不同保藏條件對草菇菌絲生長的影響

摘要要：【目的】為探索適宜草菇生產(chǎn)的菌株保藏10個月的環(huán)境條件，保證現(xiàn)有草菇菌株的優(yōu)良特性。【方法】以‘V9715’草菇為供試菌株，設置保藏溫度、保藏基質(zhì)、添加劑等3個保藏條件因素，從菌絲的萌發(fā)與生長、厚垣孢子數(shù)量及酶活力等方面分析評價保藏效果，探索不同保藏因素對草菇菌株保藏10個月保藏效果的影響。【結果】在不同保藏條件下保藏10個月，草菇菌絲的萌發(fā)和生長情況、厚垣孢子形成早晚、酶活力均存在差異。其中以保藏條件處理C（20℃+玉米芯+液體石蠟）的菌絲萌發(fā)率88.30%為最高，萌發(fā)天數(shù)為2 d，厚垣孢子形成時間是11.5 d，滿皿天數(shù)4 d為最短，菌絲生長速度1.14 cm/d為最快，其菌絲長勢強、氣生菌絲濃密度大、菌絲生物量中等；而保藏條件處理A（8℃+棉籽殼+無添加劑）的菌絲生物量最多（0.36 g），但與其他處理差異不顯著。處理C（20℃+玉米芯+液體石蠟）的菌絲細胞色素 P450 氧化還原酶（CPR）、多酚氧化酶（PPO）活力最低，分別為2.16 mg/g FW、36.91 U/g FW，總淀粉酶（AMY）活力最高，為11.88 mg/（min·g） FW。【結論】在處理C（20℃+玉米芯+液體石蠟）保藏條件下，保藏草菇菌株10個月的保藏效果最好。

關鍵詞：草菇；保藏條件；溫度；基質(zhì)；添加劑；菌絲；酶活力

中圖分類號：S646.13" " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " "文章編號：2095-5774（2024）06-0472-09

Influence of Different Preservation Conditions on the Growth of Volvariella volvacea Hyphae

Wu Zhenqiang

（Zhangzhou Institute of Agricultural Sciences，Zhangzhou，F(xiàn)ujian 363005，China）

Abstract：【Objective】To explore the environmental conditions suitable for the preservation of Volvariella volvacea strain for 10 months and ensure the excellent characteristics of the existing V. volvacea strains. 【Method】 Taking V. volvacea‘V9715’as the test strain，three preservation condition factors such as preservation temperature，preservation substrate，and additive were set. The preservation effect was analyzed and evaluated from aspects such as the germination and growth of hyphae，the number of chlamydospores，and enzyme activity to explore the influence of different preservation factors on the preservation effect of V. volvacea strains after 10 months of preservation.【Result】 After 10 months of preservation under different preservation conditions，there were differences in the germination and growth of V. volvacea hyphae，the formation time of chlamydospores，and enzyme activity. Among them，the germination rate of hyphae under preservation condition treatment 3 （20℃ + corncob + liquid paraffin） was the highest at 88.30%，the germination days were 2 days，the formation time of chlamydospores is 11.5 days，and growth days to fill petri dish were the shortest at 4 days. The hyphal growth rate was the fastest at 1.14 cm/d. The hyphae have strong growth potential，high density of aerial hyphae，and medium mycelial biomass while the mycelial biomass was the largest （0.36 g） under preservation condition treatment 1 （8℃ + cottonseed hull + no additive）. There is no significant difference among other treatments. The activities of cytochrome P450 oxidoreductase （CPR） and polyphenol oxidase （PPO） of hyphae under treatment 3 （20℃ + corncob + liquid paraffin） are the lowest，which were 2.16 mg/g FW and 36.91 U/g FW，respectively. The activity of total amylase （AMY） was the highest，which was 11.88 mg/（min·g） FW. 【Conclusion】 Under the preservation condition of treatment 3 （20℃ + corncob + liquid paraffin），the preservation effect of V. volvacea strains for 10 months was the best.

