基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析超顯性基因在煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成中的作用機(jī)制

摘要：【目的】基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析基因超顯性效應(yīng)在煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成中的作用機(jī)制，為高產(chǎn)雜交種選育提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳跃哂猩锪侩s種優(yōu)勢(shì)的雜交種（K326×GDH88）及其雙親為材料，通過測(cè)定煙草親本與雜交種的生物量，確定雜種優(yōu)勢(shì)形成的關(guān)鍵時(shí)期，并采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析煙草煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)差異表達(dá)基因（DEGs）及其表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】移栽后45～52 d雜交種的生物量出現(xiàn)正向雜種優(yōu)勢(shì)，移栽后45～52 d的中親優(yōu)勢(shì)變化最大的階段，且雜交種基因的表現(xiàn)模型從加性中親模型轉(zhuǎn)變?yōu)檎蝻@性模型，故移栽后45 d是解析雜交種煙葉生物量形成關(guān)鍵時(shí)期。對(duì)移栽后45 d的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交種與雙親之間存在2660個(gè)DEGs，超顯性表達(dá)的DEGs有1683個(gè)，占比63.27%，可能是煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成的主要原因。在超顯性表達(dá)的DEGs中，有28個(gè)超顯性上調(diào)表達(dá)的DEGs富集在光合作用相關(guān)通路上；10個(gè)超顯性下調(diào)表達(dá)的DEGs富集在呼吸作用相關(guān)的蔗糖和淀粉代謝通路上，光合作用和呼吸作用中超顯性表達(dá)的DEGs可能是調(diào)控雜交種生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成的關(guān)鍵候選基因?！窘Y(jié)論】煙草雜交種煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成的關(guān)鍵時(shí)期是移栽后45 d。煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)的形成主要受DEGs的超顯性效應(yīng)影響；光合作用和呼吸作用相關(guān)的DEGs超顯性上調(diào)表達(dá)和超顯性下調(diào)表達(dá)可能是煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)的形成原因。

關(guān)鍵詞：煙草；煙葉生物量；雜種優(yōu)勢(shì)；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；超顯性效應(yīng)

中圖分類號(hào)：S572.035.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）10-2966-14

Mechanisms of overdominance gene in the formation of biomass heterosis in tobacco leaves based on transcriptomics analysis

TAN Yong-yan1，ZENG Shuai-bo2，LU An-bin1，TANG Hua-jiang1，YANG Hao1，PENG Li-sha1，SHEN Si1，LIU Ren-xiang1*

（1Tobacco College，Guizhou University/Key Laboratory of Tobacco quality Research of Guizhou，Guiyang，Guizhou550025，China；2Tongren Company，Guizhou Tobacco Company，Tongren，Guizhou 554300，China）

Abstract：【Objective】This study aimed to elucidate the mechanisms by which overdominance gene contributed to biomass heterosis in tobacco leaves through transcriptomic analysis，thereby providing theoretical reference for the breeding of high-yield hybrids.【Method】The study utilized a hybrid（K326×GDH88）exhibiting biomass heterosis and its parental lines as experimental materials.By measuring the biomass of the tobacco parents and the hybrid，the critical period for heterosis formation was identified.Transcriptome sequencing technology was employed to analyze differen-tially expressed genes（DEGs）associated with biomass heterosis in tobacco leaves and their expression patterns.【Result】Positive heterosis in biomass was observed in the hybrid between 45 and 52 d after transplantation.The mid-parent advan-tage was the highest between 45 and 52 d post-transplantation.During this period，the gene expression model of the hybrid shifted from an additive mid-parent model to a positive dominance model，indicating that 45 d post-transplantation was the critical period for analyzing biomass formation in hybrid tobacco leaves.Transcriptome sequencing of samples col-lected 45 d after transplantation revealed 2660 DEGs between the hybrid and its parents.Of these，1683 DEGs（63.27%）exhibited overdominant expression，which was likely the primary cause of biomass heterosis in tobacco leaves.Amongtheoverdominantly expressed DEGs，28 were up-regulated and enriched in photosynthesis-related pathways，while 10 were down-regulated and enriched in sucrose and starch metabolism pathway related to respiration.These DEGs with over-dominant expression in photosynthesis and respiration were potential key candidate genes regulating biomass heterosis in hybrid.【Conclusion】The critical period for the formation of biomass heterosis in tobacco hybrid leaves is 45 d post-transplantation.The formation of biomass heterosis is primarily influenced by the overdominance effect of DEGs.Theoverdominant up-regulation and down-regulation of related DEGs in photosynthesis and respiration may be the underlying reasons for biomass heterosis in tobacco leaves.

