基于高通量測序的云南雪茄煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)及功能分析

摘要：【目的】探究云南不同產(chǎn)地及用途雪茄煙葉農(nóng)業(yè)發(fā)酵后煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，為雪茄煙葉功能微生物篩選及提高雪茄煙葉發(fā)酵品質(zhì)提供參考。【方法】以云南德宏、臨滄和普洱3個(gè)產(chǎn)地不同用途（茄衣、茄芯、茄套）的雪茄煙葉為試驗(yàn)材料，基于高通量測序技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu)，并分析預(yù)測微生物群落代謝功能。【結(jié)果】按照97%相似性進(jìn)行操作分類單元（OTU）聚類分析，共得到2393個(gè)OTUs，各個(gè)樣品OTUs數(shù)在125～442，樣品之間OTU數(shù)存在較大差異。同一產(chǎn)地不同用途煙葉樣品的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)有所差異，均表現(xiàn)為茄套煙葉高于茄衣和茄芯煙葉；同一用途不同產(chǎn)地?zé)熑~樣品比較，德宏和普洱2個(gè)產(chǎn)地?zé)熑~樣品的3個(gè)指數(shù)均高于臨滄產(chǎn)地?zé)熑~樣品，具有更豐富的微生物種類。不同產(chǎn)地?zé)熑~樣品微生物以細(xì)菌為主，優(yōu)勢菌門主要為變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）。不同用途煙葉優(yōu)勢菌屬差異明顯，3個(gè)產(chǎn)地茄衣煙葉中克雷伯桿菌屬（Klebsiella）相對豐度占比較大，臨滄和普洱茄芯煙葉中泛菌屬（Pantoea）占主導(dǎo)地位，而3個(gè)產(chǎn)地茄套煙葉優(yōu)勢菌屬種類更多元化且更豐富。KEEG和COG功能預(yù)測分析結(jié)果表明，9個(gè)煙葉樣品微生物功能代謝途徑和功能類型基本一致，但相對豐度存在較大差異。KEEG功能預(yù)測代謝通路主要有全局和概覽地圖、碳水化合物代謝、氨基酸代謝等；COG功能種類預(yù)測主要分布在未知功能、氨基酸運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄、無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝等。【結(jié)論】煙葉用途是影響云南雪茄煙葉微生物多樣性的重要因素，煙葉產(chǎn)地的影響相對較小，茄套煙葉微生物豐富度高于茄衣和茄芯煙葉。

關(guān)鍵詞：雪茄煙葉；微生物群落；多樣性；功能預(yù)測；云南

中圖分類號：S572文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）10-2957-09

Microbial community structure and function of Yunnan cigar tobacco leaves based on high-throughput sequencing

LI Meng1，XIE Yun-xiao1，WANG Kai2，HAN Jing-mei2，HE Xiao-jian3，XIAO Dong2，MALin1*，RAO Zhi3*

（1College of Tobacco Science and Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou，Henan 450001，China；2Technology Center of China Tobacco Yunnan Industrial Co.，Ltd.，Kunming，Yunnan 650231，China；3Hongyun Honghe Tobacco（Group）Co.，Ltd.，Kunming，Yunnan 650231，China）

Abstract：【Objective】To explore the microbial community structure and diversity of cigar tobacco leaves after agri-cultural fermentation in different producing areas and uses in Yunnan，which could provide reference for screening func-tional microorganisms of cigar tobacco leaves and improving the fermentation quality of cigar tobacco leaves.【Method】The microbial community structure was analyzed based on high-throughput sequencing technology，and the metabolic functions of the microbial community were analyzed and predicted using cigar tobacco leaves with different uses（cigar wrapper，filler and binder leaves）from 3 origins，namely Dehong，Lincang and Pu’er in Yunnan，as the test materials.【Result】Operation taxonomic unit（OTU）cluster analysis was performed according to 97%similarity，and a total of 2393 OTUs were obtained.The number of OTUs in each sample ranged from 125 to 442，and there was a large difference between samples.The Chao1 index，ACE index and Shannon index of tobacco leaf samples of different uses from the same origin were different，all showed bindergt;wrapper and filler leaves.Comparing tobacco leaf samples for the same use but from different origins，the 3 indexes of tobacco leaf samples from Dehong and Pu’er were higher than those of Lincang tobacco samples，with more abundant microbial species.The microorganisms of cigar tobacco leaves from different producing areas were mainly bacteria，and the dominant phylum were Proteobacteria and Firmicutes.There were great differences in the dominant genera of tobacco leaves with different uses，with Klebsiella occupying a larger propor-tion of the cigar wrapper leaves from 3 origins，Pantoea dominated in the filler leaves from Lincang and Pu’er；and the dominant genera of the binder leaves from 3 origins were more diverse and abundant.The results of KEEG and COG func-tion prediction analysis showed that the microbial functional metabolic pathways and functional types of 9 tobacco samples were basically the same，but the relative abundance was greatly different.KEEG function prediction metabolic pathways were mainly global and overview maps，carbohydrate metabolism，amino acid metabolism，and the COG func-tion type prediction was mainly distributed in the unknown function，amino acid transport and metabolism，transcription，inorganic ion transport and metabolism，carbohydrate transport and metabolism.【Conclusion】The use of tobacco leaves is an important factor affecting the microbial diversity of cigar tobacco leaves in Yunnan，while the influence of producing area is relatively small，and the microbial richness of binder leaves is higher than that of cigar wrapper and filler leaves.

