番茄根際酚酸累積對(duì)青枯菌入侵的影響

優(yōu)秀青年學(xué)者論壇

黃建鳳（1986-），博士，副研究員，主要從事農(nóng)業(yè)微生物篩選與應(yīng)用研究工作。主持國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目“連作番茄根系分泌物促進(jìn)土傳青枯菌入侵的機(jī)制研究”、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃子課題“功能菌耦合添加劑聯(lián)調(diào)聯(lián)控的堆肥促腐提質(zhì)技術(shù)研究”、廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“尖孢鐮刀菌入侵改變香蕉根系分泌物組成的效應(yīng)研究”、廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目“新型生物有機(jī)肥與酸性土壤改良劑協(xié)同防控香蕉枯萎病的研究與示范”等科研項(xiàng)目8項(xiàng)，參與省部級(jí)以上科研項(xiàng)目20余項(xiàng)。獲廣東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣獎(jiǎng)1項(xiàng)；獲授權(quán)發(fā)明專(zhuān)利3項(xiàng)；以第一作者或通訊作者在《AppliedSoil Ecology》《Journal of Agricultural and Food Chemistry》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》《微生物學(xué)通報(bào)》《農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報(bào)》等國(guó)內(nèi)外期刊發(fā)表論文10篇。

摘要：【目的】探明番茄根際酚酸累積對(duì)青枯菌入侵的影響，為闡明番茄青枯病的發(fā)病機(jī)理提供理論依據(jù)。【方法】通過(guò)96孔板培養(yǎng)青枯菌研究5種不同酚酸類(lèi)物質(zhì)（苯丙酸、苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸和丁香酸）單品對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的影響；應(yīng)用高通量測(cè)序方法檢測(cè)酚酸累積后土壤細(xì)菌群落多樣性的變化，應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)土壤中青枯菌的數(shù)量變化；通過(guò)主成分分析（PCA）、冗余分析（RDA）和相關(guān)分析等方法，分析不同酚酸處理后土壤細(xì)菌群落變化對(duì)青枯菌生長(zhǎng)繁殖的影響。【結(jié)果】苯丙酸、苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸和丁香酸均有利于青枯菌生長(zhǎng)，其中咖啡酸的作用最明顯，青枯菌生長(zhǎng)的OD600 nm達(dá)0.17，顯著高于其他酚酸處理（Plt;0.05，下同）。與空白對(duì)照相比，各酚酸類(lèi)物質(zhì)持續(xù)累積均會(huì)顯著降低土壤細(xì)菌群落Sobs、Shannon、ACE和Chao1多樣性指數(shù)；苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸和丁香酸處理后土壤細(xì)菌門(mén)分類(lèi)水平上的優(yōu)勢(shì)種群由變形菌門(mén)（Proteobacteria）轉(zhuǎn)變?yōu)楹癖诰T(mén)（Firmicutes），其中丁香酸處理后土壤厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度最高，達(dá)90.4%，而苯丙酸處理與其他酚酸處理變化趨勢(shì)存在明顯差異，其優(yōu)勢(shì)種群為變形菌門(mén)，相對(duì)豐度達(dá)47.3%。RDA結(jié)果顯示，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)，變形菌門(mén)相對(duì)豐度與pH、NO3-N和NH4-N呈正相關(guān)。在酚酸物質(zhì)處理的土壤中接種青枯菌28 d后，青枯菌的繁殖數(shù)量顯著高于空白對(duì)照，其中以丁香酸處理最高，達(dá)8.16 lg CFU/g土。相關(guān)分析結(jié)果顯示，土壤中青枯菌數(shù)量與厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，而與其他群落相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)?！窘Y(jié)論】番茄根際土壤累積的酚酸類(lèi)物質(zhì)可破壞土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，使其抵御青枯菌入侵的能力減弱，從而加快病害發(fā)生。

關(guān)鍵詞：番茄；根際；青枯菌；酚酸類(lèi)物質(zhì)；入侵

中圖分類(lèi)號(hào)：S412.15文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）09-2547-11

Effects of phenolic acid accumulation in tomato rhizosphere on Ralstonia solanacearum invasion

HUANG Jian-feng，WU Yong-pei，PANG Yu-wan*，HUANG Xu，ZHANG Mu，TANG Shuan-hu，F(xiàn)U Hong-ting，LI Ping

（Institute of Agricultural Resources and Environment，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer in South Region，Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratory of Nutrient Cycling and Farmland Conservation，Guangzhou，Guangdong 510640，China）