Key words：Volvariella volvacea；Preservation method；Temperature；Substrate；Additive；Mycelium；Enzyme activity

草菇（Volvariella volvacea（Bull.）Singer），又名蘭花菇、麻菇、貢菇、中國菇等［1］，分類學上屬于擔子菌亞門，層菌綱，無隔擔子，傘菌目，鵝膏菌科，草菇屬［2］。草菇味道鮮美，營養(yǎng)豐富，富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)成分，深受消費者喜愛［3］。目前福建漳州的草菇生產(chǎn)種‘V9715’在每年3、4月份從廣東微生物研究所購買，長途運輸過程中，母種易因溫度偏低及溫差大、缺氧造成菌株活力降低，或是在運輸中試管破裂，感染雜菌，不利于草菇生產(chǎn)者制備和選用優(yōu)良菌株，每年因菌種質(zhì)量問題造成的經(jīng)濟損失也不斷上升，給草菇產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，嚴重制約草菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展壯大。菌種保藏是保持菌種質(zhì)量穩(wěn)定性、防止菌種退化的重要手段［4-5］。菌種保藏方法及效果是種質(zhì)資源研究的重要方面［6］，但目前草菇菌種保藏技術研究較少，草菇長期液氮保藏［7］，由于成本過高，不能滿足草菇菌種的中短期保藏生產(chǎn)需求。目前廣泛采用的繼代培養(yǎng)法操作簡單，但費時、易污染、易退化。由于草菇是典型的高溫型食用菌［8］，不耐低溫保藏，研究熱點集中在低溫保護劑的篩選及保藏效果評價，如陳明杰等［9］采用添加10%的甘露醇溶液4℃保藏草菇菌種，保藏的菌種能快速復活且穩(wěn)定遺傳。王永紅等［10］采用海藻糖溶液4～6℃保藏草菇菌種可達8個月，趙風云等［11］采用甘露醇提高草菇退化菌種的抗氧化能力及恢復其生產(chǎn)性狀。張金霞［12］指出菌落形態(tài)特征、氣生菌絲、菌絲形態(tài)、酯酶同工酶譜、可溶性蛋白帶可用于鑒別草菇菌種保藏效果，但厚垣孢子作為草菇保藏效果指標鮮見報道。綜上所述，目前關于草菇菌株保藏的研究報道并不多，而且保藏處理方法也不統(tǒng)一，對保藏效果的評價更是單一，對于草菇菌株的保藏溫度、保藏基質(zhì)、添加劑問題，并沒有實質(zhì)性的系統(tǒng)研究。

本研究針對草菇菌株在保藏中難以保持遺傳性能穩(wěn)定的問題，以草菇‘V9715’為供試菌株，探索不同保藏因素對草菇菌株10個月保藏效果的影響，分析保藏溫度、保藏基質(zhì)、添加劑等3個因素對菌絲萌發(fā)率、萌發(fā)時間、生長速度，氣生菌絲濃密度、厚垣孢子數(shù)量及酶活力的影響，篩選適宜的保藏條件，保證現(xiàn)有草菇菌株的優(yōu)良特性，提高草菇的質(zhì)量和產(chǎn)量，促進菇農(nóng)的增收，有利于草菇產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展。

1材料與方法

1.1供試菌株

供試的草菇菌株‘V9715’，來源于廣東省微生物研究所。

1.2 保藏環(huán)境條件初篩

1.2.1基質(zhì)和添加劑組合篩選

在12℃保藏溫度下，配置棉籽殼、茶渣、玉米芯等3種保藏基質(zhì)和蒸餾水、液體石臘、無添加等不同添加劑的保藏條件處理組合，共9組組合，每種處理組合保藏12支試管。考察草菇保藏處理3個月下菌絲的萌發(fā)率、萌發(fā)時間和生長速度等指標，篩選合適的保藏條件組合。

1.2.2 不同基質(zhì)組合的保藏溫度篩選試驗

對1.2.1初選出的組合分別進行保藏溫度（4℃、8℃、12℃、16℃、20℃）梯度試驗，每個溫度處理保藏12支試管。不同的草菇保藏溫度處理3個月，篩選草菇菌絲萌發(fā)率高、萌發(fā)時間短、長速快的保藏溫度。

1.3不同保藏條件試驗處理

在1.2保藏環(huán)境條件初篩結果基礎上設計了不同保藏條件試驗處理，設置了處理A、處理B和處理C，并參考文獻［13］再設計1個處理，即共有4個草菇保藏，菌株保藏處理均為10個月，每種處理保藏12支試管。

