油茶種子法尼基焦磷酸酶基因的克隆與表達模式分析

關(guān)鍵詞：法尼基焦磷酸酶；角鯊烯；油茶；基因克??；基因表達分析

油茶Camelliaoleifera是中國特有的優(yōu)質(zhì)木本油料作物，至今已有2000多年的栽培歷史，主要種植在廣西、貴州、湖南等南方地區(qū)，目前已形成了近500萬hm2、上千億元產(chǎn)值的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)，成為精準脫貧和鄉(xiāng)村振興的特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)[1]，在保障國家糧油安全、生態(tài)安全方面發(fā)揮了重要作用。茶油的不飽和脂肪酸含量高達90%以上，是世界衛(wèi)生組織推薦的最優(yōu)質(zhì)食用植物油[2]。油茶在生長發(fā)育過程中會積累角鯊烯（100～700μg/g）等多種生理活性物質(zhì)[3-4]，其為評價茶油等級的重要指標，也是使茶油具有抗氧化、防輻射、抗炎癥及提高人體免疫力等多種生理功能的核心生物活性成分[5]。角鯊烯屬于三萜類化合物，常在動物（鯊魚、鯨魚）的肝油中高積累，植物和微生物中含量較少[6-7]。為避免獵殺動物，維護生態(tài)多樣性和有利于其可持續(xù)發(fā)展，選育和開發(fā)利用高角鯊烯植物資源是替代動物來源的最優(yōu)途徑。解析油茶種子角鯊烯合成積累機制，對提高植物油角鯊烯含量具有重要意義。有研究結(jié)果表明，在植物萜類生物合成途徑中，法尼基焦磷酸酶（farnesylpyrophosphatesynthetase，F(xiàn)PPS）催化牻牛兒基焦磷酸合成法尼基焦磷酸，在Mg2+和NADPH的參與下，角鯊烯合酶將2分子法尼基焦磷酸進一步縮合形成角鯊烯[8-9]。但目前關(guān)于油茶種子高積累角鯊烯的代謝途徑尚未完全闡明。因而，研究法尼基焦磷酸酶基因CoFPPS的特性及其在油茶種子角鯊烯生物合成過程中的作用對解析木本植物角鯊烯合成機制具有重要意義?；谇捌诘挠筒柁D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘CoFPPS基因，利用生物信息學(xué)方法分析該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和特性等，采用GCMS和qRT-PCR方法分析油茶種子發(fā)育期間的角鯊烯含量與CoFPPS表達量的關(guān)系，旨在為深入了解木本油茶角鯊烯合成代謝機制提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

以“油茶之鄉(xiāng)”貴州省銅仁市玉屏縣的高角鯊烯油茶品系‘WBL’為研究對象。在2021年7月22日、8月22日、9月21日，采摘處于不同發(fā)育期的果實，立即取出種仁放入液氮中備用。

試劑包括二氯甲烷（色譜純，Honywell公司），BSTFA（含1%TMCS，阿拉丁公司），角鯊烯標準品（99.5%）；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒均購自TAKARA公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2基因克隆和生物信息學(xué)分析

根據(jù)TAKARA公司植物總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，抽提油茶種仁總RNA后合成cDNA。根據(jù)油茶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)搜索CoFPPS基因的完整ORF，以ATGAGCGATCAAAAGTCGAA和CTACTTCTGCCTCTTATATA為上下游引物進行PCR擴增。反應(yīng)體系和程序參照試劑盒說明書。使用瓊脂糖凝膠電泳（1%）檢測PCR產(chǎn)物，測序后獲得目的基因序列。

采用ProtParam軟件分析CoFPPS蛋白的理化性質(zhì)[10]；采用ProtScale程序分析氨基酸序列的親/疏水性；采用TMHMM程序分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)[11]；使用Softberry網(wǎng)站進行亞細胞定位預(yù)測；使用SignalP在線網(wǎng)站預(yù)測蛋白信號肽；使用HNNMethods和SWISS-MODEL工具分別預(yù)測CoFPPS的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)[12]；利用NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTP分析保守結(jié)構(gòu)域。利用NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTP進行同源性分析，使用ClustalX和MEGA軟件進行多重序列比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.3角鯊烯含量檢測

將200mg油茶種仁粉末加入含2mL二氯甲烷的10mL離心管中，超聲40min后離心，取上清液至棕色樣品瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后加入180μLBSTFA試劑在80℃條件下衍生60min，再次加入270μL二氯甲烷，過0.22μm有機膜后備用。采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（GC680iQT，PE公司）進行分析，色譜柱為DB-5ms（30m×0.25mm×0.25μm），進樣口和傳輸線溫度分別為300、280℃，離子源為EI。升溫程序：起始溫度150℃；10℃/min升至320℃，保持28min；10℃/min升至340℃，保持5min。利用外標法進行定量分析。