Key words：tobacco；tobacco leaf biomass；heterosis；transcriptomics；overdominance effect

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32060510）；Guizhou Tobacco Company Project（2022XM02）；Bijie Tobacco Company Project（2024520500240064）

0引言

【研究意義】煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國(guó)重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，其葉片生物量的大小直接決定了煙農(nóng)的種植收益。雜種優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在雜交后代的長(zhǎng)勢(shì)、適應(yīng)性、抗逆性和產(chǎn)量等性狀優(yōu)于雙親，近年來烤煙雜種優(yōu)勢(shì)利用研究成效顯著（劉仁祥等，2016），已在煙草煙堿（王國(guó)琴，2015）、K+含量（羅雯，2022）、葉片數(shù)（梁婷等，2023）、根系生物量（皮凱，2023）等性狀中開展了雜種優(yōu)勢(shì)研究，但性狀不同，其遺傳機(jī)制也不同。遺傳學(xué)家對(duì)于雜種優(yōu)勢(shì)的解釋提出了許多假說，其中顯性假說、超顯性假說和上位性假說被廣泛認(rèn)可和接受（Jones，1917；Stuber et al.，1992；曹立勇等，2003），但雜種優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)生取決于物種、性狀和遺傳背景，單一的假說無法獨(dú)立地解釋雜種優(yōu)勢(shì)形成的遺傳機(jī)制（Li etal.，2008）。因此，對(duì)具有生物量雜種優(yōu)勢(shì)的雜交組合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以期解析雜種優(yōu)勢(shì)的形成機(jī)理，對(duì)明確煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)的形成機(jī)制和提高豐產(chǎn)雜交種選配效率具有重要的研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用雜種優(yōu)勢(shì)可有效提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)，已在小麥（張愛民等，2002）、水稻（唐志明等，2021）、玉米（魏鋒等，2022）等作物上得到了廣泛的應(yīng)用。煙草葉片生物量受許多因素影響，包括栽培措施（陸星星等，2012）、光照條件（魏明月等，2017）、煙株個(gè)體發(fā)育（劉國(guó)俠等，2018）和品種（悅飛雪等，2019）等因素，其中受品種因素影響最大（尹劍藤等，2011）。尹劍藤等（2011）對(duì)10個(gè)煙草品種的田間性狀及煙葉組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)品種基因型差異是導(dǎo)致其生物量出現(xiàn)差異的主要原因。陸星星等（2012）對(duì)4個(gè)烤煙品種在耕地條件、土壤肥力和前作等不同耕作措施下的產(chǎn)量進(jìn)行差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一品種烤煙在不同耕作措施下產(chǎn)量存在明顯差異。劉國(guó)俠等（2018）對(duì)41個(gè)煙草品種產(chǎn)量與農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量與節(jié)距和葉數(shù)呈顯著正相關(guān)，而與莖圍則呈顯著負(fù)相關(guān)。悅飛雪等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，在同一鎘、鉛脅迫水平下，15個(gè)不同基因型煙草的生物量之間存在明顯差異，且在這2種脅迫下煙草生物量變化趨勢(shì)基本一致。魏明月等（2017）對(duì)遮蔭、自然光、強(qiáng)光3個(gè)光照強(qiáng)度下的盆栽煙草進(jìn)行生物量及光合特性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同光照環(huán)境對(duì)煙草生物量積累有顯著影響，高光強(qiáng)條件對(duì)煙草生物量的積累有利，而弱光下則受到抑制。曾帥波（2023）研究發(fā)現(xiàn)，煙葉生物量遺傳力高，雜種優(yōu)勢(shì)明顯，可利用雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行煙葉生物量改良。【本研究切入點(diǎn)】隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為解析雜種優(yōu)勢(shì)形成機(jī)制提供了可能（Nejat etal.，2018），且已在玉米（Wang et al.，2022）、油菜（Xiong et al.，2022）、水稻（Huang et al.，2023）等作物中開展相關(guān)研究，為雜種優(yōu)勢(shì)的形成機(jī)理解析提供了基礎(chǔ)。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，煙草雜交種煙葉生物量具有雜種優(yōu)勢(shì)，但對(duì)煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成的相關(guān)機(jī)制及基因表達(dá)模式尚不明確，也未見相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以具有生物量雜種優(yōu)勢(shì)的雜交種（K326×GDH88）及其雙親為材料，通過測(cè)定煙草親本與雜交種的生物量，確定雜種優(yōu)勢(shì)形成的關(guān)鍵時(shí)期，并采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析煙草煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)基因及其表達(dá)模式，以期解析煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成機(jī)制，為豐產(chǎn)雜交種的選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以本課題組前期篩選獲得的具有生物量雜種優(yōu)勢(shì)的雜交種（K326×GDH88）及其雙親為供試材料，由貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。RNAprep Pure Plant Kit試劑盒、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒和Talent qPCR PreMix（SYBR Green）試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。主要儀器設(shè)備：CFX96 Real-Time System（Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、冷凍離心機(jī)（Thermo-Fisher Scientific公司）、DYCP-44N電泳儀（上海新諾儀器設(shè)備有限公司）和LI-6400便攜式光合測(cè)定儀（LICOR公司）。

