高效液相色譜法測(cè)定壯藥伊血安無糖型顆粒中異綠原酸A和異綠原酸B的含量

摘要：目的：優(yōu)化伊血安無糖型顆粒檢驗(yàn)方法，并建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中的異綠原酸A、異綠原酸B。結(jié)果：建立伊血安無糖型顆粒中的異綠原酸A、異綠原酸B含量測(cè)定方法，異綠原酸A在0.023 0～0.735 4 μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回收率在98.16%～103.25%，RSDlt;2.0%；異綠原酸B在0.025 3～0.809 3 μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回收率在98.83%～102.82%，RSDlt;2.0%。結(jié)論：優(yōu)化了伊血安無糖型顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，含量測(cè)定操作方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可有效控制本品質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：伊血安無糖型顆粒；滇桂艾納香；異綠原酸A；異綠原酸B；含量

滇桂艾納香是伊血安無糖型顆粒的君藥，發(fā)揮活血止血作用的主藥材，現(xiàn)代研究資料表明，酚酸類化合物是滇桂艾納香的主要活性成分之一。滇桂艾納香具有活血、止血、利水的功效，而滇桂艾納香的止血活性［1］成分為乙酸乙酯提取物中的酚酸類化合物，說明異綠原酸A、異綠原酸B與滇桂艾納香止血功效密切相關(guān)。本研究以異綠原酸A、異綠原酸B作為伊血安無糖型顆粒中滇桂艾納香的指標(biāo)性成分，完善伊血安無糖型顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為更好地監(jiān)控和評(píng)價(jià)伊血安無糖型顆粒質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器

十萬分之一電子分析天平（XS205，瑞士Mettler Toledo公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200E型，昆山市超聲儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S6，江蘇金怡儀器科技有限公司）；高效液相色譜儀：Waters 1525二元梯度泵、Waters 2489型紫外檢測(cè)儀、Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器、Breeze2色譜工作站；色譜柱：大連依利特C18柱（5 μm，4.6×250 mm）、Waters Xbridge-C18柱（5 μm，4.6×250 mm）和ECOSIL ODS-C18柱（5 μm，4.6×250 mm）。

1.2試劑與試藥

異綠原酸A（純度＞98%、RFS-Y06801911011，供含量測(cè)定用，成都瑞芬思生物科技有限公司）；異綠原酸B（純度≥98%、DST 210625—037，供含量測(cè)定用，樂美天醫(yī)藥/德思特生物技術(shù)有限公司）；滇桂艾納香對(duì)照藥材（批號(hào)121647—201602，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；伊血安無糖型顆粒（批號(hào)：220809、220810、220811、220812、220813、220814、220815、220816、220401、200301、220116），陰性對(duì)照樣品，均由廣西萬壽堂藥業(yè)有限公司提供；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水。

2含量測(cè)定

2.1色譜條件

色譜柱：Waters Xbridge-C18柱（5 μm，4.6×250 mm）；流動(dòng)相：乙腈0.1%磷酸水溶液（13∶87）；柱溫：25 ℃；最大檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；進(jìn)樣量：10 μL；理論板數(shù)按異綠原酸A峰計(jì)算不低于3 000。

2.2溶液的制備

稱取已研成細(xì)粉的伊血安無糖型顆粒0.5 g，精確稱定質(zhì)量，置于具塞錐形瓶中，精確加入60%的甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，置于超聲儀中超聲處理（功率320 W，頻率80 kHz）30 min，取出放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，振搖使均勻，過濾，濾液用微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

分別取異綠原酸A、異綠原酸B對(duì)照品適量，加甲醇制成20 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

取缺滇桂艾納香的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法進(jìn)行提取制成陰性供試品溶液。

2.3專屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，異綠原酸A和異綠原酸B的含量測(cè)定均不受溶劑、其他藥材等因素干擾，表明方法專屬性良好。

2.4線性關(guān)系考察［2］

取適量異綠原酸A、異綠原酸B配制成6種不同濃度的混合對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，分別以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y1=3 229 409.863 5X1+6 523.860 7（R2=1）；Y2=3 420 779.135 1X2+9 302.333 3（R2=0.999 68）。

結(jié)果表明，異綠原酸A和異綠原酸B進(jìn)樣量分別在0.023 0～0.735 4 μg和0.025 3～0.809 3 μg范圍內(nèi)峰面積線性良好。

2.5精密度試驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。

結(jié)果顯示，供試品中異綠原酸A和異綠原酸B峰面積的RSD分別為1.66%和1.24%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)［3］

取伊血安無糖型顆粒（批號(hào)：220813），制備成供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h時(shí)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算RSD值。