1.3.1 草菇菌株活化處理

保藏10個月結束后，將保藏處理的試管取出，置于32℃培養(yǎng)室中自然回溫24 h，并轉(zhuǎn)接活化3次，重復3次。

1.3.2 保藏效果評價

經(jīng)活化處理的菌株分別接種于PDA平皿培養(yǎng)基中央，每個處理轉(zhuǎn)接3個培養(yǎng)皿，在32℃條件下培養(yǎng)，記錄并計算菌絲的萌發(fā)率［11，14］、萌發(fā)天數(shù)、滿皿天數(shù)、菌絲長勢、氣生菌絲的濃密度、菌絲生長速度、菌絲生物量、以及厚垣孢子的形成時間和數(shù)量，測定菌絲的漆酶（LACC）、纖維素酶（CMC）、總淀粉酶（AMY）、細胞色素P450氧化還原酶（CPR）、堿性蛋白酶（AKP）、多酚氧化酶（PPO）活力等指標。

1.3.3 菌絲生長情況測定

轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)一定時間，待菌絲長出后，在培養(yǎng)皿上進行劃線標記，3 d后劃另一條線。測量3 d氣生菌絲生長長度，計算氣生菌絲生長速度，測定氣生菌絲濃密度、菌絲生物量和厚垣孢子數(shù)量，每個保藏處理設3個重復。

氣生菌絲生長速度（cm/d）=3 d的氣生菌絲生長長度/3 d［15］。

氣生菌絲濃密度的測定［8］：每個處理菌絲長滿皿后觀察菌絲長勢強弱、氣生菌絲的濃密度，均分為3級，1、2、3級分別表示菌絲濃密度大、中、小。

菌絲生物量測定：待菌絲長滿皿后，取3塊

1 cm2長滿菌絲的菌絲塊置于100 mL液體PDA中，32℃培養(yǎng)5 d，過濾去除培養(yǎng)液，用ddH2O將菌絲體沖洗3遍后進行冷凍干燥處理，將凍干后的菌絲稱重即為菌絲生物量［16］。

厚垣孢子數(shù)量測定：將長滿草菇菌絲的培養(yǎng)皿放置半個月再觀測厚垣孢子數(shù)量，統(tǒng)計方法同氣生菌絲濃密度。

1.3.4 菌株酶活測定

保藏10個月后的草菇菌株用平板活化培養(yǎng)

5 d后刮取菌絲，測定LACC、CMC、AMY、CPR、AKP、PPO等酶活力，按照試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司）說明測定。

2 結果與分析

2.1 基質(zhì)和添加劑組合初篩結果

在12℃保藏溫度下保藏3個月，不同基質(zhì)和添加劑組合保藏草菇菌株，對菌絲萌發(fā)和生長的影響如表1所示。供試9種組合處理的菌絲萌發(fā)率為58.3%～91.67%，從高到低排序前2的組合為處理9-1（玉米芯+液體石蠟）和處理1-1（棉籽殼），二者萌發(fā)率均超過80%，處理2-1、處理3-1、處理5-1的萌發(fā)率均為75.00%；處理5-1（茶渣+蒸餾水）的菌絲生長速度最快，為0.99 cm/d；各處理的萌發(fā)天數(shù)為3.5～4.0 d，差異不大。因此，初篩出萌發(fā)率高、萌發(fā)時間短、生長速度快的3個組合，分別為玉米芯+液體石蠟、棉籽殼+無添加劑、茶渣+蒸餾水。

2.2 不同基質(zhì)組合的保藏溫度梯度試驗結果

棉籽殼+無添加劑組合的溫度梯度試驗結果如表2所示，萌發(fā)率最高的是保藏溫度8℃；萌發(fā)天數(shù)最短的是保藏溫度8℃、12℃；菌絲生長速度最快的是保藏溫度12℃。

茶渣+蒸餾水組合的溫度試驗結果如表3所示，萌發(fā)率最高的是保藏溫度12℃，最低的是4℃；萌發(fā)天數(shù)最短的是保藏溫度12℃；菌絲生長速度最快的是保藏溫度12℃。