Abstract：【Objective】This study aimed to investigate the effects of phenolic acid accumulation in the tomato rhizo-sphere on the invasion of Ralstonia solanacearum，providing theoretical support for elucidating the pathogenesis of to-mato bacterial wilt.【Method】The effects of 5 phenolic acid substances（phenylpropanoic acid，benzoic acid，caffeic acid，ferulic acid and syringic acid）on the growth of R.solanacearum were examined using 96-well plate culture.The changes in soil bacterial community diversity after phenolic acid accumulation were detected using high-throughput se-quencing methods.The population changes of R.solanacearum in soil were detected using selective culture media.Princi-pal component analysis（PCA），redundancy analysis（RDA）and correlation analysis were employed to analyze the ef-fects of soil bacterial community changes on the growth and reproduction of R.solanacearum under different phenolic acid treatments.【Result】Phenylpropanoic acid，benzoic acid，caffeicacid，ferulic acid and syringic acid promoted R.so-lanacearum growth，with caffeic acid showing the most obvious effect.The OD600 nm of R.solanacearum reached 0.17 in the caffeicacid treatment，which was significantly higher than those in other treatments（Plt;0.05，the same below）.Com-pared with blank control，the continuous accumulation of each phenolic acid substance significantly reduced the diversity indexes of soil bacterial communities（Sobs，Shannon，ACE and Chao1 indexes）.After benzoic acid，caffeicacid，feru-lic acid and syringic acid treatments，the dominant phyla shifted from Proteobacteria to Firmicutes.The relative abun-dance of Firmicutes in soil was the highest in the syringic acid treatment，reaching 90.4%.However，the phenylpropanoic acid treatment showed a significant different trend compared with other phenolic acid treatments，with Proteobacteria be-coming the dominant phylum（47.3%relative abundance）.RDA revealed a positive correlation between relative abun-dance of Firmicutes and soil organic matter content，and a positive correlation between relative abundance of Proteobacte-ria and pH，NO3-N，NH4-N.After 28 dofR.solanacearum inoculation in soils treated with phenolic acids，thereproduc-tive quantity of R.solanacearum was significantly higher than that of blank control，with the highest population（8.16 lg CFU/g soil）observed in the syringic acid treatment.Correlation analysis showed that the population of R.solanacearum was significantly positively correlated with the relative abundance of Firmicutes，but it was significantly negatively corre-lated with the relative abundance of other communities.【Conclusion】The accumulation of phenolic acid substances into-mato rhizosphere disrupts the soil bacterial community structure，weakening its resistance to R.solanacearum invasion and accelerating disease development.

Key words：tomato；rhizosphere；Ralstonia solanacearum；phenolic acid substance；invasion

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31501837）；Science and Technology Talent Training Special Project of Guangdong Academy of Agricultural Sciences（R2018PY-QF004）

