叉角厲蝽3齡若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性及促生潛力分析

摘要：【目的】了解叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的組成，分析可培養(yǎng)細(xì)菌的促生長(zhǎng)特性，為叉角厲蝽腸道細(xì)菌與宿主、植物間的關(guān)系研究及有益菌株的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和研究材料?！痉椒ā坎捎脗鹘y(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)法分離、純化叉角厲蝽若蟲腸道細(xì)菌，通過(guò)細(xì)菌形態(tài)特征、染色反應(yīng)、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析對(duì)分離到的腸道細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定，測(cè)定其固氮、溶磷、產(chǎn)吲哚乙酸和產(chǎn)鐵載體能力，定性分析分離菌株的促生潛力。【結(jié)果】從叉角厲蝽若蟲腸道中分離到11株細(xì)菌，其中革蘭氏陽(yáng)性菌8株、革蘭氏陰性菌3株；細(xì)胞形態(tài)3株為短桿狀、1株為球狀、7株為桿狀。經(jīng)鑒定11株腸道細(xì)菌分屬于2門2綱3目4科4屬，優(yōu)勢(shì)門、綱、目、科、屬分別為厚壁菌門（Firmicutes，85.67%）、芽孢桿菌綱（Bacilli，85.67%）、乳桿菌目（Lactobacillales，75.80%）、腸球菌科（Enterococcaceae，75.80%）、腸球菌屬（Entero-coccus，75.80%）；在種分類水平由糞腸球菌（E.faecalis，75.80%）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，9.17%）、摩氏摩根氏菌（Morganella morganii，6.51%）、嗜線蟲沙雷氏菌（Serratia nematodiphila，4.49%）、黏質(zhì)沙雷氏菌（S.marcescens，3.30%）、蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis，0.28%）、貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis，0.27%）和高地芽孢桿菌（B.altitu-dinis，0.18%）8種組成。11株分離菌株的植物促生特性分析結(jié)果表明，2株沙雷氏菌促生潛力最大，具有固氮、溶磷、產(chǎn)吲哚乙酸和產(chǎn)鐵載體4種促生活性，其次為摩根氏菌，具有溶磷、產(chǎn)吲哚乙酸和產(chǎn)鐵載體3種促生活性。【結(jié)論】叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌種類較豐富，分離獲得的11株細(xì)菌均具有不同程度的促生長(zhǎng)特性。

關(guān)鍵詞：叉角厲蝽；可培養(yǎng)細(xì)菌；分離鑒定；細(xì)菌多樣性；植物促生特性

中圖分類號(hào)：S476.2；Q965文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）10-3033-13

Diversity and plant growth promoting potential of gut culturablebacteria in third-instar nymphs of Eocantheconafurcellata（Wolff）

ZHU Guo-yuan1，2，WU Guo-xing1，ZHANG Man1，SHI Chun-lan1，Ci-na-you-ruo1，CHEN Xiao1，NING Jing-yi1，WANG Si-jie1，GAO Xi1*

（1Plant Protection College，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China；2Yunnan Institute ofTropical Crops，Jinghong，Yunnan 666100，China）

Abstract：【Objective】To study the composition of culturable bacteria in the gut of nymphs of the Eocanthecona fur-cellata（Wolff），and analyze the growth promoting characteristics of the strains，so as to provide scientific basis and re-search materials for the study of the relationship among the gut bacteria of E.furcellata，hosts and plants，as well as the development and utilization of probiotic.【Method】The traditional bacterial isolation and culture method was used to iso-late and purify the gut bacteria of nymphs of E.furcellata.The isolated gut bacteria were classified and identified by bacte-rial morphology，staining reaction，physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis，and qualitative analysis of the growth promoting potential of the strains was conducted by determining their nitrogen fixation，phospho-rus solubilization，indoleacetic acid production and siderophoreproduction ability.【Result】A total of 11 strains of bacte-ria were isolated from the gut of nymphs of E.furcellata，the 11 strains of gut bacteria included 8 Gram-positive bacteria and 3 Gram-negative bacteria strains.The cell morphology of 3 strains was short rod-shaped，1 stain was globular，and 7strains were rod-shaped.and the 11 strains of gut bacteria bebonged to 2 phyla，2 classes，3 orders，4 families and 4 genera.The dominant phylum，class，order，family and genus were Firmicutes（85.67%），Bacilli（85.67%），Lactobacillales（75.80%），Enterococcaceae（75.80%），Enterococcus（75.80%）respectively.At the species level，E.faecalis（75.80%），Bacillus subtilis（9.17%），Morganella morganii（6.51%），Serratia nematodiphila（4.49%），S.marcescens（3.30%），B.thuringiensis（0.28%），B.velezensis（0.27%）and B.altitudinis（0.18%）were identified as abundant bacterial species.Plant promoting characterization of the 11 isolated strains showed that 2 strains of Serratia had the highest promotion potential with 4 plant growth promoting properties：nitrogen fixation，phosphorus solubilization，indoleacetic acid pro-duction and siderophoreproduction，followed by 1 strain of Morganella with 3 plant growth promoting properties：phos-phorus solubilization，indoleacetic acid production and siderophore production.【Conclusion】The culturable bacterialspecies in the gut of nymphs of E.furcellata are relatively abundant，and 11 bacterial strains isolated from the gut have different degrees of growth promoting properties.