Key words：cigar tobacco leaves；microbial community；diversity；functional prediction；Yunnan

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（21706244）；Key Laboratory Project of China National Tobacco Corporation（110201503003）；Key Project of China Tobacco Yunnan Industrial Co.，Ltd.（JB2022YL02）

0引言

【研究意義】雪茄是一種由經(jīng)過調(diào)制及發(fā)酵后的煙葉卷制而成的特殊煙草制品（鄭天飛，2022）。雪茄煙葉品質(zhì)受多種因素影響，如栽培技術(shù)（陳棟等，2019）、品種（王琰琰等，2020）、采收方式（劉慧等，2021）、成熟度和晾制方式（葉科媛等，2022）等。發(fā)酵是雪茄生產(chǎn)的重要技術(shù)之一，對雪茄物理化學(xué)性質(zhì)及吸食品質(zhì)有重要影響（Hu etal.，2022；黃闊等，2023a）；微生物在發(fā)酵過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，影響雪茄的香氣和感官質(zhì)量（張倩穎等，2020；Li et al.，2020）。近年來，高通量測序技術(shù)因具有操作簡單、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、速度快、通量高、周期短等優(yōu)點(diǎn)（米其利等，2016），在微生物多樣性分析中被廣泛應(yīng)用（韓鳳等，2021；劉福童等，2022；Ansari et al.，2023；Blake et al.，2023）。因此，基于高通量測序技術(shù)分析雪茄煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及功能，對明確雪茄煙葉優(yōu)勢功能菌群、提升雪茄煙葉質(zhì)量水平具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國內(nèi)外關(guān)于雪茄煙葉微生物多樣性的研究主要集中在雪茄煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)比較、雪茄煙葉發(fā)酵過程中的微生物變化等方面。Chattopadhyay等（2019）、Smyth等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，雪茄煙葉細(xì)菌微生物群落以變形菌門（Proteobacteria）含量最高，屬分類水平上以芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）占主導(dǎo)地位；Liu等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，雪茄煙葉發(fā)酵前后屬分類水平上的微生物群落相對豐度變化明顯，但在門分類水平上，變形菌門和子囊菌門（Ascomycota）始終是優(yōu)勢菌門；鄭天飛等（2022）采用高通量測序技術(shù)對國內(nèi)外雪茄煙葉進(jìn)行分析，指出葡萄球菌屬、假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）為雪茄煙葉的優(yōu)勢菌屬；黃闊等（2023b）、吳麗君等（2023）采用高通量測序技術(shù)對發(fā)酵過程中煙葉細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌多樣性呈下降趨勢，優(yōu)勢菌屬為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、葡萄球菌屬、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和泛菌屬（Pantoea）等；Zhang等（2023）研究得出雪茄煙葉發(fā)酵過程中的關(guān)鍵微生物為假單胞菌屬、擬桿菌屬（Bacteroides）、弧菌屬（Vibrio）和曲霉屬（Aspergillus），酶活性和發(fā)酵溫濕度會(huì)影響發(fā)酵過程中微生物群落的變化；陳音等（2023）研究表明通過添加介質(zhì)發(fā)酵雪茄煙葉可有效提高煙葉微生物群落多樣性，延緩微生物群落演替速度，有改善雪茄煙葉香味的作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，我國雪茄市場發(fā)展迅速，但云南的雪茄原料技術(shù)研究較薄弱，雪茄煙葉發(fā)酵技術(shù)還不成熟（宋學(xué)茹等，2022）。因此，針對云南產(chǎn)地的雪茄煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測尚需深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以云南3個(gè)產(chǎn)地不同用途的雪茄煙葉為試驗(yàn)材料，通過高通量測序技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，探究雪茄煙葉微生物功能，為雪茄煙葉功能微生物的篩選及提高雪茄煙葉發(fā)酵品質(zhì)提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為云南中煙有限責(zé)任公司提供的云南德宏、臨滄和普洱3個(gè)產(chǎn)區(qū)2020年生產(chǎn)的中部葉茄衣、茄套和茄芯，樣品均經(jīng)過農(nóng)業(yè)發(fā)酵，醇化3年后取樣。每個(gè)產(chǎn)區(qū)每類煙葉為1份，共9份樣品，無菌條件下，對各雪茄煙葉樣品進(jìn)行隨機(jī)取樣，每個(gè)樣品各取50 g，排掉自封袋中空氣，置于-20℃冰箱密封保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1雪茄煙葉樣品DNA提取在超凈工作臺無菌條件下，將雪茄煙葉樣品剪成碎片，充分混勻，每個(gè)樣品取1 g，根據(jù)HieffNGS?MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］說明對樣品微生物總DNA進(jìn)行提取，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA純度和濃度，所得DNA保存于-20℃冰箱備用，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和高通量測序?qū)?個(gè)樣品細(xì)菌的16SrDNAV4～V5區(qū)和真菌的ITS1可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌擴(kuò)增引物為27F（5'-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3'）和1492R（5'-ACGGCTACCTTGTTAC GACTT-3'）；真菌擴(kuò)增引物為ITS1（5'-CTTGGTCAT TTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3'）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

