葡萄-藏紅花間作系統(tǒng)下尖孢鐮刀菌拮抗菌Cs12對藏紅花根腐病的抑制作用

摘要［目的］以藏紅花單作和葡萄與藏紅花間作土壤根系土為研究對象，分析微生物群落組成和差異表達(dá)菌群。［方法］對湖州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園葡萄園區(qū)葡萄-藏紅花間作和藏紅花單作種植地塊進行根系土壤采集。利用RoToRHDA菌落高通量篩選工作站構(gòu)建細(xì)菌資源庫。通過對間作菌群進行分離純化以及平板對峙篩選出有益菌。通過分析藏紅花的發(fā)病率來探究有益菌對藏紅花根腐病的抑制作用。［結(jié)果］通過對間作菌群進行分離純化以及平板對峙，分離出1種尖孢鐮刀菌拮抗菌Cs12。球體接種試驗表明Cs12使病情指數(shù)降低50%，對尖孢鐮刀菌的防治效果達(dá)75%。［結(jié)論］分離出1種新發(fā)現(xiàn)的有益菌Cs12，這種菌具有較好地拮抗尖孢鐮刀菌的作用。藏紅花-葡萄間作系統(tǒng)不僅能夠解決藏紅花腐爛病問題，而且提高了土地資源利用率。這種生物防治方法對于防治其他植物的土傳病害有一定的參考價值，有助于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

關(guān)鍵詞葡萄-藏紅花間作；尖孢鐮刀菌拮抗菌Cs12；藏紅花根腐??；微生物群落多樣性

中圖分類號S435.67"文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2024）24-0108-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.025

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

InhibitionofFusariumoxysporumAntagonistCs12toSaffronRootRotUnderGrape-saffronIntercropping

ZHANGXiao-xiang，TAOYuan-yuan，QIANXiao-dong"etal

（HuzhouCentralHospital，Huzhou，Zhejiang313099）

Abstract［Objective］Toanalyzethemicrobialcommunitycompositionanddifferentiallyexpressedfloraintherootsoilofsaffronmonocroppedsoilandgrapeandsaffronintercroppingsoil.［Method］RootsoilwascollectedinthegrapegardenofHuzhouModernAgricultureDemonstrationGardenintheplotofgrapeandsaffronintercroppingandsaffronmonocropping.WeconstructedthebacterialresourcebankusingtheRoToRHDAcolonyhigh-throughputscreeningworkstation.Thebeneficialbacteriawerescreenedbyisolationandpurificationofintercroppingbacteriaandplateconfrontation.Theincidenceofsaffronwasanalyzedtoexploretheinhibitoryeffectofbeneficialbacteriaonsaffronrootrot.［Result］Throughtheisolationandpurificationofintercroppingbacteriaandplateconfrontation，weisolatedanantagonisticantibacterialagentofFusariumoxysporumCs12.TheinoculationexperimentshowedthatCs12reducedtheincidenceindexby50%，andthecontroleffectofCS12againstFusariumoxysporumwas75%.［Conclusion］WehaveisolatedanewlydiscoveredbeneficialbacteriumCs12，whichhasagoodantagonisticeffectagainstFusariumoxysporum.Thesaffron-grapeintercroppingsystemcannotonlysolvetheproblemofsaffronrot，butalsoimprovetheutilizationrateoflandresources.Thisbiologicalcontrolmethodhascertainreferencevalueforthecontrolofsoil-bornediseasesofotherplants，andishelpfulforthesustainabledevelopmentofagriculturalindustry.

KeywordsGrape-saffronintercropping;FusariumoxysporumantagonistCs12;Saffronrootrot;Microbialcommunitydiversity

隨著人們生活水平的提高以及對健康的關(guān)注，食源性藥物備受青睞。藏紅花因其具有解郁安神^［1］、抗炎抗氧化^［2］和調(diào)節(jié)免疫^［3］等功能得以廣泛使用。為了滿足日益增長的需求，提高其產(chǎn)量是一項重要的課題。然而，真菌所致的球莖腐爛病，尤其是尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum， Fo）導(dǎo)致世界各地藏紅花大面積減產(chǎn)，被全球公認(rèn)為是藏紅花增產(chǎn)的主要限制因素^［4］。一直以來，盡管化學(xué)殺菌劑，如多菌靈^［5］、五氯硝基苯殺菌劑、雙福拉坦和貝酸鹽^［6］等，成功控制球莖腐爛，提高了藏紅花產(chǎn)量，但這些農(nóng)藥殘留物對人類健康和環(huán)境保護構(gòu)成威脅。