Key words：Eocantheconafurcellata（Wolff）；culturable bacteria；isolation and identification；bacterial diversity；plant growth promoting characteristics

Foundation items：Yunnan Agricultural Basic Research Joint Special Project（202101BD070001-050，202301BD 070001-137）；Yunnan Young and Middle-aged Academic and Technical Leaders Reserve Talents Project（202205AC 160077）；Yunnan Tobacco Company Science and Technology Plan Project（2023530000241012）

0引言

【研究意義】叉角厲蝽［Eocantheconafurcellata（Wolff）］隸屬于半翅目（Hemiptera）蝽科（Pentatomi-dae）。該蟲具有捕食能力強(qiáng)、地理分布廣、繁殖力強(qiáng)、適應(yīng)性好等特點(diǎn)，是一種極具生防應(yīng)用潛力的捕食性天敵昆蟲（張曼等，2022）。昆蟲腸道微生物被認(rèn)為是昆蟲的第2套遺傳密碼（Zilber-Rosenberg and Rosenberg，2008；Possemiers et al.，2011；易春燕等，2024），腸道細(xì)菌參與宿主許多重要的生命活動(dòng)，如營(yíng)養(yǎng)代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、免疫防御等（周帆等，2020；李文紅等，2023），在與宿主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中也受宿主昆蟲食物、發(fā)育階段及性別等多種因素影響，表現(xiàn)出多樣的種群結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。細(xì)菌具有生長(zhǎng)速度快、易培養(yǎng)、抗逆性強(qiáng)等特性，除了是重要的生防資源外，還能產(chǎn)生鐵載體、吲哚乙酸（IAA）等，合成有利于植物生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)，間接或直接提高植物的質(zhì)量與產(chǎn)量（周榮翔等，2022）。叉角厲蝽和捕食性盲蝽等生活史中有部分時(shí)期或部分齡態(tài)需刺吸植物，且室內(nèi)飼養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)叉角厲蝽刺吸吊蘭屬（Chlorophytum）植物后有助于植物分蘗。然而，對(duì)于叉角厲蝽腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的組成與植物生長(zhǎng)之間的關(guān)系知之甚少。因此，弄清叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的組成結(jié)構(gòu)，分析腸道細(xì)菌的潛在促生長(zhǎng)特性，對(duì)叉角厲蝽若蟲生長(zhǎng)發(fā)育、生活習(xí)性、昆蟲內(nèi)共生菌—昆蟲—植物互作關(guān)系的研究以及菌種資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的研究已涉及少數(shù)天敵昆蟲（趙秀芝等，2011；劉寧等，2012）、經(jīng)濟(jì)昆蟲（黃伶等，2014）、腐生性昆蟲（Kim et al.，2014）、重要農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)害蟲（鄭亞強(qiáng)等，2017）、與人體健康密切相關(guān)的衛(wèi)生害蟲（黃振東等，2019）及觀賞鳴蟲（黃慧敏，2023）等多個(gè)種類。對(duì)于半翅目蝽類微生物的研究多集中于蝽次目的植食性蝽及與異翅亞目（Heteropteran）昆蟲譜系相關(guān)的昆蟲（Shan etal.，2021；Li etal.，2022）。羅立華等（2016）采用純培養(yǎng)法，結(jié)合形態(tài)學(xué)及16SrRNA序列分析鑒定了九香蟲（Aspongopuschinesis）成蟲體內(nèi)的可培養(yǎng)細(xì)菌，共分離到52株細(xì)菌，分屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomo-nas）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）4個(gè)屬；王琪等（2024）采用相同的方法從斑須蝽腸道中共分離出35株菌，歸為2門5屬10種，其中芽孢桿菌屬4種，腸球菌屬（Enterococcus）3種，乳球菌屬（Lactococcus）、沙雷氏菌屬（Serratia）和泛菌屬（Pantoea）各1種。Scopel和C?nsoli（2018）研究鑒定了新熱帶褐蝽（Euschistus heros）雌雄成蟲卵巢、受精囊、精囊及后中腸區(qū)（V4）的可培養(yǎng)共生體，變形菌門（Proteobacteria）以γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）腸桿菌科（Enterobac-teriaceae）為代表，厚壁菌門（Firmicutes）以芽孢桿菌綱（Bacilli）腸球菌科（Enterococcaceae）和葡萄球菌科（Staphylococcaceae）為代表，且所鑒定的一些種型僅與單一結(jié)構(gòu)相關(guān)，而所有與精囊相關(guān)的可培養(yǎng)細(xì)菌也與其他組織相關(guān)。