1.4qRT-PCR基因表達量分析

采用PrimerQuest軟件設(shè)計CoFPPS基因的qRT-PCR引物，上游引物為CCGAGGCCTCTCTGTTATTG，下游引物為GGCAGCAATCAAACCAATCT。參照SYBRPremixExTaqTMⅡ試劑盒方法和ABI7500PCR儀（AppliedBiosystems公司）推薦程序進行qRT-PCR[13]。以油茶GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法分析目的基因的相對表達量[14]，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1油茶種子CoFPPS基因序列的獲得與克隆

在高角鯊烯油茶品系種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，搜索到1個具有完整開放閱讀框（openreadingframe，ORF）的CoFPPS基因（ID為comp65642_c1），cDNA序列全長為1458bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫中茶farnesylpyrophosphatesynthase1基因（XM_028249399.1）同源相似性達99.13%。進一步利用ORF全長引物擴增，回收產(chǎn)物測序序列與轉(zhuǎn)錄組中的目的基因序列一致，ORF全長1029bp，編碼342個氨基酸（圖1）。

2.2油茶種子CoFPPS蛋白的理化性質(zhì)

為了預(yù)測油茶CoFPPS基因的生物學(xué)功能，利用ProtParam在線軟件分析其編碼蛋白的理化特性。CoFPPS蛋白相對分子質(zhì)量為39332.14Da，分子式為C1781H2765N449O524S15，等電點為5.43。CoFPPS蛋白共含有20種氨基酸，其中亮氨酸含量最多（12%），其次為賴氨酸（9.6%），為穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)為33.37）。綜上，推測CoFPPS為酸性穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3CoFPPS蛋白的親/疏水性與跨膜結(jié)構(gòu)

疏水性分析對研究蛋白跨膜區(qū)、二級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)均具有重要意義，且有利于了解蛋白α螺旋及穩(wěn)定性。利用ProtScale程序分析油茶CoFPPS蛋白的親/疏水性分布。在蛋白的第202位堿基有最高值2.444（0以上區(qū)域為疏水區(qū)），疏水性最強，第101位有最低值-2.767，推測CoFPPS為親水性蛋白（圖2A）。CoFPPS肽鏈中無明顯跨膜區(qū)（圖2B）。

2.4CoFPPS蛋白的亞細胞定位與信號肽預(yù)測

利用Softberry網(wǎng)站ProtCompVersion9.0功能模塊預(yù)測CoFPPS蛋白可能存在于細胞質(zhì)。利用SignalP預(yù)測CoFPPS信號肽的可能值為0.0002，小于0.5即不存在信號肽，推測油茶CoFPPS蛋白是胞內(nèi)蛋白。

2.5CoFPPS蛋白的二級結(jié)構(gòu)與三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

CoFPPS蛋白的二級結(jié)構(gòu)由222個α-螺旋（64.91%），86個無規(guī)則卷曲（25.15%），10個β-轉(zhuǎn)角（2.92%）和24個伸展鏈（7.02%）組成（圖3A）。利用SWISS-MODEL工具獲得其三級結(jié)構(gòu)（圖3B），序列相似值為82.94%，GMQE值為0.86，QMEANDisCoGlobal值為（0.81±0.05）。

2.6CoFPPS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及進化樹分析

利用BIASTP網(wǎng)站分析CoFPPS蛋白的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域（圖4），發(fā)現(xiàn)其屬于聚異戊二烯合成酶家族蛋白，是類異戊二烯生物合成的關(guān)鍵酶，催化合成二磷酸法尼酶（farnesyldiphosphate，F(xiàn)PP），F(xiàn)PP是合成角鯊烯的直接前體[9]，可見，CoFPPS基因的表達模式與角鯊烯合成積累密切相關(guān)。

油茶CoFPPS與中華獼猴桃Actinidiachinensis的AcFPPS（PSR95258.1）、喜馬拉雅鳳仙花Impatiensglandulifera的IgFPPS（XP_047330909.1）、香葉天竺葵Pelargoniumgraveolens的PgFPPS（ASQ40931.1）、胡桃Juglansregia的JrFPPS（XP_018813512.1）、花生Arachisipaensis的AiFPPS（XP_016197600.1）和大豆Glycinemax的GmFPPS（XP_003534984.1）具有較高的同源性（圖5），且均屬于Isoprenoid-Biosyn-C1超家族，為類異戊二烯生物合成酶[15]。