結(jié)果顯示，異綠原酸A和異綠原酸B的峰面積RSD值為2.26%和0.94%（n=5），表明供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批伊血安無糖型顆粒（批號(hào)：2208013）適量，研細(xì)，分別取6份樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取、測(cè)定，計(jì)算供試品溶液中異綠原酸A和異綠原酸B的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)及RSD值。

結(jié)果顯示，供試品中異綠原酸A和異綠原酸B平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.041 0 mg/g和1.810 2 mg/g，RSD值分別為2.47%和0.92%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取已測(cè)知含量的伊血安無糖型顆粒（批號(hào)220813，異綠原酸A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.041 0 mg/g、異綠原酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.798 8 mg/g）各0.25 g，共6份。分別取0.34 mL異綠原酸A（質(zhì)量濃度為0.766 mg/mL）和0.54 mL異綠原酸B（質(zhì)量濃度為0.842 mg/mL）加入樣品中，混勻，制備成供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果顯示，異綠原酸A加標(biāo)回收率為98.16%～103.25%，RSD 1.82%；異綠原酸B加標(biāo)回收率為98.83%～102.82%，RSD 1.31%。

2.9耐用性試驗(yàn)

取伊血安無糖型顆粒（批號(hào)：220813）適量，制備成供試品溶液，分別考察Waters Xbridge-C18柱（5 μm，4.6×250 mm），ECOSIL ODS-C18柱（5 μm，4.6×250 mm），大連依利特C18柱（5 μm，4.6×250 mm）測(cè)定異綠原酸A、異綠原酸B的含量。結(jié)果顯示，異綠原酸A、異綠原酸B含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的RSD分別為2.28%和2.02%，表明耐用性好。

3討論

3.1指標(biāo)成分選擇

滇桂艾納香為伊血安無糖型顆粒中的君藥，是發(fā)揮活血止血作用的主藥材之一，主要含有酚酸類、黃酮類、甾醇類、多糖類及揮發(fā)性成分等化學(xué)成分［4］，其主要活性成分為酚酸類化合物，主要包括原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等。蘇宏娜等研究推測(cè)異綠原酸A和異綠原酸B是滇桂艾納香的主要化學(xué)成分和活性成分，兩個(gè)化合物為同分異構(gòu)體，都具有抗血小板聚集、抗菌、消炎的作用［5］。同時(shí)，采用LC-MS分析滇桂艾納香的化學(xué)成分。故本研究將異綠原酸A和異綠原酸B作為HPLC定量的研究指標(biāo)成分。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用紫外可見分光光度計(jì)在200～400 nm進(jìn)行掃描，異綠原酸A、異綠原酸B在330 nm處均有最大吸收，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，以330 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)測(cè)定干擾最小，故將檢測(cè)波長(zhǎng)定為330 nm。

3.3提取溶劑的選擇

考察了30%甲醇、60%甲醇、甲醇和無水乙醇對(duì)供試品中異綠原酸A、異綠原酸B的提取效率。結(jié)果表明，60%甲醇溶液提取效率最高，故選擇60%甲醇溶液為提取溶劑。

3.4提取方法的選擇

考察了60%甲醇作為溶劑超聲1 h、回流提取1 h和浸提過夜對(duì)供試品中異綠原酸A、異綠原酸B的提取效率。結(jié)果表明，用超聲提取效率最高，故選擇超聲為提取方式。

3.5提取時(shí)間的選擇

考察了超聲15 min、30 min、60 min、90 min和120 min對(duì)供試品中異綠原酸A、異綠原酸B的提取效率。結(jié)果表明，超聲提取60 min提取率最高，但與提取30 min得到的含量相差不大，故為了節(jié)約時(shí)間，選擇提取時(shí)間為30 min。

4結(jié)論

針對(duì)伊血安無糖型顆粒中的滇桂艾納香，建立異綠原酸A和異綠原酸B的HPLC定量測(cè)定方法，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、陰性無干擾、專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可用于伊血安無糖型顆粒的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

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［3］姜建萍，王美琪，馬雯芳，等.基于多種分析模式構(gòu)建壯藥滇桂艾納香HPLC指紋圖譜［J］.中藥材，2018，41（1）：124128.

［4］姜建萍，王美琪，馬雯芳，等.HPLC-DAD波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地滇桂艾納香中4種成分的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2018，24（3）：7276.

［5］蘇宏娜，李學(xué)學(xué)，楊正明，等.壯藥材滇桂艾納香的研究進(jìn)展及其質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測(cè)分析［J］.中草藥，2022，53（7）：22552267.