方博文（2024）對(duì)點(diǎn)蜂緣蝽（Riptortuspedestris）卵、不同齡期若蟲及雌雄成蟲不同部位（觸角、頭、腸道和其他組織）的共生細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定，共鑒定出221種細(xì)菌，隸屬于4門29科66屬，在門分類水平，優(yōu)勢(shì)菌門包括變形菌門和放線菌門（Actinobacteria）。關(guān)于捕食性蝽腸道微生物的研究報(bào)道較少，僅見(jiàn)斑腹刺益蝽（Podisusmaculiven-tris）、益蝽（Picromeruslewisi）和獵蝽科（Reduviidae）個(gè)別種類（Ahsaei et al.，2020；Li etal.，2022；李金夢(mèng)等，2024）。Kuang等（2022）利用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析了不同食物飼養(yǎng)的叉角厲蝽雌成蟲中腸細(xì)菌組成和多樣性。李金夢(mèng)等（2024）從益蝽腸道共分離得到21株細(xì)菌，經(jīng)測(cè)序鑒定出6種細(xì)菌，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）。朱國(guó)淵等（2024）利用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序法研究了叉角厲蝽不同發(fā)育階段腸道細(xì)菌群落組成和多樣性，并對(duì)其潛在功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)。此外，前人研究證實(shí)，從線蟲、鱸魚和部分天敵昆蟲中分離的細(xì)菌菌株也具有不同程度的促植物生長(zhǎng)特性，如從紫莖澤蘭（Eupa-toriumadenophorum）的天敵昆蟲澤蘭實(shí)蠅（Proceci-docharesutilis）幼蟲體內(nèi)分離到的不動(dòng)桿菌屬（Aci-netobacter）和紅球菌屬（Rhodococcus）細(xì)菌具有氮素轉(zhuǎn)化的功能，可能在紫莖澤蘭蟲癭的生長(zhǎng)上起到主要作用（蘭明先等，2018）。捕食性蝽短小長(zhǎng)頸盲蝽（Macrolophus pygmaeus）、煙盲蝽（Nesidiocoris tenuis）可為植物獲取和傳播植物促生菌（如Paraburkhol-deria phytofirmans和Enterobacter sp.）（Galambos et al.，2021）。從象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne entero-lobii）2齡幼蟲中分離出的巴氏葡萄球菌（Staphy-lococcuspateuri）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）細(xì)菌具有植物促生特性（陳夢(mèng)等，2024）。【本研究切入點(diǎn)】前人已利用多種不同微生物分離培養(yǎng)方法，結(jié)合16S rDNA測(cè)序分析從昆蟲腸道中分離鑒定了大量的微生物，為腸道微生物菌群功能驗(yàn)證、因果機(jī)制解析和功能菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)（杜夢(mèng)璇等，2021；劉莎和陳從英，2023），但關(guān)于叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成多樣性及其促生長(zhǎng)特性尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)法對(duì)叉角厲蝽若蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，并通過(guò)細(xì)菌形態(tài)特征、染色反應(yīng)、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析對(duì)分離到的腸道細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定，測(cè)定其固氮、溶磷、產(chǎn)IAA和產(chǎn)鐵載體能力，定性分析分離菌株的促生潛力，以期為叉角厲蝽腸道菌與宿主、植物間的關(guān)系研究及有益菌株的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和研究材料。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試蟲源：叉角厲蝽于2018年采集自云南省玉溪市元江縣濱江大道小燕村（23°34′43″N，102°02′15″E），帶回室內(nèi)于養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)至今。飼養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃、光周期L∶D=14 h∶10 h、相對(duì)濕度（65±10）%，以吊蘭屬植物和黃粉蟲（Tenebrio moli-tor）蛹作為食料。