1.2田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2022年在安順市西秀區(qū)楊武鄉(xiāng)貴州大學(xué)煙草科研基地進(jìn)行，田間采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)3次重復(fù)，每小區(qū)種植3行（行距1.10 m、株距0.55 m），每行15株，共計(jì)45株。土壤肥力中等且一致，田間栽培管理按優(yōu)質(zhì)烤煙種植規(guī)程進(jìn)行，地塊四周設(shè)置保護(hù)行（2～3行），每行第一株和最后一株不參與數(shù)據(jù)測(cè)定。

1.3測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1生物量測(cè)定生物量采用殺青烘干方式測(cè)定：將全株葉片于105℃下殺青30min，75℃烘干至恒重，測(cè)定其干重。

1.3.2光合性狀測(cè)定于上午9：00－11：00在各小區(qū)挑選3株生長(zhǎng)整齊的健壯煙株，采集其從下往上數(shù)第7～9葉，利用LI-6400便攜式光合測(cè)定儀進(jìn)行凈光合速率測(cè)定。

葉綠素含量測(cè)定采用無水乙醇浸提法（努爾凱麥爾·木拉提等，2021），用紫外分光光度計(jì)分別在470、649和665 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算葉綠素含量（葉綠素含量=葉綠素a含量+葉綠素b含量）。

1.4轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.4.1樣品采集煙葉樣品于團(tuán)棵期（移栽后38 d）開始采集，每隔7 d取樣1次，共取4次。各小區(qū)選取3株生長(zhǎng)整齊的健壯煙株，選取從下往上數(shù)第7～9葉，利用打孔器分別取出一部分樣品混合，置于離心管中，用液氮處理后存入-80℃冰箱用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