近年來，關(guān)于使用間作控制疾病的研究越來越多。間作控制植物病害的主要方式是提高作物抗性或減少致病菌的入侵。其機制的研究主要集中在根系分泌物（糖、氨基酸、有機酸、脂肪酸和次生代謝物）或者微生物組與病原體之間的相互作用上^［7］。藏紅花在同一地塊連續(xù)單一種植往往會逐漸耗盡土壤中的某些養(yǎng)分和微生物多樣性，容易受到生物或者非生物脅迫的影響，導(dǎo)致疾病的發(fā)生^［8］。

筆者所在課題組前期開創(chuàng)性地使用藏紅花-葡萄間作的方法，大大緩解了藏紅花球莖腐爛病，提高產(chǎn)量。然而，藏紅花-葡萄間作系統(tǒng)控制藏紅花球莖腐爛病的原因尚不清楚。筆者對湖州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園葡萄園區(qū)葡萄-藏紅花間作和藏紅花單作種植地塊進行根系土壤采集，利用RoToRHDA菌落高通量篩選工作站構(gòu)建了細(xì)菌資源庫并篩選出有益菌。通過分析藏紅花的發(fā)病率來探究有益菌對藏紅花根腐病的抑制作用。藏紅花-葡萄間作系統(tǒng)不僅能夠解決藏紅花腐爛病問題，而且提高了土地資源利用率。這種生物防治方法對于整治其他植物的土傳病害有一定的參考價值，有助于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1材料與方法

1.1田間試驗和根系土壤采集

在湖州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園葡萄園區(qū)葡萄-藏紅花間作和藏紅花單作種植地塊進行根系土壤采集。間作根際土壤選取范圍為距離葡萄樹半徑50～100cm藏紅花植株。藏紅花單獨種植地塊，按“S”型選擇藏紅花植株。用無菌鏟挖出藏紅花球莖，輕輕地清除松散地附著在球莖和根系上的土壤，并收集黏附在根系上的根際土，每10株合并作為一個生物學(xué)重復(fù)，單作和間作組均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。收集樣本放在冰袋上帶回實驗室用于DNA提取、IlluminaMiseq高通量測序和微生物分離培養(yǎng)。

1.2微生物群基因組DNA提取、測序和數(shù)據(jù)處理

根據(jù)制造商的說明，使用FastDNASpin試劑盒（MPBiomedicals，U.S.）從藏紅花單一栽培和葡萄-藏紅花間作樣本中提取微生物群基因組DNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA質(zhì)量。細(xì)菌16SrRNA基因的高變區(qū)V3～V4通過ABIGeneAmp9700PCR熱循環(huán)儀（ABI，CA，USA）用簡并引物799F和1392R（包含孔和板特異性條形碼）擴增。20μLPCR反應(yīng)混合物包括4μL5×FastPfu緩沖液、2μL2.5mmol/LdNTP、0.8μL每個引物（5μmol/L）、0.4μLFastPfu聚合酶、10ng模板DNA和ddH2O。PCR擴增程序：95℃初始變性3min，95℃30s，55℃30s，27個循環(huán)，72℃延伸45s，72℃單次延伸10min。最終的PCR產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，根據(jù)MajorbioBio-PharmTechnologyCo.的標(biāo)準(zhǔn)方案，在IlluminaMiSeqPE300平臺（Illumina，SanDiego，USA）上對純化的擴增子進行測序。原始測序讀數(shù)存入NCBI序列讀取檔案（SRA）數(shù)據(jù)庫（登錄號：SRP473284）。

使用fastp（version0.19.6）軟件對雙端原始測序序列進行質(zhì)控，使用FLASH（version1.2.11）軟件進行拼接。使用UPARSE軟件（version7.1），根據(jù)97%的相似度對質(zhì)控拼接后的序列進行操作分類單元OTU（Operationaltaxonomicunit）聚類并剔除嵌合體。將所有樣本序列數(shù)抽平至42042（推薦進行序列抽平），抽平后，每個樣本的平均序列覆蓋度仍可達(dá)99.7%。利用RDPclassifier比對Silva16SrRNA基因數(shù)據(jù)庫進行OTU物種分類學(xué)注釋，置信度閾值為70%，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成。