主要試劑和儀器：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（金牌Mix Ver.2，北京擎科生物科技股份有限公司），PBS緩沖液（pH 7.2～7.5），胰蛋白胨（安琪酵母股份有限公司），酵母浸粉（北京生物科技有限公司），蔗糖、葡萄糖、淀粉、乳糖和麥芽糖（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。體視顯微鏡（Motic，寧波舜宇儀器有限公司），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇凈集團(tuán)安泰公司），立式蒸汽滅菌鍋（DGL-50B，江蘇登冠醫(yī)療器械有限公司），分析天平（BSA2202S-CW，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），迷你混合儀（MIX-25P，杭州米歐儀器有限公司），搖床（ZQTY-70S，上海知楚儀器有限公司），超低溫冰箱（Thermo 906，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-420AB，天津市賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠）。

培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、Ashby（阿須貝氏）培養(yǎng)基、NBRIP培養(yǎng)基（解磷培養(yǎng)基）和CAS檢測(cè)培養(yǎng)基。

1.2叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌分離與鑒定

1.2.1叉角厲蝽若蟲腸道解剖挑選生長(zhǎng)發(fā)育整齊一致的叉角厲蝽3齡若蟲，單頭放入直徑為9 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，饑餓處理24h。將試蟲放在-20℃冰箱中冷凍3～5 min，待其麻痹不動(dòng)后取出剪去胸足，在超凈工作臺(tái)中用75%酒精進(jìn)行蟲體表面消毒2次，每次20 s，再用無(wú)菌水清洗3次，每次1 min，放入盛有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，置于體視顯微鏡下解剖，取出完整腸道。將腸道用無(wú)菌水清洗后放入1.5 mL離心管中，用滅菌研磨棒充分研磨，加無(wú)菌水定容至1.0 mL，用迷你混合儀振蕩混勻，備用（常呂恕等，2023；何雨薇等，2023；朱國(guó)淵等，2024）。設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)15頭叉角厲蝽3齡若蟲，共45頭。1.2.2叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌分離及形態(tài)鑒定將1.2.1中1.5 mL離心管內(nèi)混勻備用的原液按10-4、10-5、10-6和10-7梯度稀釋制備菌懸液。4個(gè)梯度各取100μL菌懸液均勻涂布于NA培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。于28℃、無(wú)光照的恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d。觀察菌落生長(zhǎng)情況，根據(jù)菌落顏色、大小、形態(tài)和質(zhì)地等形態(tài)特征初步區(qū)分、記錄和統(tǒng)計(jì)各細(xì)菌數(shù)量，挑取不同形態(tài)特征的典型菌落劃線接種到LB固體培養(yǎng)基上，直至長(zhǎng)出單菌落，反復(fù)純化3次（蘭明先等，2018），4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

挑取純化的細(xì)菌菌株單菌落，在LB固體培養(yǎng)基上劃線接種，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d后，以《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（布坎南和吉本斯，1984）和《微生物學(xué)》（沈萍和陳向東，2016）為參照，觀察、描述并記錄單菌落大小、顏色、形狀、隆起、質(zhì)地、邊緣等特征。對(duì)腸道細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)和菌體顏色，菌體藍(lán)色為革蘭氏陽(yáng)性菌，紅色為革蘭氏陰性菌。

1.2.3細(xì)菌菌株生理生化特性測(cè)定參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（沈萍等和陳向東，2018），對(duì)從叉角厲蝽若蟲腸道中分離、去重復(fù)、整合得到的細(xì)菌進(jìn)行大分子物質(zhì)水解、糖發(fā)酵、IMViC及硫化氫、酯酶檢測(cè)等生理生化特性試驗(yàn)，并記錄結(jié)果。

1.2.4細(xì)菌菌株的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離到的細(xì)菌DNA作為PCR擴(kuò)增模板，利用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增16SrDNA。PCR反應(yīng)體系50μL：1×TSE102 Taq PCR Mix 45μL，上、下游引物各2μL，DNA模板1μL。反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃10 s，56℃10 s，72℃10 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。將1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后的PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司進(jìn)行測(cè)序。

將16SrDNA序列提交至NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行BLSAT比對(duì)并下載相似性最高的序列。通過(guò)MEGA 7.0，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，確定腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的分類學(xué)地位。