反應(yīng)體系20.0μL：DNA模板0.5μL，2×Taq Plus Master Mix II 10.0μL，細(xì)菌或真菌上、下游引物各0.5μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性15 min；95℃30 s，55℃（細(xì)菌）/60℃（真菌）1 min，72℃1.5 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸6 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

用2.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，將合格的PCR產(chǎn)物利用Hieff NGSTM DNA Selection Beads試劑盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］進(jìn)行純化回收，以Illumina HiSeq 2500高通量測序儀（美國Illumina公司）進(jìn)行高通量測序。

1.3宏基因組高通量測序分析

將高通量測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)用fastp進(jìn)行質(zhì)控過濾，使用基于De Bruijn graph原理的拼接軟件megahit對Clean reads進(jìn)行多樣本混合拼接；將各樣本的Clean reads使用Bowtie2比對至組裝后的contigs上，獲取Unmapped PE reads；繼續(xù)使用SPAdes對未比對Reads進(jìn)行混合拼接；對于2次拼接組裝生成的contigs，過濾小于500 bp的序列后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和后續(xù)基因預(yù)測等下游分析。

使用DIAMOND將基因集蛋白序列與Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTp同源性比對，得到功能注釋和同源物種信息，篩選條件：E-valuelt;1e-5，Scoregt;60。同時(shí)根據(jù)NCBI的微生物分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫，獲得基因的物種分類注釋信息，并在門分類水平與屬分類水平上統(tǒng)計(jì)物種的相對豐度。使用DIAMOND將基因集蛋白序列與KEGG數(shù)據(jù)庫和eggNOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，獲得基因?qū)?yīng)的KO號和COG，在此基礎(chǔ)上對基因進(jìn)行功能注釋，并統(tǒng)計(jì)各功能層級在各個(gè)樣本中的豐度。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

將有效數(shù)據(jù)在97%水平上聚類成操作分類單元（Operation taxonomic unit，OTU），基于OTUs聚類結(jié)果，通過Alpha多樣性指數(shù)、門分類水平和屬分類水平上微生物群落相對豐度及微生物功能預(yù)測等對雪茄煙葉樣品進(jìn)行注釋與評估。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行整理分析，用Chiplot（https：//www.chiplot.online/）作圖。

2結(jié)果與分析

2.1云南雪茄煙葉微生物OTU聚類與Alpha多樣性分析

高通量測序結(jié)果（表1）表明，測序覆蓋度均在99%以上，測序結(jié)果能覆蓋雪茄煙葉表面微生物群落多樣性，具有較好的代表性和研究意義，不同產(chǎn)地及用途雪茄煙葉樣品微生物多樣性存在明顯差異。