1.3數(shù)據(jù)分析

基于OTU信息，采用mothur軟件計算Alpha多樣性sob指數(shù)；使用基于bray-curtis距離算法的主坐標(biāo)分析（PCoA分析）檢驗樣本間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性；并在屬水平上，基于tax_summary_a文件夾中的數(shù)據(jù)表統(tǒng)計樣本的物種豐度，結(jié)合Welch’st-test確定不同組間屬水平豐度顯著差異的菌群。以上所有的數(shù)據(jù)分析均在美吉生物云平臺（https：//cloud.majorbio.com）上進行。

1.4根際土壤細(xì)菌的篩選鑒定

稱取0.5g土壤加入2mL無菌水，180r/min振蕩20min，所得懸液，利用RoToRHDA菌落高通量篩選工作站（英國SINGER）進行自動點樣到96孔板上，尖孢鐮刀菌在中間，點樣結(jié)束后，用封口膜把板密封，放到37℃暗培養(yǎng)2～3d。挑取抑菌帶明顯的菌落，采用劃線法接種到改良NA培養(yǎng)基上（10g蛋白胨，4g牛肉膏，5g氯化鈉，2g海藻糖，20g瓊脂，加蒸餾水至1000mL，pH7.0～7.4），對其進行純化。挑取純化的單菌落接種至30mLNB液體培養(yǎng)基（10g蛋白胨，4g牛肉膏，5g氯化鈉，2g海藻糖，pH7.0～7.4）中重新培養(yǎng)，獲得純菌落。將純化的細(xì)菌菌株保存在-80℃的25%甘油中。使用細(xì)菌通用引物進行菌落PCR擴增分離的細(xì)菌16SrDNA基因片段。引物序列：27F（5/-GGTTTGATCCTGTCTCAGA-3/）和1492R（5/-GTTACCTTGTTACGACTT-3/）。擴增條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后在72℃下延伸5min，終止反應(yīng)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。以PCR產(chǎn)物測得序列作為靶序列，在NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫搜索同源序列，下載與形態(tài)型序列最相似的參考序列。所有序列均已提交至NCBI數(shù)據(jù)庫。用鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定待鑒定菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化分析和16SrRNA分子生物學(xué)鑒定，確定根際細(xì)菌菌株。

1.5細(xì)菌對尖孢鐮刀菌體外拮抗活性

藏紅花球莖腐爛病病原菌尖孢鐮刀菌，接種到PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯20%（煮沸30min，過濾），葡萄糖2%，瓊脂2%）上，于（26±2）℃暗環(huán)境下培養(yǎng)5～7d，用直徑6mm的滅菌打孔器制成菌塊，接到新PDA培養(yǎng)基中心處，在距圓心2cm處等距離放3個直徑6mm無菌濾紙片，吸取孢子懸浮液3μL（107～108CFU/mL）置于濾紙片上。未接種拮抗菌的平板作為陰性對照，每個處理重復(fù)3次。在（26±2）℃暗環(huán)境下培養(yǎng)對照組的真菌菌絲全部覆蓋平板后，檢測對峙培養(yǎng)結(jié)果，計算相對抑菌率。相對抑菌率=（對照菌落半徑-處理菌落半徑）/（對照菌落半徑-菌餅半徑）×100%。選擇抑制率大于85%的菌株，進行分子鑒定。

1.6Cs12對藏紅花根腐病的防治效果

配制尖孢鐮刀菌懸浮液（105～106CFU/mL）和Cs12菌液（OD600=0.4～0.6）備用。單重（25±1）g的藏紅花球莖隨機分為3組，每組42個，每組3個生物學(xué)重復(fù)。①空白對照。球莖頂部在3個不同位置分別被注射10μL無菌水。②Fo。在球莖頂部3個位置注射病原菌Fo各10μL。③Cs12+Fo。提前3d在球莖頂部3個位置注射Cs12各10μL，之后在球莖頂部3個位置注射病原菌Fo各10μL。所有球莖置于（25±2）℃黑暗放置30d后觀察并計算病情分級、病情指數(shù)和防治效果。使用ImageJ軟件統(tǒng)計病斑面積，計算發(fā)病指數(shù)。病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無病斑；1級，球莖病斑面積小于10%；2級，球莖病斑面積為10%～30%；3級，球莖病斑面積為30%～50%；4級，球莖病斑面積為50%～70%；5級，球莖病斑面積大于70%。