1.3細(xì)菌菌株促生特性分析

對(duì)分離到的細(xì)菌菌株進(jìn)行促生特性分析，分別測(cè)定菌株固氮能力、產(chǎn)IAA能力、溶解難溶性磷酸鹽能力及產(chǎn)鐵載體能力。菌株固氮能力篩選采用Ashby培養(yǎng)基，在Ashby培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)3次，第3次仍有活性的菌株即具有固氮能力（高沙爾·卡依爾哈力等，2021）。產(chǎn)IAA能力測(cè)定參考周益帆等（2024）的Salkowski比色液顯色法，室溫避光條件下靜置30min后，若顏色變紅則表示有IAA產(chǎn)生。溶磷試驗(yàn)采用NBRIP培養(yǎng)基測(cè)試，根據(jù)能否產(chǎn)生溶磷圈以及溶磷圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值大小初步判斷菌株的溶磷能力（高沙爾·卡依爾哈力等，2021）。產(chǎn)鐵載體能力采用CAS平板檢測(cè)法，通過(guò)觀察菌株周圍是否有橙黃色暈圈來(lái)判斷是否能合成鐵載體（趙翔等，2006）。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)培養(yǎng)基上各菌株的培養(yǎng)情況，計(jì)算各菌株的相對(duì)豐度，相對(duì)豐度（%）=某種菌的菌落數(shù)/總菌落數(shù)×100。用Excel 2016和Illustrator 2021繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀

從叉角厲蝽若蟲腸道中分離、純化得到11株菌落形態(tài)各異的細(xì)菌，編號(hào)為3R1～3R11，細(xì)菌菌落形態(tài)和培養(yǎng)性狀見(jiàn)表1和圖1。革蘭氏染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株3R1～3R3為革蘭氏陰性菌，3R4～3R11為革蘭氏陽(yáng)性菌。菌株3R1～3R3細(xì)胞形態(tài)為短桿狀，3R4細(xì)胞形態(tài)為球狀，其余7株（3R5～3R11）細(xì)胞形態(tài)為桿狀（表1和圖2）。

2.2叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的生理生化特性

由表2可知，11株叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌中，8株菌（3R2、3R3、3R5～3R8、3R10和3R11）可分泌淀粉水解酶水解淀粉；5株菌（3R1～3R3、3R6和3R9）能產(chǎn)生脂肪酶水解油脂；10株菌（3R1～3R5、3R7～3R11）可產(chǎn)生明膠酶使明膠液化；葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果，3株菌（3R1～3R3）既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，5株菌（3R4、3R8～3R11）只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，3株菌（3R5～3R7）既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣；乳糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果，5株菌（3R2、3R3、3R8、3R9和3R11）既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，2株菌（3R1和3R4）只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，4株（3R5～3R7、3R10）既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣；酯酶試驗(yàn)結(jié)果，7株菌（3R1、3R3、3R5、3R6、3R8、3R10和3R11）為陽(yáng)性；甲基紅試驗(yàn)結(jié)果，7株菌（3R1～3R4、3R8～3R10）為陽(yáng)性；伏—普試驗(yàn)結(jié)果，5株菌（3R1、3R3、3R8、3R9和3R11）為陽(yáng)性；檸檬酸鹽試驗(yàn)結(jié)果，除3R2、3R4和3R8外，其余8株菌均可利用檸檬酸鹽；石蕊牛奶試驗(yàn)結(jié)果，除3R2為陰性外，其余10株菌均為陽(yáng)性；硫化氫試驗(yàn)結(jié)果，11株菌均可產(chǎn)生硫化氫；尿素試驗(yàn)結(jié)果，11株菌均為陰性（無(wú)顏色變化）；吲哚試驗(yàn)結(jié)果，11株菌均為陰性。

2.3叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

利用MEGA 7.0對(duì)叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA序列比對(duì)分析，結(jié)果（表3）顯示，11株腸道細(xì)菌分屬于2門4科4屬。其中，變形菌門有2科2屬，即耶爾森菌科（Yersiniaceae）的沙雷氏菌屬和摩根氏菌科（Morganellaceae）的摩根氏菌屬（Morganella）；厚壁菌門有2科2屬，分別是腸球菌科的腸球菌屬和芽孢桿菌科（Bacillaceae）的芽孢桿菌屬。