1.4.2 RNA提取、文庫構(gòu)建及測(cè)序采用TRIzol法提取葉片組織中的RNA，并利用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)。質(zhì)檢合格的RNA樣品用于cDNA文庫構(gòu)建，并用Agilent 2100生物分析儀進(jìn)行cDNA文庫質(zhì)檢，合格后使用Illu-mina NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4.3差異表達(dá)基因篩選通過HISAT2（Version 2.1.0）將Clean reads與煙草基因組進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)檢。再通過RSEM結(jié)合基因組比對(duì)結(jié)果和注釋文件，獲取每個(gè)樣本基因/轉(zhuǎn)錄本的Read Counts，并進(jìn)行FPKM轉(zhuǎn)換，得到標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)量。然后使用DESeq2（Version 1.10.1）進(jìn)行差異表達(dá)分析，以Plt;0.05且Fold Change≥1.5或Fold Change≤0.67為條件篩選出差異表達(dá)基因（Differen-tially expressed genes，DEGs）。

1.4.4基因表達(dá)模式分類將DEGs的表達(dá)量矩陣數(shù)據(jù)導(dǎo)入STEM（http：//www.cs.cmu.edu/～jernst/stem/）中，歸一化處理后進(jìn)行聚類分析（Ernst and Bar-Joseph，2006）。根據(jù)聚類分析結(jié)果，對(duì)基因的表達(dá)模式進(jìn)行劃分。

1.4.5 GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路富集分析將DEGs導(dǎo)入GO數(shù)據(jù)庫，將DEGs分成生物學(xué)過程（Biological process）、細(xì)胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecular function）三大類，分析其在功能上的差異。利用KEGG數(shù)據(jù)庫解析DEGs參與的信號(hào)通路，并進(jìn)行分類，篩選出顯著（Plt;0.05）富集的信號(hào)通路，深入解析DEGs的生物學(xué)功能。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)選擇6個(gè)DEGs，獲得其編碼區(qū)（CDS）全長(zhǎng)，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)其擴(kuò)增引物（表1），委托北京擎科生物科技有限公司合成。以煙草LR25（GenBank登錄號(hào)：LI890）為內(nèi)參基因，利用Talent qPCR PreMix（SYBR Green）試劑盒對(duì)6個(gè)DEGs進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系20.0μL：2×qPCR PreMix 10.0μL，正、反向引物（10μmol/L）各0.6μL，65.9μmol/L cDNA模板2.0μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃5 s，退火溫度（表1）10 s，75℃15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算DEGs的相對(duì)表達(dá)量（Livak and Schmittgen，2001）。

1.6雜交種基因表達(dá)模式劃分及雜種優(yōu)勢(shì)計(jì)算

雜交種基因的表達(dá)模式按照Stupar（2008）的方法進(jìn)行劃分。用F1表示雜種一代的數(shù)值。當(dāng)F1高于高親值10%以上，說明雜交種基因超顯性表達(dá)；當(dāng)F1介于親本值的-10%～10%，說明雜交基因顯性表達(dá)；當(dāng)F1介于雙親平均值的-10%～10%，說明雜交種基因加性表達(dá)；不符合以上情況的定義為其他。

根據(jù)陳澤輝（2009）的方法計(jì)算煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)，包括中親優(yōu)勢(shì)（MPH）和超親優(yōu)勢(shì)（HPH），計(jì)算公式如下：

MPH（%）=（F1-MP）/MP×100

HPH（%）=（F1-HP）/HP×100

式中，MP表示雙親平均值；HP表示高親值。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019計(jì)算數(shù)據(jù)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)。利用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s多重比較，并利用GraphPad Prism 9.4繪制柱形圖。

