多指標(biāo)響應(yīng)面-滿意度函數(shù)優(yōu)化秦嶺龍膽提取工藝研究

摘要 ［目的］優(yōu)化秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的共提取條件。［方法］在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取最佳因素水平，采用響應(yīng)面-滿意度函數(shù)優(yōu)選料液比、提取時(shí)間、超聲頻率對(duì)龍膽苦苷和獐牙菜苦苷提取率的影響。［結(jié)果］秦嶺龍膽中2個(gè)成分的共提最優(yōu)條件為提取時(shí)間26 min、料液比1∶21（g：mL）、超聲頻率58 kHz，在此條件下，龍膽苦苷、獐牙菜苦苷的提取率分別為0.312%、0.258%，分別與預(yù)測(cè)值（0.326%、0.270%）接近。［結(jié)論］響應(yīng)面-滿意度函數(shù)可用于秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取工藝的優(yōu)化，該方法快速、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞 秦嶺龍膽；龍膽苦苷；獐牙菜苦苷；響應(yīng)面法；滿意度函數(shù)；共提取條件

中圖分類(lèi)號(hào) R 284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）23-0162-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.035

Study on Optimization of Extraction Process from Gentiana apiata by Multi-index Response Surface-satisfaction Function

XU Hai-yan1，HOU Min-na1，CHEN Yan-bin2 et al

（1.Medical College，Shaanxi Institute of International Trade，Xianyang，Shaanxi 712046;2.Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Xi’an，Shaanxi 710075）

Abstract ［Objective］ To optimize the co-extraction conditions of gentiopicroside and swertiamarin from Gentiana apiata.［Method］On the basis of single factor experiments，the optimal factor level was selected，and the response surface-satisfaction function was used to optimize the effects of solid-liquid ratio，extraction time and ultrasound frequency on the extraction rates of gentiopicroside and swertiamarin.［Result］The optimal conditions for co-extraction of two components from Gentiana apiata in Qinling Mountains were extraction time of 26 minutes，solid-liquid ratio of 1∶21 （g∶mL），and ultrasonic frequency of 58 kHz.Under these conditions，the extraction rates of gentiopicroside and swertiamarin were 0.312% and 0.258%，respectively，which were close to the predicted values of 0.326% and 0.270%，respectively.［Conclusion］The response surface satisfaction function can be used to optimize the co-extraction process of gentiopicroside and swertiamarin from Gentiana apiata in Qinling Mountains.This method is fast，simple，stable and feasible.

Key words Gentiana apiata;Gentiopicroside;Swertiamarin;Response surface methodology;Satisfaction function;Co-extraction condition

基金項(xiàng)目 陜西省教育廳青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)科研計(jì)劃項(xiàng)目（21JP011）；陜西省科技廳項(xiàng)目（2021SF-365）；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（S202113123008）。

作者簡(jiǎn)介 許海燕（1977—），女，陜西咸陽(yáng)人，副教授，碩士，從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。*通信作者，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，從事藥物分析研究。

收稿日期 2023-12-14；修回日期 2024-01-30

秦嶺龍膽（Gentiana apiata）別名茱苓草、太白龍膽，屬龍膽科龍膽屬植物，秦巴山區(qū)特有藥用資源，生長(zhǎng)于高山草甸中，夏、秋花期采收，民間以全草入藥，主要用于頭暈失眠、月經(jīng)不調(diào)、小便不利等病癥［1-2］。有研究表明秦嶺龍膽中含有萜類(lèi)、酚酸類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、皂苷類(lèi)、糖類(lèi)等成分［3-4］。其中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷屬萜類(lèi)中的環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物，為秦嶺龍膽中的主要化學(xué)成分，藥理試驗(yàn)表明，該類(lèi)成分具有抗腫瘤、抗炎、降血糖、保肝、神經(jīng)保護(hù)等作用［5-6］。查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷提取方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，而且目前對(duì)于中藥的提取工藝研究多以單一化合物為指標(biāo)，少有多指標(biāo)聯(lián)用考察提取工藝，這就增加了提取時(shí)溶劑、時(shí)間等能耗的浪費(fèi)，不利于提取過(guò)程中綠色節(jié)能環(huán)保。因此，筆者以秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的提取率為共提取評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面-滿意度函數(shù)優(yōu)化提取工藝，確定最佳工藝參數(shù)，建立共提取方法，以期為秦嶺龍膽的提取及進(jìn)一步發(fā)展提供參考依據(jù)，也為其他中藥材提取過(guò)程中的節(jié)能綠色環(huán)保提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材 秦嶺龍膽藥材購(gòu)自陜西省眉縣藥材公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)楊新杰教授鑒定為秦嶺龍膽（Gentiana apiata N.E.Brown）的干燥帶花全草。