基于MEGA繪制油茶等11個物種FPPS的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6），發(fā)現(xiàn)油茶CoFPPS與狹葉油茶Camellialanceoleosa的ClFPPS（KAI8009860.1）、朱紅大杜鵑Rhododendrongriersonianum的RgFPPS（KAG5550954.1）、羊躑躅Rhododendronmolle的RmFPPS（KAI8557429.1）、杜鵑Rhododendronsimsii的RsFPPS（KAF7146306.1）、越橘Vacciniumdarrowii的VdFPPS（KAH7843734.1）、三七Panaxnotoginseng的PnFPPS（AGS79228.1）和竹節(jié)參Panaxjaponicus的PjFPPS（AKN52395.1）處于同一分支，即同源性較高，可能具有相似的生物學(xué)功能。

2.7油茶種子的角鯊烯含量及CoFPPS基因表達量

高角鯊烯油茶品系‘WBL’發(fā)育期間的種仁角鯊烯含量分別為74.14μg/g（7月22日）、150.87μg/g（8月22日）、231.67μg/g（9月21日）（圖7A），呈上升趨勢。以相同的樣品作為試驗材料，經(jīng)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)CoFPPS基因呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，且與角鯊烯含量變化規(guī)律相似（圖7B），相關(guān)性系數(shù)為0.905。

3討論與結(jié)論

FPPS不僅是植物萜類物質(zhì)合成前體法尼基焦磷酸的關(guān)鍵合成酶，還是影響角鯊烯含量的上游合成酶之一[16-17]。本研究結(jié)果表明，油茶CoFPPS基因cDNA序列全長為1458bp，與茶FPPS1基因同源相似性為99.13%。ORF全長1029bp，編碼342個氨基酸，蛋白高級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。定位于細胞質(zhì)，無明顯的跨膜區(qū)和信號肽，這與關(guān)于金釵石斛Dendrobiumnobile的DnFPPS基因的研究結(jié)果相一致[18]。張成閣等[16]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，北美鵝掌楸Liriodendrontulipifera的FPPS1也無信號肽，且其高表達與花器官中的萜類代謝物含量有關(guān)。在構(gòu)建FPPS蛋白進化樹時發(fā)現(xiàn)，油茶CoFPPS與狹葉油茶ClFPPS的親緣關(guān)系最近，與朱紅大杜鵑RgFPPS、羊躑躅RmFPPS、杜鵑RsFPPS、越橘VdFPPS、三七PnFPPS和竹節(jié)參PjFPPS同源蛋白分布在相同簇中，而與花生、皂樹Quillajasaponaria和擬南芥Arabidopsisthaliana的親緣關(guān)系相對較遠，但CoFPPS與花生和大豆的FPPS序列仍具有相對保守的重疊區(qū)域，這說明FPPS在進化過程中保守性較強，其作為類異戊二烯生物合成的關(guān)鍵酶，也可催化合成FPP（角鯊烯的直接前體）[9]，在角鯊烯合成過程中具有重要作用[19-21]。此外，本研究中獲得的CoFPPS基因序列與前期報道的茶Camelliasinensis的FPPS基因有1個單核苷酸顛換和2個單核苷酸轉(zhuǎn)換[22]，這可能與山茶屬中油茶和茶的種子角鯊烯含量不同有關(guān)，可為開發(fā)單核苷酸多態(tài)性標記提供分子遺傳信息[23]。除此之外，GCMS和qRT-PCR分析結(jié)果表明，油茶種子發(fā)育期間的角鯊烯含量與FPPS基因表達量均呈現(xiàn)上升趨勢，即二者的動態(tài)變化規(guī)律相似。茶的FPPS基因上調(diào)表達可顯著提高釀酒酵母的法尼基焦磷酸（角鯊烯前體）的產(chǎn)量[24]，而且其表達與角鯊烯含量密切相關(guān)[25]?？梢姡珻oFPPS基因與油茶種子角鯊烯合成密切相關(guān)。但其調(diào)控機制和功能有待進一步驗證。

通過研究，成功從油茶種子中克隆出CoFPPS基因，其開放閱讀框為1029bp，編碼342個氨基酸，定位于細胞質(zhì)，蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。油茶FPPS蛋白序列與中華獼猴桃、喜馬拉雅鳳仙花、香葉天竺葵和胡桃的同源蛋白具有較高相似性，系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明油茶CoFPPS與狹葉油茶ClFPPS親緣關(guān)系最近。qRT-PCR分析結(jié)果表明，油茶種仁發(fā)育期間CoFPPS基因表達量呈現(xiàn)上升趨勢，且與角鯊烯含量變化規(guī)律相似，因此油茶CoFPPS基因表達與油茶種子角鯊烯合成密切相關(guān)。