2結(jié)果與分析

2.1雜交種煙葉生物量形成關(guān)鍵時(shí)期分析

由表2和表3可知，移栽后38 d雜交種（K326×GDH88）的生物量小于雙親，中親優(yōu)勢(shì)為-5%，移栽后45 d雜交種的生物量介于雙親之間，中親優(yōu)勢(shì)為-1%，這2個(gè)時(shí)期中雜交種與雙親的生物量差異不顯著（Pgt;0.05，下同），表現(xiàn)為負(fù)向生物量雜種優(yōu)勢(shì)；移栽后52 d雜交種表現(xiàn)出正向生物量雜種優(yōu)勢(shì)，中親優(yōu)勢(shì)為18%，隨后中親優(yōu)勢(shì)下降，在移栽后59 d降至4%。由圖1可知，移栽后38、45和59 d雜交種基因的表達(dá)模式為加性（中親本）模型，移栽后52 d為正向顯性模型，表明移栽后45～52 d雜交種的生物量出現(xiàn)正向雜種優(yōu)勢(shì)，移栽后45 d的中親優(yōu)勢(shì)變化最大的階段，且雜交種基因的表達(dá)模式從加性（中親本）模型轉(zhuǎn)變?yōu)檎蝻@性模型，移栽后45 d是解析雜交種煙葉生物量形成關(guān)鍵時(shí)期。因此，選取移栽后45d所取樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，深入分析雜交種煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)的形成機(jī)制。

2.2雜交種與親本間的轉(zhuǎn)錄組差異分析結(jié)果

2.2.1測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估采用Illumina NovaSeq 6000測(cè)序平臺(tái)對(duì)雜交種和親本材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果如表3所示。各樣本Clean data均達(dá)10.24 Gb以上，Q20和Q30分別在97.45%和92.63%以上，GC含量為42.93%～43.55%。將各樣品質(zhì)控后的原始數(shù)據(jù)與煙草K326參考基因組（https：//solgenomics.net/organism/Nicotiana_tabacum/genome）進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)比率為95.92%～96.82%?？梢姡瑴y(cè)序質(zhì)量均已滿足測(cè)序要求，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.2.2雜交種與親本間的DEGs分析為了解基因差異表達(dá)對(duì)生物量雜種優(yōu)勢(shì)的影響，對(duì)雜交種及雙親的基因表達(dá)情況進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示。雜交種與K326比對(duì)組（KG vs K）共有918個(gè)DEGs，其中589個(gè)上調(diào)表達(dá)，329個(gè)下調(diào)表達(dá)；雜交種與GDH88比對(duì)組（KG vs G）共有2123個(gè)DEGs，其中1412個(gè)上調(diào)表達(dá)，711個(gè)下調(diào)表達(dá)；雜交種與雙親（K326和GDH88）比對(duì)組（KG vs K and G）有868個(gè)DEGs，其中503個(gè)上調(diào)表達(dá)，365個(gè)下調(diào)表達(dá)；排除雜交種與雙親之間重復(fù)的DEGs后，共篩選到2660個(gè)DEGs，推測(cè)這些DEGs與雜交種生物量雜種優(yōu)勢(shì)的形成有關(guān)。

2.2.3 DEGs的表達(dá)模式分析結(jié)果為更深入分析雜交種與親本間的DEGs，按Rapp（2009）的方法將DEGs劃分成12種表達(dá)模式（P1～P12）。由圖3-A可知，P1和P2模式為加性表達(dá)，其余模式為非加性表達(dá)；P3～P6模式為顯性表達(dá)，其中P3～P4模式偏母本顯性表達(dá)，P5～P6模式偏父本顯性表達(dá)；P7～P12模式為超顯性表達(dá)，其中P7～P9模式為下調(diào)超顯性，P10～P12模式為上調(diào)超顯性。DEGs表達(dá)模式分析結(jié)果（圖3-B和表5）顯示，在雜交種中，加性表達(dá)的DEGs有346個(gè)，占DEGs總數(shù)的13.01%，非加性表達(dá)的DEGs有2314個(gè)，占DEGs總數(shù)的82.99%。在非加性表達(dá)的DEGs中，顯性表達(dá)的DEGs有631個(gè)，占DEGs總數(shù)23.73%；超顯性表達(dá)的DEGs有1683個(gè)，占DEGs總數(shù)的63.27%，其中超顯性下調(diào)表達(dá)的DEGs有612個(gè)，占23.01%，超顯性上調(diào)表達(dá)的DEGs有1071個(gè)，占40.26%，表明雜交種和雙親間DEGs的非加性效應(yīng)可能是導(dǎo)致生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成的主要原因，其中基因超顯性表達(dá)的影響最大。