1.2 主要儀器與試劑 電子天平（京制00000246）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE）；高效液相色譜儀（Waters e2695）。 龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品（PS010423）、獐牙菜苦苷標(biāo)準(zhǔn)品（PS012298），對(duì)照品純度均不低于98.5%；甲醇（色譜純）；磷酸、無(wú)水乙醇、甲醇，均為分析純。

1.3 龍膽苦苷、獐牙菜苦苷含量測(cè)定

1.3.1 藥材預(yù)處理。

將秦嶺龍膽藥材處理干凈，放置烘箱 （60 ℃） 中干燥，再用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎完成后過(guò)篩 （80目） ，置于密封袋中備用。

1.3.2 色譜條件。

色譜柱為Diamonsil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.2% 磷酸溶液，B為10%甲醇溶液。洗脫采用梯度洗脫，各流動(dòng)相的比例分別為0～10 min，A（90% → 72%）、B（10% → 28%）；10 ～ 30 min，A（72% → 71%）、B（28% → 29%）。流速1 mL/min；波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL［7］。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

精密量取適量的龍膽苦苷和獐牙菜苦苷對(duì)照品，純甲醇溶解后濃度分別為0.130和0.265 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。移取混合對(duì)照品溶液1、3、5、7、9、11 mL，純甲醇稀釋10倍，以“1.3.2”色譜條件進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 龍膽苦苷（獐牙菜苦苷）提取率的測(cè)定。

精密稱(chēng)取適量處理干凈的藥材粉末，采用超聲法提取，甲醇為溶劑，過(guò)濾，濾液按“1.3.2”色譜條件分別測(cè)定秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量，按以下公式計(jì)算二者的提取率。

提取率=提取液中龍膽苦苷（獐牙菜苦苷）含量秦嶺龍膽質(zhì)量× 100%

1.4 單因素試驗(yàn) 該試驗(yàn)使用超聲輔助提取法，以甲醇為提取溶劑，采用控制單一變量法，在保證其他條件不變的情況下，分別考察料液比、提取時(shí)間、超聲頻率3個(gè)因素對(duì)同時(shí)提取秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷提取率的影響。

1.5 滿意度函數(shù)

滿意度函數(shù)用于優(yōu)化多種目標(biāo)成分，可將多響應(yīng)值的優(yōu)化轉(zhuǎn)變?yōu)閱雾憫?yīng)值的優(yōu)化，將不同的響應(yīng)值轉(zhuǎn)化為0～1的無(wú)量綱數(shù)值，數(shù)值趨近于1時(shí)的效果最好［8-9］。該試驗(yàn)選擇龍膽苦苷提取率和獐牙菜苦苷提取率作為2個(gè)不同響應(yīng)值，通過(guò)優(yōu)化料液比、提取時(shí)間、超聲功率3個(gè)單一因素以獲得總體滿意度值，旨為找到適合的優(yōu)化提取工藝條件。滿意度函數(shù)如下：

Di（Yi）=0Yi（x）≤Yimin

Yi（x）-YiminYimax-YiminYimin<Yi（x）≤Yimax

1Yi（x）>Yimax

D=d1w1×d2w2×d3w3×…×diwi

式中：Di（Yi）為總體滿意度；Yi（x）為響應(yīng)值；Yimin為最小響應(yīng)值；Yimax為最大響應(yīng)值。wi表示各響應(yīng)值權(quán)重，各響應(yīng)值權(quán)重之和為1，即w1＋w2＋…+wi=1［10］，該研究中只涉及2個(gè)因素，故只有2個(gè)權(quán)重，即w1（龍膽苦苷權(quán)重）和w2（獐牙菜苦苷權(quán)重），由于這2個(gè)成分均為藥材中的主要活性成分，故設(shè)定w1、w2均為0.5。

1.6 響應(yīng)面分析

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，結(jié)合Box-Behnken法，設(shè)定料液比（A）、提取時(shí)間（B）、超聲頻率（C）3個(gè)影響因素，利用響應(yīng)面軟件對(duì)龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到二者的提取率，將二者提取率利用滿意度函數(shù)轉(zhuǎn)化為共提取總體滿意度，再以總體滿意度為響應(yīng)值，分析數(shù)據(jù)結(jié)果，得到共提取最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜峰的建立