按照97%相似性進(jìn)行OTU聚類分析，共得到2393個(gè)OTUs，各個(gè)樣品OTUs數(shù)量在125～442，樣品之間OTU數(shù)量存在較大差異。從產(chǎn)地來看，普洱煙葉樣品的OTUs數(shù)量最多，臨滄最少。同一產(chǎn)地不同用途煙葉樣品OTUs數(shù)量差異明顯，均表現(xiàn)為茄套gt;茄衣gt;茄芯。同一用途不同產(chǎn)地?zé)熑~樣品進(jìn)行比較，均表現(xiàn)為普洱gt;德宏gt;臨滄。

從Alpha多樣性指數(shù)來看，同一產(chǎn)地不同用途的煙葉樣品Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)存在一定差異，均表現(xiàn)為茄套高于茄衣和茄芯，茄衣與茄芯差別不大，說明茄套煙葉微生物物種最多，物種多樣性最豐富；同一用途不同產(chǎn)地的煙葉進(jìn)行比較，臨滄煙葉的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)均最低，與OTUs數(shù)量表現(xiàn)一致，說明臨滄雪茄煙葉的微生物物種較少，微生物群落多樣性豐富度較低，而普洱和德宏雪茄煙葉的微生物多樣性較豐富。

2.2云南雪茄煙葉微生物群落組成分析

2.2.1煙葉微生物群落門分類水平組成云南雪茄煙葉在門分類水平上的物種組成如圖1所示。相對豐度較高的微生物包括變形菌門、厚壁菌門（Fir-micutes）、放線菌門（Actinobacteria）、未分類細(xì)菌門（unclassified_Bacteria_phylum）、尾噬菌體門（Urovi-ricota）、子囊菌門、擬桿菌門（Bacteroidetes）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、毛霉門（Mucoromycota）和霍夫奈病毒門（Hofneiviricota）。9個(gè)樣品細(xì)菌相對豐度占比均超過99.84%，而真菌占比均低于0.09%，表明供試樣品微生物群落優(yōu)勢微生物主要為細(xì)菌。

由圖1可知，不同產(chǎn)地及用途雪茄煙葉樣品均以變形菌門和厚壁菌門為主要優(yōu)勢菌門，平均相對豐度分別為77.53%和20.39%。其中，德宏和普洱茄套煙葉的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，相對豐度分別為83.17%和76.76%，與其他煙葉樣品出現(xiàn)較大差異，其他煙葉樣品的優(yōu)勢菌門為變形菌門，相對豐度均在85.00%以上。

2.2.2煙葉微生物群落屬分類水平組成云南雪茄煙葉樣品微生物群落屬分類水平分析結(jié)果如圖2所示。煙葉樣品的優(yōu)勢菌屬平均相對豐度排名前10的有泛菌屬（25.11%）、克雷伯桿菌屬（Klebsiella，15.78%）、假單胞菌屬（15.54%）、不動(dòng)桿菌屬（13.27%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，4.21%）、類芽孢桿菌屬（Paeni-bacillus，3.60%）、尼亞利亞菌屬（Niallia，3.45%）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus，2.55%）、未分類腸桿菌屬（unclassified_Enterobacteriaceae_genus，1.96%）和腸桿菌屬（Enterobacter，0.41%）等。

由圖2可知，從煙葉用途來看，克雷伯桿菌屬為茄衣煙葉特有的優(yōu)勢菌屬，在3個(gè)產(chǎn)地茄衣煙葉中的相對豐度均較高，且均高于茄芯和茄套煙葉，但產(chǎn)地之間差異較小，分別為臨滄（58.83%）gt;普洱（44.55%）gt;德宏（44.27%）。未分類腸桿菌屬在茄衣煙葉中平均相對豐度為5.27%，高于其在茄套和茄芯煙葉中的相對豐度（0.23%和0.36%），也屬于茄衣煙葉優(yōu)勢菌屬。泛菌屬在臨滄和普洱茄芯煙葉中占據(jù)主導(dǎo)地位，相對豐度均高達(dá)89.00%。與茄芯和茄衣煙葉相比，茄套煙葉的優(yōu)勢菌屬更多元化且更豐富，尤其是德宏和普洱的茄套煙葉，優(yōu)勢菌屬包括賴氨酸芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、尼亞利亞菌屬和類芽孢桿菌屬等。