2.2.4雜交種超顯性表達(dá)的DEGs GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果

2.2.4.1 GO功能注釋超顯性表達(dá)的DEGs GO功能注釋結(jié)果如圖4所示。1683個(gè)超顯性表達(dá)的DEGs被分成三大類，分別為分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)過程。進(jìn)一步深入分析發(fā)現(xiàn)，這些超顯性表達(dá)的DEGs在分子功能中被注釋到催化活性（Cata-lytic activity）、結(jié)合（Binding）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性（Tran-scription regulator activity）和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性（Tran-scription factor activity）等5個(gè)條目，其中，催化活性和結(jié)合的DEGs較多，分別為664和853個(gè)，其次是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性，分別為111和80個(gè)；在細(xì)胞組分中主要注釋到膜部分（Membrane part）、細(xì)胞部分（Cell part）、細(xì)胞器（Organelle）和膜（Mem-brane）等7個(gè)條目，其中膜部分和細(xì)胞部分的DEGs較多，分別為584和646個(gè)，其次是細(xì)胞器和膜，分別為345和201個(gè)；在生物學(xué)過程中主要注釋到刺激反應(yīng)（Response to stimulus）、生物調(diào)節(jié)（Biological regu-lation）、細(xì)胞過程（Cellular process）和代謝過程（Meta-bolic process）等8個(gè)條目，其中，較多的DEGs被注釋到細(xì)胞過程和代謝過程上，分別為545和599個(gè)，其次是生物調(diào)節(jié)過程和刺激反應(yīng)過程，分別為303和198個(gè)。

2.2.4.2雜交種超顯性表達(dá)的DEGs KEGG信號(hào)通路富集分析為了解這些超顯性表達(dá)的DEGs功能和代謝通路，對(duì)這些超顯性表達(dá)的DEGs進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，結(jié)果顯示，1683個(gè)超顯性表達(dá)的DEGs被富集到99個(gè)信號(hào)通路上。對(duì)富集程度排名前20條信號(hào)通路進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。前20條信號(hào)通路包括光合作用—天線蛋白（Photosynthesis-antenna proteins）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABC transporters），MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway），植物病原體相互作用（Plant-pathogen interaction），角質(zhì)、軟堿和蠟的生物合成（Cutin，suberine and wax biosyn-thesis），植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal trans-duction），倍半萜和三萜的生物合成（Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis），苯丙素的生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）和光合作用（Photo-synthesis）等。在排名前20條信號(hào)通路中，與光合直接相關(guān)的通路如光合作用—天線蛋白通路和光合作用通路分別排名第1和第10，說明雜交種光合相關(guān)基因的超顯性表達(dá)有助于煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)的形成。

2.2.5超顯性表達(dá)的DEGs在煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成中的作用為了進(jìn)一步探究超顯性表達(dá)的DEGs對(duì)生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成的影響，將超顯性表達(dá)的DEGs劃分為正向超顯性表達(dá)和負(fù)向超顯性表達(dá)，分別對(duì)其進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析。由于光合作用和呼吸作用是同化物產(chǎn)生和消耗的主要途徑，因此，后續(xù)對(duì)這2條途徑及相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行深入分析。

