食品科學(xué)，2011，32（17）：283-286.

[29]田呂明，葉煒，趙劫，等.桔青霉搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶P1的動(dòng)力學(xué)研究[J].工業(yè)微生物，2012，42（2）：38-42.

[30]廖明義，陳雯莉.桔青霉發(fā)酵制備核酸酶P1的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（3）：180-182.

[31]李明，余華順，喻晨，等.桔青霉產(chǎn)核酸酶P1酶分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)[J].食品工業(yè)科技，2021，42（7）：90-94.

[32]田淑芳.核酸酶P1的分離純化及作為工具酶的研究[D].武漢：武漢科技大學(xué)，2020.

[33]徐禮鵬，吳正奇，萬(wàn)端極.超濾膜純化麥芽根中5′-磷酸二酯酶的工藝研究[J].食品科技，2013，38（5）：241-243.

[34]CHEN X C， HUANG X Q， TANG Y W， et al. Efficient purification of nuclease P1 from Penicillium citrinum using polyethylene glycol/disodium guanosine monophosphate aqueous two-phase system[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2021，193（11）：3753-3764.

[35]王端好，王震，蔣丹丹.水解核糖核酸生產(chǎn)5′-核苷酸的條件優(yōu)化及初步鑒定[J].糧食與油脂，2022，35（10）：102-105.

[36]HUANG J S， ZHUANG W， WEI C， et al. Concanavalin A induced orientation immobilization of nuclease P1： the effect of lectin agglutination[J].Process Biochemistry，2018，64：160-169.

[37]王天賜.核酸酶P1固定化研究[D].武漢：武漢科技大學(xué)，2022.

[38]何林姣，劉曉靜，黃金莎，等.氨基樹脂表面活化提高固定化核酸酶P1連續(xù)催化性能[J].化工學(xué)報(bào)，2016，67（9）：3850-3860.

[39]李順峰，劉麗娜，王安建，等.香菇煮菇水5′-磷酸二酯酶酶解增鮮技術(shù)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，50（2）：167-172.

[40]安晶晶，王成濤，張小溪，等.5′-磷酸二酯酶強(qiáng)化香菇風(fēng)味基料中鮮味成分[J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，30（3）：35-38.

[41]HAWKES J S， GIBSON R A， ROBERTON D， et al. Effect of dietary nucleotide supplementation on growth and immune function in term infants： a randomized controlled trial[J].European Journal of Clinical Nutrition，2006，60（2）：254-264.

[42]高麗芳，羅葵，崔淑香.外源性核苷酸對(duì)小鼠非酒精性肝損傷保護(hù)作用初探[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，37（3）：356-359.

[43]鮑雷，肖楊，蔡夏夏，等.5′-核苷酸對(duì)慢性酒精中毒誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸功能損傷的影響[J].食品工業(yè)科技，2017，38（14）：299-303.

[44]DING T， SONG G， LIU X R， et al. Nucleotides as optimal candidates for essential nutrients in living organisms： a review[J].Journal of Functional Foods，2021，82：1-8.

[45]沈浥.調(diào)味品中呈味核苷酸的研究進(jìn)展和我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀[J].中國(guó)調(diào)味品，2017，42（1）：177-180.

收稿日期：2024-03-17

基金項(xiàng)目：佛山市博士后科研基金項(xiàng)目（A-1906）

作者簡(jiǎn)介：胡洋（1995—），女，碩士，研究方向：食品生物發(fā)酵。

*通信作者：侯莎（1986—），女，高級(jí)工程師，博士后，研究方向：食品生物發(fā)酵。