玉米芯+液體石蠟組合的溫度試驗結果，如表4所示，萌發(fā)率最高的是保藏溫度20℃，最低的是4℃；萌發(fā)天數(shù)最短的是保藏溫度16℃、20℃；菌絲生長速度最快的是保藏溫度20℃。

因此3種基質(zhì)+添加劑組合最適保藏溫度分別為棉籽殼+無添加劑+8℃、茶渣+蒸餾水+ 12℃、玉米芯+液體石蠟+ 20℃，由此分別設計了草菇菌株保藏10個月環(huán)境條件的處理A、處理B、處理C，同時參考文獻［13］再設計出處理D，具體見表5。

2.3 不同保藏條件保藏效果評價

2.3.1不同保藏條件對草菇菌絲生長的影響

不同保藏條件保藏10個月再經(jīng)轉(zhuǎn)接活化后，對草菇菌絲萌發(fā)、菌絲長勢、滿皿天數(shù)、厚垣孢子形成時間數(shù)量、生長速度等影響如表6所示。不同方法保藏菌株效果有一定差異。4種處理的菌絲萌發(fā)率為61.34%～88.30%，萌發(fā)天數(shù)為2.0～3.5 d，萌發(fā)率最高、萌發(fā)天數(shù)最短的是處理C、處理D；滿皿天數(shù)為4～8 d，并以處理C的滿皿時間最短，與處理D差異不顯著，與處理A、處理B差異極顯著；菌絲長勢強的是處理A、處理B，菌絲長勢一般的是處理C、處理D；氣生菌絲濃密的是處理A、處理B，氣生菌絲稀疏的是處理C、處理D；厚垣孢子形成時間為11.5～13.5 d，形成時間最短的是處理C、處理D，與其它處理差異極顯著；菌絲生長速度為0.94～1.14 cm/d，以處理C的生長速度最快，與處理D差異不顯著，與其它2個處理的差異顯著，但未達到極顯著水平；菌絲生物量為0.09～0.36 g，以處理A的菌絲生物量最多，但與其它3個處理的差異不顯著。

綜上所述，處理C（20℃+玉米芯+液體石蠟）萌發(fā)率最高（88.30%）、萌發(fā)天數(shù)最短（2 d）、菌絲長勢強、氣生菌絲濃密度大，滿皿天數(shù)最短（4 d）、厚垣孢子形成時間最短（11.5 d），菌絲生長速度最快（1.14 cm/d）。

2.3.2不同保藏條件對草菇菌株酶活力的影響

不同保藏條件對草菇菌株的漆酶（LACC）、纖維素酶（CMC）、總淀粉酶（AMY）、細胞色素 P450 氧化還原酶（CPR）、堿性蛋白酶（AKP）、多酚氧化酶（PPO）活力有一定的影響（見表7）。4種處理的漆酶（LACC）活力為8.84～

12.81 nmol/（min·g） FW，以處理D最高，與處理A差異不顯著，但都顯著高于處理B和處理C。纖維素酶（CMC）活力為1 229.08～1 284.01 μg/（min·g）FW，以處理A最高，各處理間均無顯著性差異。AMY活力為11.38～11.88 mg/（min·g）FW，以處理

C最高，但與處理B、處理D差異不顯著。細胞色素

P450 氧化還原酶（CPR）活力為2.16～3.04 mg/g FW，

以處理A和處理B極顯著高于處理C和處理D。堿性蛋白酶（AKP）活力為3.02～12.97 nmol/（min·g）" FW，以處理4最高，與處理B、處理C差異達極顯著水平，與處理A差異不顯著。多酚氧化酶（PPO）活力為36.91～42.80 U/g FW，以處理A最高，與處理B、處理D差異不顯著，但顯著高于處理C。

綜上所述，處理C表現(xiàn)總淀粉酶（AMY）活力最高，纖維素酶（CMC）、細胞色素P450氧化還原酶（CPR）、多酚氧化酶（PPO）活力最低，總淀粉酶活性可作為菌絲活力的指標［17］，細胞色素P450的CPR、PPO酶活力與草菇菌株的應激反應機制有關［18-19］，說明處理C菌絲活力最強，保藏條件適宜。