采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖3）顯示，同一屬的物種以較高的置信度聚類在一起。叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌共分為2大支，第1大支由厚壁菌門的芽孢桿菌屬和腸球菌屬2屬的細(xì)菌組成；第2大支由變形菌門的沙雷氏菌屬和摩根氏菌屬的細(xì)菌組成。在第1大支中，菌株3R4與糞腸球菌（E.faecalis）單獨(dú)聚為一小支（支持率99%）；菌株3R8與蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）聚在一起（支持率99%）；3R9與高地芽孢桿菌（B.altitudinis）和氣芽孢桿菌（B.aerius）聚在一起（支持率99%）；菌株3R5、3R6、3R11與芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌（B.subtilis）聚為一支，菌株3R7、3R10與貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）聚在一支，兩者互為姐妹群關(guān)系。在第2大支中，菌株3R1與沙雷氏菌屬的黏質(zhì)沙雷氏菌（S.marcescens）聚在一支，3R3與嗜線蟲沙雷氏菌（S.nematodiphila）聚在一支，兩者互為姐妹群關(guān)系，親緣關(guān)系較近；3R2與摩氏摩根氏菌（M.morga-nii）聚在一支（支持率96%）。

2.4叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌組成分析

從叉角厲蝽若蟲腸道共分離鑒定出可培養(yǎng)細(xì)菌2門2綱3目4科4屬8種。在門分類水平上，分別為厚壁菌門和變形菌門，厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度85.67%；在綱分類水平上，由芽孢桿菌綱（85.67%）和γ-變形菌綱（14.33%）組成；在目分類水平上，分別是乳桿菌目（Lactobacillales，75.80%）、腸桿菌目（Enterobacterales，14.30%）和顯核菌目（Caryophanales，9.90%），其中乳桿菌目為優(yōu)勢(shì)菌目；在科分類水平上，為腸球菌科（75.80%）、芽孢桿菌科（9.90%）、耶爾森菌科（7.79%）和摩根氏菌科（6.51%），優(yōu)勢(shì)菌科為腸球菌科；在屬分類水平上，依次為腸球菌屬（75.80%）、芽孢桿菌屬（9.90%）、沙雷氏菌屬（7.79%）和摩根氏菌屬（6.51%），腸球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬；在種分類水平上，分別為糞腸球菌（75.80%）、枯草芽孢桿菌（9.17%）、摩氏摩根氏菌（6.51%）、嗜線蟲沙雷氏菌（4.49%）、黏質(zhì)沙雷氏菌（3.30%）、蘇云金芽孢桿菌（0.28%）、貝萊斯芽孢桿菌（0.27%）和高地芽孢桿菌（0.18%），其中糞腸球菌為優(yōu)勢(shì)菌種（圖4）。

2.5叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的促生特性

由表4可知，11株可培養(yǎng)細(xì)菌中9株菌具有固氮能力，占總株數(shù)的81.82%，其中63.64%為芽孢桿菌屬，18.18%為沙雷氏菌屬，以3R6和3R8的固氮能力最明顯；5株菌具有解無(wú)機(jī)磷能力，但5株菌間溶磷能力（D/d）存在顯著差異（Plt;0.05），D/d為1.16～2.85；11株菌均具有合成鐵載體能力，其中3R1、3R4、3R6和3R7最明顯；3株菌具有產(chǎn)IAA能力，其中3R2最明顯。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，3R1和3R3均屬于沙雷氏菌屬，具有固氮、溶磷、產(chǎn)IAA和產(chǎn)鐵載體4種促生特性；3R2為摩根氏菌屬，具有溶磷、產(chǎn)IAA和產(chǎn)鐵載體3種促生特性；3R4屬于腸球菌屬，具有溶解磷酸鈣和產(chǎn)鐵載體能力；3R5、3R6和3R11，3R7和3R10，3R8和3R9均屬于芽孢桿菌屬，具有不同程度的固氮和產(chǎn)鐵載體能力。