病情指數(shù)（DI）=［（病級株數(shù)×發(fā)病指數(shù)）/株數(shù)總和×5］×100

防治效果=（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%

2結(jié)果與分析

2.1根系土壤微生物群落多樣性對葡萄-藏紅花間作和藏紅花單作根際樣品的高通量16SrDNA測序和多樣性分析。α多樣性分析結(jié)果表明，間作中細(xì)菌和真菌的多樣性普遍高于單作（圖1）。然而，2種種植模式之間的細(xì)菌多樣性無顯著差異（圖1A，P=0.06）。Sobs指數(shù)顯示間作的OTU水平的真菌（圖1C，P=0.03）豐富度高于單作。

為了進一步分析2種種植模式的組間差異，基于Bray-Curtis進行了β多樣性分析。由圖1B和1D可知，基于OTU水平的PCoA分析表明，2種種植模式下，細(xì)菌和真菌群落存在一定差異（R2=1，Plt;0.1）。

2.2根系土壤微生物群落組成

通過比較屬水平上排名前10的根際土壤細(xì)菌的相對豐度發(fā)現(xiàn)，在葡萄-藏紅花間作中，芽孢桿菌（Bacillus）數(shù)量最多，其次是芽單孢菌（Gemmatimonas）和鞘氨醇單孢菌（Sphingomonas）（圖2A）。這3種細(xì)菌微生物屬于優(yōu)勢種群，具有較好的抗病性。葡萄-藏紅花間作的芽孢桿菌、芽單孢菌和鞘氨醇單孢菌的相對豐度分別是藏紅花單作的2.0倍、1.7倍和3.0倍左右。

此外，藏紅花單一栽培的土壤真菌群落以鐮刀菌（Fusarium）、被孢霉（Mortierella）Cornuvesica和Arthrographis為主（圖2B）。與葡萄-藏紅花間作相比，藏紅花單作使鐮刀菌、被孢霉和Arthrographis的相對豐度分別增加了7.0、9.0、3.8倍。而Cornuvesica則僅存在于藏紅花單作。這在葡萄-藏紅花間作中具有顯著較低的相對豐度。青霉作為一種廣譜抗菌微生物，在葡萄-藏紅花間作中所占比例相對較高，而在藏紅花單作中沒有發(fā)現(xiàn)。上述結(jié)果表明，與藏紅花單作中含有的致病性更強的微生物群相比，葡萄-藏紅花間作中含有豐富的具有抗病優(yōu)勢的真菌群落，對重建藏紅花根際微生物群落具有重要作用。

基于群落豐度數(shù)據(jù)，使用Welch'st檢驗方法來檢驗藏紅花單作和葡萄-藏紅花間作2組之間差異顯著性（圖3）。與群落組成分析結(jié)果類似，在屬水平上，與單作組相比，間作組中芽單孢菌（Gemmatimonas）、鞘氨醇單孢菌（Sphingomonas）、鏈霉菌（Streptomyces）和青霉菌（Penicillium）等群落的相對豐度顯著增加（Plt;0.05）。此外，間作可以顯著降低黃桿菌（Fibribacillus）和鐮刀菌（Fusarium）的相對豐度（Plt;0.05）。研究表明，鐮刀菌是藏紅花球莖腐爛的主要原因，先前的試驗結(jié)果也證實了這一點。因此，推測通過間作招募的微生物群落可能對尖孢鐮刀菌引起的藏紅花球莖腐爛有很好的預(yù)防作用。

2.3分離篩選和拮抗菌株鑒定

為了驗證間作募集的某些微生物菌群是否對尖孢鐮刀菌具有拮抗作用。首先從單作中分離了主要致病菌尖孢鐮刀菌（圖4A）。同時利用RoToRHDA菌落高通量篩選工作站（英國SINGER）分析葡萄-藏紅花間作2年優(yōu)質(zhì)球莖的根際土壤。隨后挑取抑菌帶明顯的菌落純化并進行平板對峙（圖4B）。初步的分離純化和平板對峙結(jié)果表明間作根際土壤存在致病菌尖孢鐮刀菌的拮抗菌。

經(jīng)形態(tài)學(xué)（圖4C）、生理生化分析（表1）和16SrRNA分子生物學(xué)鑒定（Cs12擴增電泳圖和堿基序列見圖4D），確定了分離根際細(xì)菌菌株為多黏類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）Cs12，保藏編號為CGMCCNo.11871。此外，用鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育分析，明確了Cs12的系統(tǒng)發(fā)育地位（圖5）。

2.4藏紅花對尖孢鐮刀菌的拮抗性

接種試驗結(jié)果表明，尖孢鐮刀菌感染可導(dǎo)致病情指數(shù)高達(dá)80%，而在尖孢鐮刀菌侵染之前施用Cs12使病情指數(shù)降低50%。Cs12對尖孢鐮刀菌的防治效果達(dá)75%，其應(yīng)用大大減輕了尖孢鐮刀菌侵染藏紅花的疾病癥狀（表2）。