0引言

【研究意義】番茄具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國(guó)是全球最大的番茄生產(chǎn)國(guó)，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2022年我國(guó)番茄產(chǎn)量達(dá)6970.8萬(wàn)t（孫永珍等，2023）。我國(guó)番茄產(chǎn)業(yè)在快速發(fā)展過(guò)程中面臨多重挑戰(zhàn)，如種植技術(shù)和管理水平相對(duì)落后、集約化復(fù)種指數(shù)高，導(dǎo)致番茄連作障礙日益嚴(yán)重，制約了我國(guó)番茄產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。青枯菌即茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum，RS）是引起連作番茄青枯病的病原菌，其可通過(guò)根系侵入植株木質(zhì)部導(dǎo)管并在其中大量增殖而導(dǎo)致植株死亡（Lebeau etal.，2011），番茄植株一旦感染該病則難以遏制。因此，持續(xù)深入研究番茄連作青枯病的發(fā)生機(jī)理，可為針對(duì)性地建立有效的防控技術(shù)體系提供數(shù)據(jù)支撐?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】酚酸被廣泛認(rèn)為是植物根系分泌物中主要的化感物質(zhì)，在連作體系中，酚酸類(lèi)物質(zhì)會(huì)在作物根際土壤中大量累積（白羽祥等，2019；宿子文等，2023），該類(lèi)物質(zhì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)具有選擇性抑制或促進(jìn)作用，進(jìn)而造成土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變和數(shù)量失衡，是發(fā)生連作障礙的主要原因（Zhou et al.，2012；羅夢(mèng)香等，2024），即使對(duì)于抗性品種，長(zhǎng)期連作也會(huì)造成酚酸類(lèi)物質(zhì)累積，導(dǎo)致化感自毒作用產(chǎn)生。Li等（2014）在研究花生連作障礙時(shí)發(fā)現(xiàn)，連作土壤致病的主要原因在于植物根系分泌物誘導(dǎo)土壤微生物區(qū)系發(fā)生改變，使植物根際促生菌（PGPR）和菌根數(shù)量減少，而病原真菌數(shù)量累積，導(dǎo)致發(fā)生土傳病害。Li等（2017）、劉艷霞等（2019）發(fā)現(xiàn)烤煙根系分泌物中的主要酚酸類(lèi)物質(zhì)苯甲酸和3-苯丙酸在明顯降低土壤微生物群落多樣性、顯著增加有害微生物數(shù)量的同時(shí)極大降低有益微生物數(shù)量，2種酚酸物質(zhì)均能促進(jìn)青枯菌生長(zhǎng)。呂豐娟等（2020）通過(guò)對(duì)比不同抗性芝麻正茬和連作條件下酚酸類(lèi)物質(zhì)含量變化發(fā)現(xiàn)，連作導(dǎo)致苯丙酸、苯甲酸、水楊酸和丁香酸等具有化感作用的酚酸類(lèi)物質(zhì)累積，從而引起連作障礙。嚴(yán)文輝等（2022）通過(guò)外源持續(xù)添加丁香酸到番茄田和黃瓜田探究其對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其潛在功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加丁香酸后細(xì)菌形成生物膜的能力顯著降低，導(dǎo)致其在土壤定殖的數(shù)量顯著減少，相對(duì)豐度下降。范成平等（2023）通過(guò)16S DNA和ITS基因測(cè)序技術(shù)分析煙草青枯病不同發(fā)病時(shí)期根際酚酸含量與微生物多樣性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)病根際苯甲酸、阿魏酸和香豆酸含量與健康根際存在顯著差異，細(xì)菌相對(duì)豐度下降最顯著的是鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomo-nas），真菌相對(duì)豐度增加最顯著的毛霉屬（Mucor）和Pseudaleuria屬與青枯病發(fā)病率顯著相關(guān)。還有研究表明，在田間條件下，酚酸類(lèi)物質(zhì)表現(xiàn)的化感作用通常是多種酚酸相互作用的結(jié)果，不同酚酸之間存在相互促進(jìn)或抑制作用（Wu et al.，2016；白羽祥等，2019；李慶凱等，2019）。周柳婷等（2021）應(yīng)用高效液相色譜檢測(cè)到連作木麻黃根系分泌物中香草酸、阿魏酸、沒(méi)食子酸、對(duì)香豆酸和水楊酸5種酚酸類(lèi)物質(zhì)的總含量隨著連作年限的增加而增加，將5種酚酸以一定比例同時(shí)添加至土壤后，可顯著促進(jìn)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)而抑制解淀粉芽孢桿菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致連作障礙加劇?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人關(guān)于酚酸類(lèi)物質(zhì)的研究報(bào)道大多關(guān)注于其化感作用，缺乏對(duì)青枯菌利用酚酸類(lèi)物質(zhì)能力的研究，且研究的酚酸種類(lèi)較少。目前，關(guān)于多種不同酚酸類(lèi)物質(zhì)累積對(duì)番茄根際微生物多樣性及青枯病發(fā)生的影響研究報(bào)道較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用化學(xué)單品開(kāi)展室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)，通過(guò)外源持續(xù)分別添加5種單一的酚酸類(lèi)物質(zhì)，采用高通量測(cè)序方法探究酚酸累積對(duì)土壤細(xì)菌多樣性的影響；通過(guò)室內(nèi)分析檢測(cè)，研究土壤理化性質(zhì)的變化，并應(yīng)用相關(guān)性分析明確土壤不同養(yǎng)分及生物多重因素變化對(duì)病原菌在土壤中定殖生長(zhǎng)的影響，為闡明番茄根際酚酸類(lèi)物質(zhì)促進(jìn)土傳青枯菌入侵的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試土壤采集自廣東省廣州市天河區(qū)五山街道的番茄種植園（23°13'N，113°27'E），園區(qū)內(nèi)番茄未暴發(fā)過(guò)青枯病。取0～20 cm耕層土壤，去除石礫、動(dòng)植物殘?bào)w等雜質(zhì)后，充分混勻，晾干備用。供試土壤理化性質(zhì)：pH 4.68，有機(jī)質(zhì)含量1.94%，堿解氮104.53 mg/kg，有效磷83.58 mg/kg，速效鉀56.50 mg/kg。