3討論

本研究從叉角厲蝽若蟲腸道中共分離得到11株可培養(yǎng)細(xì)菌，隸屬于2門2綱3目4科4屬8種，以厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，腸球菌科為優(yōu)勢(shì)菌科，腸球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。該結(jié)果與益蝽及其他天敵昆蟲腸道細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門（屬）的研究結(jié)果相似。優(yōu)勢(shì)類群可能是昆蟲長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果，如高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論食物類型如何，叉角厲蝽雌成蟲中腸細(xì)菌均以變形菌門和厚壁菌門為主，在科分類水平上，腸桿菌科和腸球菌科是2個(gè)優(yōu)勢(shì)科（Kuang et al.，2022）。此外，厚壁菌門一些細(xì)菌可能促進(jìn)了獵物的死亡（Nishiwaki et al.，2007）；腸球菌屬可產(chǎn)生乙酸鹽，通過(guò)降低腸液的pH保護(hù)宿主，從而對(duì)捕食性蝽的捕食效率和生存適應(yīng)性產(chǎn)生影響（李金夢(mèng)等，2024）；若蟲期的腸道細(xì)菌主要參與宿主的生長(zhǎng)代謝（方博文，2024）。日本弓背蟻（Camponotusjaponi-cus）消化道中分離的22株不同菌株隸屬于厚壁菌門、放線菌門和變形菌門3大類群（朱卓琳等，2015）。菜蛾盤絨繭蜂（Cotesia vestalis）中腸微生物以變形菌門、厚壁菌門和子囊菌門（Ascomycota）為主，寄生取食人工飼料的小菜蛾（Plutellaxylostella）的菜蛾盤絨繭蜂中腸微生物以腸球菌屬為主，其次為輪枝孢屬（Verticillium）（胡娜娜，2022）。獵蝽科腸道細(xì)菌的典型菌屬為腸球菌屬，尤其在大紅犀獵蝽（Sycanusfalleni）中腸球菌幾乎占主導(dǎo)地位（Li et al.，2022）。從馬蜂（Vespa mandarinia）腸道分離獲得的61株菌中，糞腸球菌有43株，占比高達(dá)70.5%（何雨薇等，2023）。益蝽腸道6種可培養(yǎng)細(xì)菌分別隸屬于變形菌門和厚壁菌門，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為糞腸球菌（李金夢(mèng)等，2024）。

本研究結(jié)果的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門（屬）與植食性蝽有較大差異，可能與昆蟲腸道結(jié)構(gòu)、發(fā)育階段、食性、分離所用的組織部位等有關(guān)（李靜，2003；Engel and Moran，2013；Scopel and C?nsoli，2018；Luo et al.，2021；Li etal.，2022），不同類型昆蟲的腸道微生物類群具有多樣性和差異性（Douglas，2009）。如九香蟲成蟲體內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬（羅立華等，2016）；植食性中黑盲蝽（Adelphocorissuturalis）體內(nèi)以歐文氏菌屬（Erwinia）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和不動(dòng)桿菌屬為主（Xue et al.，2021）；荔枝蝽（Tessara-tomapapillosa）腸道細(xì)菌中變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，泛菌屬是優(yōu)勢(shì)菌屬（Liu et al.，2022）；多食性點(diǎn)蜂緣蝽的觸角、頭、腸道和其他組織中主要的菌屬為不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬（Brevibacterium）、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、哺乳動(dòng)物球菌屬（Mammaliicoccus）、假單胞菌屬和葡萄球菌屬等（方博文，2024）。

本研究叉角厲蝽若蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌菌株促生長(zhǎng)特性測(cè)定結(jié)果顯示，11株菌均具有合成鐵載體能力、9株菌具固氮能力、5株菌具有溶磷能力、3株菌具有產(chǎn)IAA能力。11株細(xì)菌中具促生特性的芽孢桿菌屬細(xì)菌最多（7株），但大多只具有固氮和產(chǎn)鐵載體能力，僅1株菌（3R11）具有固氮、溶磷和產(chǎn)鐵載體能力，7株芽孢桿菌均無(wú)產(chǎn)IAA能力，與前人對(duì)從植物中分離的芽孢桿菌促生特性的研究結(jié)果存在一定差異，從植物中分離得到的高IAA活性菌株大多為芽孢桿菌屬（萬(wàn)水霞等，2020），原因可能與菌株在不同宿主中的功能不同有關(guān)，分離自土壤、根際和植物葉片中的芽孢桿菌高產(chǎn)IAA主要是促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量。從野生大豆根瘤內(nèi)分離得到的高地芽孢桿菌具有解有機(jī)磷、無(wú)機(jī)磷和促生等能力，也可提升大豆葉片的光合參數(shù)（張文韜等，2022）；從煙株分離得到的內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌LYRY39-1和LYSX141可產(chǎn)IAA，對(duì)煙草種子根長(zhǎng)和總長(zhǎng)有顯著的促生效果（李穎穎等，2023）；從大豆根際土壤中分離得到的貝萊斯芽孢桿菌菌株TC-52具有固氮、產(chǎn)鐵載體和IAA能力（李坤等，2024）。本研究發(fā)現(xiàn)2株沙雷氏菌屬菌株（3R1和3R3）具有4種促生特性，與前人報(bào)道的其他昆蟲和植物中沙雷氏菌屬的促生特性結(jié)果較為一致（曹艷茹，2012；Morales-Jiménezetal.，2013；柯春亮等，2017）。此外，本研究發(fā)現(xiàn)摩根氏菌屬菌株3R2具有溶磷、產(chǎn)IAA和合成鐵載體3種促生特性，腸球菌屬3R4具有溶解磷酸鈣和合成鐵載體能力，這在其他研究中少有報(bào)道。促生菌可通過(guò)固氮、溶磷、分泌植物激素（如IAA）等促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，還可增強(qiáng)植物的抗逆性（萬(wàn)水霞等，2020）。叉角厲蝽雖然是捕食性天敵昆蟲，但在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中需刺吸植物汁液以補(bǔ)充水分和營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)需要植物提供產(chǎn)卵場(chǎng)所，這些促生細(xì)菌可能通過(guò)增強(qiáng)植物的抗逆性和促進(jìn)植株生長(zhǎng)從而提高叉角厲蝽對(duì)植物的利用能力和適應(yīng)性，具體協(xié)同機(jī)制有待進(jìn)一步探究。已有研究顯示，捕食性蝽短小長(zhǎng)頸盲蝽、煙盲蝽可為植物獲取和傳播植物促生菌（如Paraburkholderiaphytofirmans和Entero-bacter sp.）（Galambos et al.，2021），叉角厲蝽若蟲體內(nèi)分離到具有促生特性的菌株，其傳播途徑如何仍需進(jìn)一步研究。本研究對(duì)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的促生特性只進(jìn)行了初步分析，需進(jìn)一步進(jìn)行定量測(cè)定，同時(shí)設(shè)置盆栽試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