3討論與結(jié)論

生物防治劑，一種化學(xué)殺蟲劑的替代品，一般為植物病原體的拮抗微生物，主要通過土壤和植物微生物組的關(guān)聯(lián)分析獲得，起到綠色可持續(xù)抗菌的作用^［9］。多樣化種植策略有利于生物防治劑的開發(fā)。多樣化種植，包括輪作、覆蓋種植和間作，可增加田間植物土壤微生物組多樣性，提高有益菌群的豐度，抑制土傳疾病，提高作物生產(chǎn)力^［10］。研究表明，玉米和花生間作通過促進根際類黃酮的分泌和慢生根瘤菌的豐度，提高玉米的氮積累和單株產(chǎn)量^［11］。核桃-茶間作改善了土壤養(yǎng)分狀況（速效氮、速效磷、速效鉀、有機質(zhì)）和蔗糖酶活性并通過積極影響土壤微生物種群來增加宿主的適應(yīng)性和生長^［12］。課題組前期開創(chuàng)性地使用藏紅花-葡萄間作的方法，大大緩解了藏紅花球莖腐爛病，提高了產(chǎn)量。然而，藏紅花-葡萄間作系統(tǒng)控制藏紅花球莖腐爛病的原因尚不清楚。筆者假設(shè)：①藏紅花-葡萄間作系統(tǒng)具有比藏紅花單一栽培系統(tǒng)更高的根際微生物群落組成和多樣性；②藏紅花-葡萄間作系統(tǒng)能夠募集影響根際土壤的有益細(xì)菌屬；③存在某些有益菌具有抵抗藏紅花土傳疾病的作用。針對這些假設(shè)，以藏紅花-葡萄間作和藏紅花單作下健康藏紅花植株的根際土壤為研究對象，使用高通量測序和分析證實了前面2個假設(shè)。研究結(jié)果表明第一個假設(shè)得到了充分驗證即藏紅花-葡萄間作系統(tǒng)具有顯著高于藏紅花單一栽培系統(tǒng)的根際微生物群落組成和多樣性。同時2種種植模式下，細(xì)菌和真菌群落存在差異。

該研究發(fā)現(xiàn)藏紅花-葡萄間作系統(tǒng)在屬水平上招募了芽孢桿菌屬、芽單孢菌屬、鞘氨醇單孢菌屬和青霉菌屬等優(yōu)勢種群，而藏紅花單作系統(tǒng)中富集的主要優(yōu)勢種群是黃桿菌屬、微桿菌屬、鐮刀菌屬、被孢霉屬、Cornuvesica、Arthrographis和菌寄生屬。前者是維持植物抗性、促進植物健康生長以及有效平衡土壤微生態(tài)的重要菌群，后者則存在加速植物致病的致病菌。組間顯著性差異物種分析結(jié)果也與之一致。這一結(jié)果支持了第二個假說，即藏紅花-葡萄間作系統(tǒng)能夠募集影響根際土壤的有益菌群。

課題組前期已從藏紅花腐爛球莖中分離出致病菌尖孢鐮刀菌?；诓丶t花-葡萄間作根際土壤微生物組，構(gòu)建了細(xì)菌資源庫。通過對間作菌群進行分離純化以及平板對峙，分離出一種尖孢鐮刀菌拮抗菌，其被形態(tài)學(xué)、生理生化分析和16SrRNA分子生物學(xué)鑒定為多黏類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）Cs12。此外，在尖孢鐮刀菌侵染之前施用Cs12使病情指數(shù)降低50%。Cs12對尖孢鐮刀菌的防治效果達(dá)75%。多黏類芽孢桿菌屬于厚壁菌門芽孢桿菌科類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），也是芽孢桿菌屬的亞型之一。這與該研究所招募的優(yōu)勢種群一致。這一發(fā)現(xiàn)進一步完善第3種假設(shè)。相信通過已經(jīng)構(gòu)建的細(xì)菌資源庫，后續(xù)能篩選到更多有益細(xì)菌。

該研究新發(fā)現(xiàn)有益菌Cs12具有較好的拮抗尖孢鐮刀菌的作用。此外，藏紅花-葡萄間作系統(tǒng)不僅能夠解決藏紅花腐爛病問題，而且提高了土地資源利用率。這種生物防治方法對于整治其他植物的土傳病害有一定的參考價值，有助于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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