1.1.2供試菌株供試青枯菌QL-Rs1115（Gen-Bank登錄號(hào)GU390462）保存于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院（Weiet al.，2011）。

1.1.3供試酚酸類(lèi)物質(zhì)供試酚酸類(lèi)物質(zhì)共5種，分別為苯甲酸（Ben）、苯丙酸（Phe）、阿魏酸（Fer）、丁香酸（Syr）和咖啡酸（Caff）（均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），分別溶解于乙醇備用，濃度為0.05 mol/L。

1.1.4供試培養(yǎng)基NA液體培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L、葡萄糖10 g/L、酵母粉0.5 g/L、蛋白胨5 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.0，115℃滅菌30 min；NA固體培養(yǎng)基：在NA液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入瓊脂20 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.0，115℃滅菌30 min。

TTC固體培養(yǎng)基：選擇性培養(yǎng)基，配方同NA固體培養(yǎng)基，115℃滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻至55℃，在每300 mL培養(yǎng)基中加入10 g/L放線菌酮3 mL、10 g/L桿菌肽0.75 mL、10 g/L氯霉素0.15 mL、10 g/L青霉素0.15 mL、10 g/L結(jié)晶紫0.15 mL、10 g/L多黏菌素3 mL、20 g/L 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）0.75 mL，各抗生素在配制時(shí)均需過(guò)0.22μm無(wú)菌濾膜，除放線菌酮和氯霉素需溶于無(wú)水乙醇外，其余抗生素均溶于水。

OS培養(yǎng)基（Schnider-Keel etal.，2000）：Na2HPO4 7.01 g/L、KH2PO4 6.80 g/L、MgSO4·7H2O 1.19 g/L、（NH4）2 SO4 1.20 g/L、CaCl2·7H2O 8.80×10-2 g/L、FeSO4·7H2O 7.00×10-3 g/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 2.00×10-4 g/L、Na-EDTA 2.50×10-3 g/L、ZnSO4·7H2O 1.11 g/L、MnSO4·6H2O 1.54×10-3 g/L、CuSO4·5H2O 3.90×10-4 g/L、Co（NO3）2·6H2O 2.50×10-4 g/L、Na2B4O7·10H2O1.80×10-4 g/L、NiCl2·6H2O 1.30×10-3 g/L。該培養(yǎng)基不含碳源，用于研究病原菌對(duì)單一供試酚酸類(lèi)物質(zhì)的利用情況。

1.2青枯菌菌液制備

將-80℃保存的QL-Rs1115劃線活化到TTC培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落后，再次劃線培養(yǎng)，再次長(zhǎng)出單菌落后挑取單菌落，接種至2 mL NA液體培養(yǎng)基中，28℃、170 r/min搖床培養(yǎng)24 h，獲得QL-Rs1115種子液。

向裝有50 mL NA液體培養(yǎng)基的三角瓶中加入1 mL QL-Rs1115種子液，28℃、170 r/min搖床培養(yǎng)36～40 h，將菌液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，25℃、6000 r/min離心10min，棄上清液，用無(wú)菌水重懸，重復(fù)離心1次，再次用無(wú)菌水重懸，采用稀釋涂布法將重懸后的菌液涂布至TTC固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)36 h，計(jì)數(shù)測(cè)算菌液濃度，確保達(dá)到1.0×108 CFU/mL。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1供試酚酸對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的影響在96孔板中每孔加入150μL含有單一供試酚酸的OS培養(yǎng)基，酚酸終濃度為0.05μmol/mL，以酚酸類(lèi)物質(zhì)的溶劑乙醇為空白對(duì)照（CKn），NA液體培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照（CKp），每處理3個(gè)重復(fù)，按1%接種量接種QL-Rs1115菌液到96孔板中，30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)48h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)青枯菌的OD600 nm。

1.3.2供試酚酸對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響將風(fēng)干土壤分裝到50 mL離心管（口徑3 cm，高11 cm）中，每管裝土50 g。試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理：（1）空白對(duì)照（CKn），每2 d澆入0.1 mL乙醇；（2）苯甲酸處理（Ben），每2 d澆入0.1 mL苯甲酸溶液，使其終濃度為0.05μmol/g干土（Badri etal.，2013）（以下4種酚酸終濃度相同）；（3）苯丙酸處理（Phe），每2 d澆入0.1 mL苯丙酸溶液；（4）阿魏酸處理（Fer），每2 d澆入0.1 mL阿魏酸溶液；（5）丁香酸處理（Syr），每2 d澆入0.1 mL丁香酸溶液；（6）咖啡酸處理（Caff），每2 d澆入0.1 mL咖啡酸溶液。每處理4個(gè)重復(fù)，共24管，置于光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度2000～3000 lx，光周期L∶D=16 h∶8 h，連續(xù)處理60 d后，各管取5 g土用于細(xì)菌MiSeq高通量測(cè)序。