昆蟲體內(nèi)不同種類的細(xì)菌具有不同的生理功能，其分工協(xié)作，共同促進(jìn)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育。如摩根氏菌在鉤臀蟻蛉（Myrmeleon bore）捕食獵物時(shí)可能對(duì)獵物的死亡具有促進(jìn)作用（Nishiwaki et al.，2007）；在降解纖維素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物方面表現(xiàn)出催化活性（Kim etal.，2014）；能夠刺激促胸腺激素較早分泌來(lái)促進(jìn)果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育（胡坤坤，2018）。沙雷氏菌屬能為宿主提供維生素、氨基酸，幫助其降解纖維素、單萜或雙萜等物質(zhì)（Boone et al.，2013；胡霞等，2018），同時(shí)具有產(chǎn)蛋白酶活性（黃振東等，2019）。糞腸球菌具有抑菌、耐酸、耐膽鹽及溫度耐受性（胡紅偉等，2017；何雨薇等，2023），可耐受阿散酸等抗生素，可改善動(dòng)物胃腸功能，能利用多種糖醇作為碳源產(chǎn)生酸類物質(zhì)，有利于小菜蛾幼蟲中腸乳酸濃度的升高，具有降低血淋巴中海藻糖濃度的作用，對(duì)幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用（鄔向東等，2013；胡娜娜，2022）?？莶菅挎邨U菌具有抑制腸道病原菌，協(xié)調(diào)腸道菌群平衡的作用；能分泌具有較強(qiáng)活性的淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收（朱瑾和朱紅軍，2019）。蘇云金芽孢桿菌具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶4種消化酶的能力（何雨薇等，2023）。高地芽孢桿菌可顯著提高美洲鰻鱺（Anguilla rostrata）血清溶菌酶的活性，增強(qiáng)其免疫力（魏成業(yè)等，2024）。本研究分離得到的細(xì)菌是否同樣具有這些生理功能有待進(jìn)一步探究。

本研究從叉角厲蝽若蟲腸道分離的可培養(yǎng)細(xì)菌種類相對(duì)于測(cè)序結(jié)果，一些有差異的細(xì)菌并沒(méi)有從樣品中分離得到，可能與培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)條件有關(guān)，后期可根據(jù)差異菌株特性選擇一些鑒別培養(yǎng)基，以獲取更多的可培養(yǎng)細(xì)菌。

4結(jié)論

采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法從叉角厲蝽若蟲腸道中分離獲得11株細(xì)菌，歸類為2門2綱3目4科4屬8種，其中芽孢桿菌屬4種、沙雷氏菌屬2種、糞腸球菌屬1種、摩根氏菌屬1種，可培養(yǎng)細(xì)菌種類較豐富；11株細(xì)菌均具有不同程度的促生長(zhǎng)特性。

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（責(zé)任編輯麻小燕）