2.3云南雪茄煙葉微生物群落相關(guān)性分析

對屬分類水平上平均相對豐度排名前10的菌群在各樣品之間的物種進(jìn)行聚類分析，將微生物群落呈現(xiàn)在熱圖上，顏色變化可反映出屬分類水平上不同樣品間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似性。顏色越藍(lán)代表菌屬在樣品間的相對豐度越高，顏色越紅代表菌屬在樣品間的相對豐度越低。由圖3可看出，樣品聚類結(jié)果與屬分類水平微生物相對豐度分布結(jié)果基本一致，普洱茄芯煙葉和臨滄茄芯煙葉聚在同一支上，說明這2個(gè)產(chǎn)地茄芯煙葉的群落結(jié)構(gòu)較相似；同理，普洱茄套煙葉與德宏茄套煙葉2個(gè)樣品的群落結(jié)構(gòu)較相似。此外，相同用途的煙葉更易聚在同一分支。由此可知，雪茄煙葉微生物群落多樣性受用途影響相對較大，與產(chǎn)地也有一定關(guān)系。

2.4云南雪茄煙葉樣品微生物功能組成預(yù)測

2.4.1 KEGG代謝通路分析基于KEGG數(shù)據(jù)庫二級通路的功能基因分析共富集到46條代謝通路，圖4中展示9個(gè)樣品代謝通路功能基因相對豐度前10的結(jié)果。由圖4可知，主要代謝通路有全局和概覽地圖（Global and overview maps）、碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、膜運(yùn)輸（Membrane transport）、能量代謝（Energy metabolism）等通路。不同產(chǎn)地及用途的雪茄煙葉樣品主要富集在全局和概覽地圖通路上，其次，大多數(shù)樣品富集在碳水化合物代謝、氨基酸代謝和膜運(yùn)輸?shù)?個(gè)通路上。

2.4.2 COG功能注釋分析將9個(gè)煙葉樣品蛋白序列與eggNOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得基因?qū)?yīng)的COG。9個(gè)雪茄樣品的基因功能大致可分為24類。圖5中展示9個(gè)樣品基因功能相對豐度前10的結(jié)果，功能基因相對豐度較高的依次為［S］：未知功能（Function unknown）、［E］：氨基酸運(yùn)輸和代謝（Amino acid transport and metabolism）、［K］：轉(zhuǎn)錄（Transcrip-tion）、［P］：無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝（Inorganic ion trans-port and metabolism）、［G］：碳水化合物的運(yùn)輸和代謝（Carbohydrate transport and metabolism）等。根據(jù)結(jié)果分析可知，不同產(chǎn)地雪茄煙葉樣品中涉及的COG功能種類基本一致，但功能的相對豐度有明顯差異。

3討論

本研究對云南普洱、德宏和臨滄3個(gè)雪茄煙葉產(chǎn)地不同用途的煙葉表面微生物進(jìn)行高通量測序分析，通過Alpha多樣性分析、門分類水平和屬分類水平微生物群落分析、功能預(yù)測等揭示了云南不同產(chǎn)地及用途煙葉表面微生物群落結(jié)構(gòu)及功能。