1.3.3土壤細(xì)菌群落多樣性變化對(duì)青枯菌入侵的影響1.3.2處理結(jié)束后，在各管剩余土壤中接種QL-Rs1115菌液，使其在土壤中的終濃度為105 CFU/g土，并調(diào)整含水量為土壤田間持水量的75%，連續(xù)處理30 d。每管每7 d取3 g土，檢測(cè)QL-Rs1115菌落數(shù)量變化。

1.4測(cè)定指標(biāo)和方法

1.4.1土壤細(xì)菌多樣性檢測(cè)采用試劑盒（MO BIO Laboratories，美國(guó)）方法提取土壤樣品DNA，按照試劑盒說(shuō)明步驟操作，使用引物341F（5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCC GCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和534R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）進(jìn)行16S rRNA V3區(qū)擴(kuò)增，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度，并用NanoDrop 1000分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司，美國(guó)）檢測(cè)DNA濃度，樣品合格后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行MiSeq測(cè)序。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得有效序列并進(jìn)行物種注釋?zhuān)?jì)算文庫(kù)覆蓋度和多樣性指數(shù)（Caporaso etal.，2011；Edgar，2013）。

1.4.2 QL-Rs1115菌落數(shù)量檢測(cè)稱(chēng)取1 g土壤樣品，加入裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，使用渦旋混合器將樣品充分混勻，用無(wú)菌槍頭吸取1 mL土壤懸液轉(zhuǎn)接至9 mL無(wú)菌水中，依次操作3次后得到土壤樣品稀釋梯度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，選擇10-3、10-4和10-5 3個(gè)梯度，分別吸取0.1 mL樣品接入選擇性培養(yǎng)基TTC上，用涂布棒涂布均勻后置于培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)48 h，通過(guò)統(tǒng)計(jì)不同稀釋梯度下QL-Rs1115菌落數(shù)量計(jì)算其濃度，單位換算為lg CFU/g土。

1.4.3土壤理化性質(zhì)檢測(cè)土壤理化性質(zhì)檢測(cè)指標(biāo)包括pH、有機(jī)質(zhì)（OM）、NO3-N和NH4-N，采用常規(guī)土壤農(nóng)化分析方法（鮑士旦，2000）測(cè)定，其中pH用2.5∶1.0水土比浸提pH計(jì)法測(cè)定，土壤有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀容量法—外加熱法測(cè)定，NO3-N和NH4-N用流動(dòng)注射分析儀（Futura，法國(guó)）測(cè)定。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0進(jìn)行LSD-test（rlt;0.05）法多重比較分析，采用SigmaPlot 14.0進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)回歸方程分析和圖表制作。應(yīng)用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-sanger生信云系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性指數(shù)分析，并構(gòu)建主成分分析（PCA）圖、冗余分析（RDA）圖及物種群落豐度柱狀圖（物種豐度gt;1%）。

2結(jié)果與分析

2.1酚酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的影響

QL-Rs1115在供試酚酸中均能有效生長(zhǎng)（圖1），其中在咖啡酸中的菌落數(shù)量最多，顯著高于其他酚酸處理（rlt;0.05，下同），OD600 nm達(dá)0.17，且與陽(yáng)性對(duì)照（CKp，0.18）無(wú)顯著差異（rgt;0.05，下同）；QL-Rs1115在丁香酸、阿魏酸和苯甲酸中的菌落數(shù)量差異不顯著，OD600 nm依次為0.09、0.08和0.06；5種酚酸處理中，QL-Rs1115在苯丙酸中的菌落數(shù)量最少，OD600 nm為0.05，顯著少于咖啡酸和丁香酸處理，但與苯甲酸和阿魏酸處理差異不顯著。