超顯性上調(diào)表達(dá)的DEGs KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果如圖6所示。有28個(gè)超顯性上調(diào)表達(dá)的DEGs被富集在光合作用相關(guān)的通路上（表6）。其中，光合作用—天線蛋白通路上有16個(gè)編碼LHHCB1、LHCB2和LHCB3蛋白的DEGs超顯性上調(diào)表達(dá)；光合作用通路上有12個(gè)超顯性上調(diào)表達(dá)的DEGs，其中有1個(gè)超顯性上調(diào)表達(dá)的DEGs編碼Psb蛋白（位于光系統(tǒng)Ⅱ）;有6個(gè)超顯性上調(diào)表達(dá)的DEGs編碼Psa蛋白（位于光系統(tǒng)Ⅰ）中；有3個(gè)超顯性上調(diào)表達(dá)的DEGs編碼Fd（位于光合電子傳遞）；有2個(gè)超顯性上調(diào)表達(dá)的DEGs編碼F型ATP酶（F-type ATPase）亞基b。這些DEGs超顯性上調(diào)表達(dá)使雜交種擁有更強(qiáng)的光合能力，在光能吸收和傳遞上起到重要作用，可產(chǎn)生更多的同化物，提高了雜交種的煙葉生物量。

超顯性下調(diào)表達(dá)的DEGs KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果如圖7-A所示。有10個(gè)超顯性下調(diào)表達(dá)的DEGs富集在蔗糖和淀粉代謝相關(guān)通路，其中，蔗糖分解過程中調(diào)控酶β-呋喃果糖苷酶和淀粉分解的α-淀粉酶DEGs超顯性下調(diào)表達(dá)，減少了雜交種蔗糖和淀粉的分解，降低了果糖和葡萄糖的含量（圖7-B）。蔗糖和淀粉是植物光合作用產(chǎn)物的重要存在形式，其分解產(chǎn)物是植物呼吸作用的重要底物，這些下調(diào)超顯性表達(dá)的基因使蔗糖和淀粉的分解減弱，通過減少呼吸作用的底物含量來減弱雜交種的呼吸作用，減少了雜交種同化物的消耗，使雜交種擁有更高的生物量（圖7-B）。篩選獲得調(diào)控?zé)煵萆锪侩s種優(yōu)勢(shì)的關(guān)鍵候選基因Nitab4.5_0004782g0020和Nitab4.5_0003280g0040（表7）。

2.3雜交種光合性狀分析結(jié)果

為進(jìn)一步解析光合性狀在生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成中的重要作用，對(duì)雜交種及其親本光合特性進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果（表8和表9）發(fā)現(xiàn)雜交種凈光合速率介于雙親之間，為19.94μmol/（m2·s），與K326無顯著差異，顯著高于GDH88（Plt;0.05，下同），雜種優(yōu)勢(shì)值為8.27%，表現(xiàn)為正向優(yōu)勢(shì)；葉綠素含量以雜交種（K326×GDH88）最高，達(dá)2.73μg/cm2，與K326無顯著差異，顯著高于GDH88，雜種優(yōu)勢(shì)值為6.24%，表現(xiàn)為正向優(yōu)勢(shì)，表明超顯性表達(dá)的光合相關(guān)基因可能提升了雜交種的葉綠素含量和凈光合速率，從而形成了煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)。

2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選擇6個(gè)DEGs，以LR25基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果（圖8）顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)雖有部分差異，但基本表達(dá)趨勢(shì)一致，說明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)可靠。

3討論

雜種優(yōu)勢(shì)利用作為提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要途徑之一，通過對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的利用可實(shí)現(xiàn)許多作物產(chǎn)量的提升（張愛民等，2002；唐志明等，2021；魏鋒等，2022）。煙草作為我國(guó)重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，其葉片生物量的大小直接決定煙葉產(chǎn)量和煙農(nóng)種植收益。本研究以具有煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)的雜交種K326×GDH88及其親本為材料，在移栽后不同時(shí)期對(duì)各材料生物量進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)量，最終確定移栽后45 d為生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成關(guān)鍵時(shí)期。雜種優(yōu)勢(shì)的形成原因較復(fù)雜，Huang等（2011）在水稻中驗(yàn)證了基因的顯性效應(yīng)是雜種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生的原因；Shang等（2016）在陸地棉產(chǎn)量性狀的雜種優(yōu)勢(shì)定位中發(fā)現(xiàn)，上位性是雜種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生的主要原因；Mo等（2022）從煙葉鉀離子雜種優(yōu)勢(shì)形成的研究中發(fā)現(xiàn)基因的超顯性效應(yīng)發(fā)揮主要作用。本研究對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)形成關(guān)鍵時(shí)期的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)63.27%的DEGs表現(xiàn)為超顯性表達(dá)模式，說明煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)主要受超顯性表達(dá)的基因影響，與Stuber等（1992）、孫其信等（1997）的結(jié)果一致。