本研究中，Alpha多樣性分析結(jié)果表明，從煙葉用途來看，云南茄套煙葉具有更高的微生物群落多樣性和豐富度，從產(chǎn)地來看，云南普洱煙葉的微生物群落多樣性和豐富度總體較高；微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，云南不同產(chǎn)地雪茄煙葉細(xì)菌相對豐度遠(yuǎn)高于真菌相對豐度，細(xì)菌對雪茄煙葉發(fā)酵的影響更加重要。細(xì)菌在發(fā)酵過程中主要使煙葉中的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子，與揮發(fā)性香味成分有關(guān)，影響雪茄的吸食品質(zhì)（張倩穎等，2020）。細(xì)菌在雪茄發(fā)酵過程中主要參與糖代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝3個(gè)代謝過程，而真菌主要依靠腐生作用降解木質(zhì)素、纖維素和果膠以達(dá)到提高雪茄香氣質(zhì)量的作用（Zhang et al.，2023）。在門分類水平上，9種雪茄煙葉樣品微生物優(yōu)勢菌門差異較小，主要為變形菌門和厚壁菌門，與田麗君等（2022）、鄭天飛等（2022）對不同產(chǎn)地雪茄煙葉微生物群落及黃闊等（2023b）、Wu等（2023）對雪茄發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究結(jié)果一致。變形菌門和厚壁菌門是植物的主要細(xì)菌類群，二者均可幫助根系吸收對植物有利的微量元素。變形菌門可調(diào)節(jié)土壤中的氮、碳、硫循環(huán)，提高植物生長速度，促進(jìn)植物生長發(fā)育；厚壁菌門中芽孢桿菌為優(yōu)勢菌，可提高作物抵抗力，防治多種病害（劉京偉等，2021；唐杰等，2021）。在屬分類水平上，不同產(chǎn)地及用途雪茄煙葉樣品的優(yōu)勢菌屬存在明顯差異，茄衣的優(yōu)勢菌屬主要有克雷伯桿菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬等，其中，克雷伯桿菌屬是茄衣特有的相對豐度占比較高的優(yōu)勢菌屬。研究發(fā)現(xiàn)，克雷伯桿菌屬與香味成分呈正相關(guān)，特別是與β-大馬酮、巨豆三烯酮、茄酮和苯乙醇等呈顯著正相關(guān)，可極大提高卷煙香氣質(zhì)（李石頭等，2023）；假單胞菌屬可降解煙堿，影響雪茄煙葉吸食勁頭（徐慧等，2013）；不動(dòng)桿菌屬不僅可有效抑制煙草黑脛病，還具有解磷解鉀和煙堿降解的雙重活性（孫明輝等，2015；劉天波等，2022）。泛菌屬在臨滄和普洱2個(gè)產(chǎn)地的茄芯煙葉中占據(jù)主導(dǎo)地位，在德宏產(chǎn)地茄芯煙葉中鮮少出現(xiàn)。泛菌屬可降解煙葉中的類胡蘿卜素等物質(zhì)，生成香氣物質(zhì)，從而改善煙葉的香氣質(zhì)量（Zhao et al.，2015）。茄套煙葉的優(yōu)勢菌屬更豐富且相對豐度占比相差不大，德宏和普洱2個(gè)產(chǎn)地的茄套煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)更相似，臨滄產(chǎn)地茄套煙葉與其有明顯差異。聚類分析也證明了上述結(jié)果，聚在同一分支上的煙葉樣品群落結(jié)構(gòu)較相似，無論是同一產(chǎn)地不同用途，還是同一用途不同產(chǎn)地的雪茄微生物群落結(jié)構(gòu)均有差異，這可能是由雪茄煙葉土壤環(huán)境、氣候條件、煙葉品種及栽培方式等因素不同而引起。此外，微生物生長環(huán)境不同也會(huì)導(dǎo)致其代謝活動(dòng)產(chǎn)生差異，在雪茄煙葉發(fā)酵中發(fā)揮的作用也就不同，今后尚需深入研究。

本研究利用高通量測序技術(shù)對云南雪茄煙葉樣品微生物功能進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)基于KEGG數(shù)據(jù)庫二級通路的功能基因分析共富集到46條代謝通路，除全局和概覽地圖通路外，碳水化合物代謝和氨基酸代謝通路相對豐度占比較高。這2種代謝功能對于改善雪茄煙葉品質(zhì)有重要作用，一方面，碳水化合物是形成香氣物質(zhì)的重要前提，如呋喃衍生物、簡單的酮類和醛類等（徐偉等，2018；雷亞芳，2021）；另一方面，氨基酸代謝中的氨基酸可與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，形成多種含氮雜環(huán)化合物，與煙草香味相協(xié)調(diào)，與煙葉風(fēng)味及品質(zhì)密切相關(guān)（黎旺姐等，2016）?；贑OG的功能注釋分析，共注釋到24種功能，功能基因相對豐度較高的依次為未知功能、氨基酸運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄、無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝等，氨基酸運(yùn)輸和代謝主要參與氨基酸分解轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì)合成，為微生物提供必需的能量和碳源（劉超等，2023）。

結(jié)合雪茄煙葉微生物的功能預(yù)測結(jié)果，可有效篩選出對煙葉品質(zhì)有改善作用的微生物，對于通過微生物發(fā)酵優(yōu)化雪茄煙葉的工藝具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。但功能預(yù)測具有不確定性，后續(xù)可通過宏轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)來深化對這些微生物功能的分析，以進(jìn)一步提高預(yù)測的準(zhǔn)確性和可靠性。這將為雪茄煙葉的微生物改良提供科學(xué)依據(jù)，并可能揭示新的微生物代謝途徑和作用機(jī)制。

4結(jié)論

煙葉用途是影響云南雪茄煙葉微生物多樣性的重要因素，煙葉產(chǎn)地的影響相對較小；不同用途的雪茄煙葉微生物多樣性與注釋基因功能無明顯差異，而微生物群落豐富度以茄套煙葉最高。

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（責(zé)任編輯王暉）