2.2酚酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

由表1可知，各處理的操作分類(lèi)單元（OTU）覆蓋度為98.00%～99.00%，測(cè)序讀長(zhǎng)足以支撐后續(xù)分析。與對(duì)照（CKn）處理相比，酚酸類(lèi)物質(zhì)處理后，土壤細(xì)菌群落的Sobs指數(shù)均顯著降低，其中以Syr處理最低，為1520，其余依次為Fer（1590）、Ben（1594）、Caff（1638）和Phe（1785）處理；各酚酸類(lèi)物質(zhì)處理的Shannon指數(shù)均顯著降低，其中以Ben處理最低，為4.99，其次為Phe處理（5.19），二者均顯著低于其他酚酸處理，但二者間差異不顯著；各酚酸類(lèi)物質(zhì)處理Simpson指數(shù)均高于對(duì)照（0.0046），其中以Ben處理最高，達(dá)0.0460，其次為Phe（0.0260）處理，二者均顯著高于對(duì)照，而其他酚酸處理與對(duì)照無(wú)顯著差異；各酚酸類(lèi)物質(zhì)處理ACE指數(shù)均顯著低于對(duì)照（3033），其中Phe處理顯著高于其他酚酸處理，達(dá)2453，Syr處理最低，為1794；各酚酸類(lèi)物質(zhì)處理Chao1指數(shù)均顯著低于對(duì)照，其中Phe處理顯著高于其他酚酸處理，達(dá)2488，Syr處理最低，為1824。

2.3酚酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)土壤細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)種群的影響

各酚酸類(lèi)物質(zhì)處理后，土壤細(xì)菌群落組成相對(duì)豐度發(fā)生顯著變化（圖2）。對(duì)照處理土壤細(xì)菌群落在門(mén)分類(lèi)水平上主要由厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、糖細(xì)菌門(mén)（Saccharibacteria）、浮霉菌門(mén)（Planctomyce-tes）、藍(lán)菌門(mén)（Cyanobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroide-tes）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）和疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）組成。不同酚酸類(lèi)物質(zhì)處理中，Phe處理與其他酚酸處理的土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度變化趨勢(shì)存在明顯差異，其優(yōu)勢(shì)種群為變形菌門(mén)，相對(duì)豐度達(dá)47.3%，較對(duì)照高51.2%，厚壁菌門(mén)和糖細(xì)菌門(mén)相對(duì)豐度較對(duì)照均有所增加，分別高51.1%和125.3%；Ben、Caff、Fer和Syr處理后，門(mén)分類(lèi)水平上細(xì)菌組成明顯減少，主要由厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)和變形菌門(mén)組成，其中厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)相對(duì)豐度合計(jì)各處理均大于90%，Ben、Caff、Fer和Syr處理的厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度均最高，分別達(dá)87.9%、80.4%、85.6%和90.4%，其次為放線菌門(mén)，相對(duì)豐度分別為7.3%、13.0%、10.8%和6.7%；Fer和Syr處理的變形菌門(mén)相對(duì)豐度僅0.73%和0.35%，綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度分別為1.78%和2.16%；Ben和Caff處理的變形菌門(mén)相對(duì)豐度分別為2.63%和1.90%，綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度分別為1.09%和3.24%。

2.4酚酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

PCA結(jié)果（圖3）顯示，各酚酸類(lèi)物質(zhì)處理的細(xì)菌群落均不能與對(duì)照聚類(lèi)到一起，第一主成分（PC1）解釋了88.23%的可能由于Ben、Caff、Fer和Syr處理導(dǎo)致細(xì)菌群落與對(duì)照呈現(xiàn)差異，而第二主成分（PC2）解釋了4.92%的可能由于Phe處理造成細(xì)菌多樣性與對(duì)照存在差異。Ben、Caff、Fer和Syr處理后，細(xì)菌群落與Phe無(wú)法聚類(lèi)，PC1解釋了88.23%的可能由于不同酚酸處理造成與Phe之間的差異。Caff與Syr、Ben處于不同象限，而PC2解釋了4.92%的可能由于不同處理之間造成的差異，Syr和Ben處于同一象限，細(xì)菌群落組成差異不顯著。

2.5土壤理化性質(zhì)對(duì)細(xì)菌群落變化的影響

RDA結(jié)果（圖4）顯示，RDA1和RDA2可解釋83.71%的細(xì)菌群落變化，其中RDA1將對(duì)照與Ben、Caff、Fer和Syr處理的細(xì)菌群落組成區(qū)分，解釋了81.32%的細(xì)菌群落變化，而Phe與對(duì)照和其他酚酸處理處于不同象限，解釋了2.39%的細(xì)菌群落變化；土壤中的細(xì)菌群落厚壁菌門(mén)、藍(lán)菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)和疣微菌門(mén)相對(duì)豐度與土壤OM含量呈正相關(guān)，與pH、NO3-N和NH4-N呈負(fù)相關(guān)，而變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和糖細(xì)菌門(mén)相對(duì)豐度與pH、NO3-N和NH4-N呈正相關(guān)，與土壤OM含量呈負(fù)相關(guān)。