對(duì)超顯性表達(dá)的DEGs進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超顯性上調(diào)表達(dá)的DEGs主要富集在光合作用—天線蛋白通路上，編碼Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3蛋白，這些蛋白收集光能并將光能傳遞到葉綠體的光合反應(yīng)中心（Hasegawa et al.，2002），編碼這類蛋白的DEGs超顯性上調(diào)表達(dá)使雜交種具有更強(qiáng)的光合能力，與Joshi等（2023）沉默Lhcb1基因?qū)е鹿夂夏芰ο陆档慕Y(jié)論基本一致。同時(shí)超顯性上調(diào)表達(dá)的DEGs還富集在光合作用通路的光系統(tǒng)Ⅱ、光系統(tǒng)Ⅰ、光合電子傳遞鏈和F型ATP酶上，編碼Psb、Psa、Fd、F型ATP酶亞基b等物質(zhì)的作用，這些基因的超顯性上調(diào)表達(dá)使雜交種在電荷分離、電荷穩(wěn)定性、光保護(hù)、脅迫抗性（Sitaramametal.，2008；Paques et al.，2013；Li et al.，2021）和ATP合成（Liu et al.，2019）等方面具有更強(qiáng)的能力，保證了光合作用高效運(yùn)行。光合相關(guān)通路上超顯性上調(diào)表達(dá)的DEGs使得雜交種具有更強(qiáng)的光合能力，可產(chǎn)生更多的同化物，為生物量雜種優(yōu)勢(shì)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

大多數(shù)植物光合產(chǎn)物的30%～60%會(huì)因?yàn)楹粑饔枚粨p耗（Cannell and Thornley，2000），故低呼吸速率與作物高產(chǎn)密切相關(guān)（Hauben etal.，2009）。在與呼吸作用相關(guān)的蔗糖與淀粉代謝通路中，調(diào)控蔗糖分解的β-呋喃果糖苷酶和淀粉分解的α-淀粉酶DEGs超顯性下調(diào)表達(dá)，使得雜交種蔗糖和淀粉的分解能力減弱。蔗糖和淀粉是植物光合作用產(chǎn)物的主要存儲(chǔ)方式，其分解產(chǎn)物果糖-6-磷酸（F6P）和葡萄糖是呼吸作用的重要底物（董文科等，2019）。雜交種蔗糖和淀粉的分解能力減弱導(dǎo)致雜交種同化物積累增加；同時(shí)，呼吸作用也因?yàn)榈孜锏臏p少而減弱，與β-呋喃果糖苷酶（Fugate etal.，2024）和α-淀粉酶（譚彪等，2024）的活性和呼吸作用呈正相關(guān)性的結(jié)論一致。這些超顯性下調(diào)表達(dá)的DEGs使得雜交種同化物的分解減弱，呼吸消耗降低，減少了同化物的消耗，使雜交種積累更高的生物量。

4結(jié)論

煙草雜交種煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)形成的關(guān)鍵時(shí)期是移栽后45 d。煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)的形成主要受DEGs的超顯性效應(yīng)影響；光合作用和呼吸作用相關(guān)的DEGs超顯性上調(diào)表達(dá)和超顯性下調(diào)表達(dá)可能是煙葉生物量雜種優(yōu)勢(shì)的形成原因。

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（責(zé)任編輯陳燕）