3 小結與討論

本試驗通過設置不同保藏條件保藏草菇菌株10個月，發(fā)現(xiàn)草菇菌絲萌發(fā)情況、生長速度、氣生菌絲濃密度、菌絲長勢、厚垣孢子形成時間、酶活力等存在差異。處理C（20℃+玉米芯+液體石蠟）表現(xiàn)萌發(fā)率最高、萌發(fā)天數(shù)最短、菌絲長勢強、氣生菌絲濃密度大，滿皿天數(shù)最短、厚垣孢子形成時間最短，菌絲生長速度最快，說明處理C的菌絲活力最強，保藏條件適宜。分析原因為處理C的保藏基質(zhì)為玉米芯，玉米芯富含纖維素、半纖維素等營養(yǎng)成分，且具有良好的透氣性和保水性，有利于氧氣的供應和水分的保持，為草菇菌絲的生長創(chuàng)造了適宜的環(huán)境條件，草菇菌絲健壯、長勢好，有利于保藏后菌絲的恢復生長。保藏溫度為20℃，草菇菌株不耐低溫，低溫保藏會導致菌絲死亡，20℃保藏溫度較適宜，有利于菌絲活力的保持。保護劑為液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌株死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用，使菌體處于生長和代謝近乎停止的狀態(tài)，因此可確保保藏菌株的質(zhì)量和活力。

處理C總淀粉酶（AMY）活力最高，纖維素酶（CMC）、細胞色素P450氧化還原酶、多酚氧化酶活力最低；處理A纖維素酶（CMC）、細胞色素P450氧化還原酶（CPR）、多酚氧化酶（PPO）活力最高，總淀粉酶（AMY）活力最低。分析原因可能是淀粉酶活性與菌絲活力相關［17］，保藏后轉(zhuǎn)接至新的 PDA 培養(yǎng)基后，菌絲為了快速適應新環(huán)境并獲取能量，會增強淀粉酶的分泌，提高淀粉酶活性來分解培養(yǎng)基中的淀粉，以滿足自身的生長和代謝需求。因此處理C的菌絲活力強，總淀粉酶（AMY）活力也最高。纖維素酶（CMC）活力與保藏基質(zhì)有關，棉籽殼比玉米芯纖維素含量高，轉(zhuǎn)接至新的PDA 培養(yǎng)基中，促使菌絲產(chǎn)生了更多的纖維素酶。因此處理A的纖維素酶（CMC）比處理C高。細胞色素P450 氧化還原酶（CPR）參與多種生物代謝過程［18］，包括菌絲應對外界脅迫。多酚氧化酶（PPO）活力變化影響菌絲的防御能力以及與周圍環(huán)境的相互作用［19］。當草菇菌株處于不適宜生長的溫度條件（如 8℃）時，為了應對這種不利環(huán)境，可能會分泌更多的細胞色素P450 氧化還原酶（CPR）、多酚氧化酶（PPO），可能是草菇菌株的一種應激反應機制。因此處理C

的保藏條件較適宜，細胞色素P450 氧化還原酶（CPR）、多酚氧化酶（PPO）最低，相反的，處理A的保藏條件不適宜草菇菌絲生長，因此CPR、PPO酶活最高。

本試驗處理C即草菇菌株保藏10個月、保藏基質(zhì)為玉米芯、保護劑為液體石蠟、保藏溫度20℃保藏效果最佳，可進一步擴大數(shù)量驗證。本試驗利用液體石蠟、蒸餾水作為保護劑保藏草菇，液體石蠟作為保護劑，菌絲成活率高，回菌后菌絲生長正常。也有學者指出以甘油與蔗糖溶液［20］、PEG6000［21］、蔗糖、甲醇、丙三醇復合配方［22］、海藻糖［23］等作為保護劑保藏食用菌效果好。不同種類的食用菌菌株需要的保護劑各有差異，在草菇菌株上是否也適用，有待于進一步驗證。

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（責任編輯：鐘海豐）

DOI：10.20023/j.cnki.2095-5774.2024.06.004

收稿日期：2024-03-25

基金項目：國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-20）；漳州市自然科學基金項目（ZZ2023J23）

作者簡介：吳振強（1977-），男，高級農(nóng)藝師，主要從事食用真菌栽培研究，E-mail：wuzhenqiang77@sina.com