2.6酚酸處理后細(xì)菌群落對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的抵抗力

酚酸處理后，土壤對(duì)青枯菌的抵抗力減弱，QL-Rs1115的菌落數(shù)量均顯著高于對(duì)照（圖5）。不同的酚酸處理中，接種QL-Rs1115后，其數(shù)量保持增加趨勢(shì)，接種后第7 d，以Fer處理的QL-Rs1115數(shù)量最多，為6.29 lg CFU/g土；接種后第14、21和28 d，均以Syr處理的QL-Rs1115數(shù)量最多，分別達(dá)7.16、7.65和8.16 lg CFU/g土；Phe處理的QL-Rs1115數(shù)量始終低于同期其他酚酸處理，接種后第28 d，土壤中QL-Rs1115數(shù)量為7.24 lg CFU/g土，較Ben、Caff、Fer和Syr處理分別少9.84%、7.62%、7.42%和12.71%。

相關(guān)分析結(jié)果（圖6）顯示，土壤中QL-Rs1115數(shù)量與厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，而與變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、糖細(xì)菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、藍(lán)菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)和疣微菌門(mén)相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。

3討論

3.1苯丙酸、苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸和丁香酸有利于青枯菌的生長(zhǎng)繁殖

Li等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，烤煙根系分泌物中的苯甲酸和3-苯丙酸均能促進(jìn)青枯菌生長(zhǎng)。Zhao等（2018）研究結(jié)果顯示，對(duì)羥基苯甲酸、香草酸和對(duì)香豆酸等酚酸類(lèi)物質(zhì)可通過(guò)刺激尖孢鐮刀菌產(chǎn)生鐮刀菌酸來(lái)提高作物根腐病發(fā)病率。劉云露等（2019）研究表明，阿魏酸作為作物根際重要的酚酸類(lèi)物質(zhì)，大量累積會(huì)顯著降低作物自身保護(hù)酶的活性，使作物對(duì)病原菌的抵抗力下降，同時(shí)促進(jìn)尖孢鐮刀菌等有害真菌的代謝繁殖。本研究結(jié)果顯示，青枯菌可利用苯甲酸、苯丙酸、咖啡酸、阿魏酸和丁香酸5種酚酸類(lèi)物質(zhì)生長(zhǎng)繁殖，與Li等（2017）、Zhao等（2018）、劉云露等（2019）的研究結(jié)果相似。不同種類(lèi)和濃度的酚酸可直接抑制或促進(jìn)病原菌生長(zhǎng)（李慶凱等，2019；翟子翔等，2020），同時(shí)，酚酸類(lèi)物質(zhì)不僅有利于有害微生物生長(zhǎng)，也能促進(jìn)土壤不同微生物繁殖，但繁殖效果受其濃度的影響，如馬云華等（2005）在研究黃瓜根系分泌物時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃瓜根際分泌的阿魏酸、苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸和香草醛在低濃度時(shí)可刺激土壤真菌、放線菌和硝化細(xì)菌繁殖，但在高濃度時(shí)則出現(xiàn)抑制作用。本研究結(jié)果顯示，咖啡酸對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用顯著高于其他酚酸處理，與Gu等（2016）的研究結(jié)果存在差異，其研究發(fā)現(xiàn)咖啡酸可抑制青枯菌生長(zhǎng)，產(chǎn)生差異的原因可能在于二者的咖啡酸濃度不同，本研究的咖啡酸濃度為0.05μmol/g土，低于Gu等（2016）的0.5μmol/g土，出現(xiàn)低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的“濃度效應(yīng)”（Chen et al.，2011）。

3.2苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸和丁香酸能減少土壤有益細(xì)菌種群數(shù)量

番茄根際累積的苯丙酸、苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸和丁香酸可破壞土壤細(xì)菌群落多樣性，且各酚酸累積后，土壤細(xì)菌中的放線菌門(mén)相對(duì)豐度降低。放線菌門(mén)細(xì)菌可促進(jìn)土壤中對(duì)農(nóng)作物有益微生物的活動(dòng)，并且在代謝活動(dòng)中釋放多種物質(zhì)刺激植物細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂（Glick，2012），其相對(duì)豐度降低后會(huì)減少土壤有益菌數(shù)量，從而削弱抵抗病原菌入侵的能力。大量研究表明，酚酸類(lèi)物質(zhì)具有化感自毒作用，連作年限越長(zhǎng)，土壤細(xì)菌群落豐富度、均勻度及多樣性指數(shù)越低，苯甲酸和3-苯丙酸等酚酸類(lèi)物質(zhì)可明顯降低土壤微生物群落多樣性，在顯著增加有害微生物數(shù)量的同時(shí)極大降低有益微生物數(shù)量（劉艷霞等，2019；Bao et al.，2022）。Zhou和Wu（2012）研究發(fā)現(xiàn)，外源添加阿魏酸可影響植株根際土壤的微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)枯萎病的發(fā)生；添加外源丁香酸則可顯著降低土壤細(xì)菌總量，并顯著降低細(xì)菌形成生物膜的能力（Gu et al.，2020；嚴(yán)文輝等，2022）。龔靜等（2021）在研究連作馬鈴薯根系分泌物酚酸類(lèi)物質(zhì)與真菌多樣性的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，連作馬鈴薯分泌的酚酸類(lèi)物質(zhì)為對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、香豆酸和阿魏酸，其中丁香酸與引起早疫病的璉格霉屬相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，阿魏酸與節(jié)叢孢屬呈顯著正相關(guān)。谷益安等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，不管是蔬菜地土壤還是森林土壤，土壤微生物多樣性越豐富、青枯菌侵染的難度越大、繁殖的數(shù)量越少，微生物多樣性與青枯菌繁殖數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。受破壞的土壤微生物群落對(duì)病原菌入侵的抵抗力減弱，其原因可能在于連作根系分泌物通過(guò)抑制根際有益微生物豐度，使微生物群落產(chǎn)抑菌次生代謝物的能力減弱，同時(shí)根際有益微生物的豐度降低，釋放出大量生態(tài)位（營(yíng)養(yǎng)和空間資源等），從而增加土傳病原菌的入侵概率，而抗入侵能力較強(qiáng)的微生物群落可能更高效地利用土壤資源，使得病原菌因資源限制而無(wú)法成功定殖（Frid-leyet al.，2007；Jin et al.，2020；Xu etal.，2021）。

3.3土壤理化性質(zhì)變化影響細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群數(shù)量

本研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)，變形菌門(mén)相對(duì)豐度與pH、NO3-N和NH4-N呈正相關(guān)。有研究表明有機(jī)質(zhì)含量越高，其分解后形成的有機(jī)碳含量越高，對(duì)土壤細(xì)菌生物量的間接影響越大，在短期內(nèi)能顯著增加相關(guān)細(xì)菌的生物量（唐行燦和陳金林，2018），但作為細(xì)菌的青枯菌數(shù)量也會(huì)增加。大量研究表明，作物連作會(huì)降低土壤pH，導(dǎo)致土壤酸化，酸堿度對(duì)青枯病的發(fā)生有顯著影響，微酸性和中性土壤青枯病發(fā)病最嚴(yán)重，且青枯菌的運(yùn)動(dòng)性最強(qiáng)，隨著pH下降，當(dāng)土壤pH為5.5時(shí)，青枯菌成膜能力最強(qiáng)，表明土壤酸化有利于青枯菌的生長(zhǎng)和青枯病的發(fā)生（王貽鴻等，2018）。此外，pH降低會(huì)影響細(xì)菌的生理代謝和養(yǎng)分利用能力，使土壤細(xì)菌群落組成發(fā)生變化，易滋生病原菌，導(dǎo)致植物抵御病蟲(chóng)害的能力下降（孫雪婷等，2015；周宇等，2023）?？诐龋?016）研究也發(fā)現(xiàn)，土壤中變形菌門(mén)與土壤N含量呈正相關(guān)，本研究結(jié)果與之一致，土壤自身養(yǎng)分含量與門(mén)分類(lèi)水平下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有密切相關(guān)性，能激發(fā)土壤細(xì)菌豐度的改變。

4結(jié)論

番茄根際土壤累積的酚酸類(lèi)物質(zhì)可通過(guò)破壞土壤細(xì)菌群落多樣性來(lái)促進(jìn)青枯菌的入侵，土壤細(xì)菌多樣性越低、對(duì)青枯菌生長(zhǎng)繁殖的抵抗力越弱、越有利于病害的發(fā)生。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）