供試品與對(duì)照品溶液分別按照“1.3.2”色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定結(jié)果如圖1所示，HPLC圖基線平穩(wěn)，樣品中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷與其他峰分離情況較好，保留時(shí)間分別為16.168、14.889 min，與對(duì)照品的保留時(shí)間（16.096和14.843 min）分別僅相差0.072和0.046 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.2.1 龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。從龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）可以看出，龍膽苦苷濃度為0.13 ～1.46 mg/mL時(shí)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=1 322 116.81x+7 114.05（R2=0.999 8）。

2.2.2 獐牙菜苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

從獐牙菜苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）可以看出，獐牙菜苦苷濃度為0.26 ～2.88 mg/mL時(shí)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=642 755x+9 181.8（R2=0.999 2）。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 提取時(shí)間對(duì)龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取的影響。

設(shè)定料液比1∶10（g∶mL）、超聲頻率100 kHz，考察不同提取時(shí)間（5、10、15、20、25、30 min）對(duì)秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷提取率的影響。從圖4a可以看出，提取時(shí)間25 min之前龍膽苦苷和獐芽菜苦苷的提取率升高明顯，隨后提取率略有下降，可能是25 min左右時(shí)藥材內(nèi)外活性成分濃度達(dá)到平衡，隨著時(shí)間延長(zhǎng)活性成分被破壞或者發(fā)生了變化，故選擇25 min為最佳提取時(shí)間。

2.3.2 料液比對(duì)龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取的影響。

固定超聲頻率100 kHz、提取時(shí)間25 min，考察不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）對(duì)秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐芽菜苦苷提取率的影響。從圖4b可以看出，龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的提取率隨著溶液體積的增加也逐漸增高，1∶20的料液比后提取率增加不太明顯，可能此料液比時(shí)龍膽苦苷和獐牙菜苦苷被溶解完全，故選擇1∶20作為最佳料液比。

2.3.3 超聲頻率對(duì)龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取的影響。

在料液比1∶20、提取時(shí)間25 min條件下，考察不同超聲頻率（50、60、70、80、90、100 kHz）對(duì)秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷提取率的影響。從圖4c可以看出，龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的提取率與超聲頻率呈相關(guān)性，隨著超聲頻率的增加而增大， 提取率在70 kHz時(shí)達(dá)到峰值，而后下降，超聲頻率太高，可能有效成分被破壞，故最佳超聲頻率選擇70 kHz。

2.4 響應(yīng)面-滿意度函數(shù)優(yōu)化分析

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以響應(yīng)面軟件對(duì)共提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、超聲頻率（C）為自變量，以總體滿意度（D）為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表1。

利用Design-Expert 8.0.5 b軟件對(duì)秦嶺龍膽中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷共提取工藝優(yōu)化條件進(jìn)行分析，以2種成分的提取率總體滿意度（D）為響應(yīng)值，得到二次多項(xiàng)回歸方程為

D=-12.897 71+0.691 08A+0.297 88B+0.050 56C+6.07×10-4AB+1.78×10-5AC - 1.71×10-4BC-0.013 59A2-7.048 90×10-3B2-3.770 76×10-3C2

對(duì)滿意度進(jìn)行回歸方差分析，結(jié)果表明（表2），模型及失擬項(xiàng)的P值分別為0.000 4和0.267 1，說(shuō)明模型顯著而失擬項(xiàng)不顯著，模型擬合度高，得到的二次回歸方程預(yù)測(cè)性較佳。此外，從表3中可直觀看出，各影響因素一次項(xiàng)P值均小于0.05，說(shuō)明各因素對(duì)秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的提取率影響均顯著。各交互項(xiàng)的P值均大于0.05，說(shuō)明各因素之間互相沒(méi)有影響。

調(diào)整確定系數(shù)R2adj=0.907 9，表明90.79%的響應(yīng)值可用該模型解釋。從一次項(xiàng)P值結(jié)合F值來(lái)看，各因素影響滿意度的次序?yàn)镃>A>B。

從3個(gè)影響因素兩兩交互作用的響應(yīng)面與等高線圖（圖5）可以看出，各因素的最佳范圍分別為提取時(shí)間（A）24～28 min、料液比（B）1∶19～1∶23、超聲頻率（C）55～70 kHz。等高線圖顯示，C的曲面較A和B曲面陡峭，而A的曲面較B陡峭，說(shuō)明C對(duì)提取率的影響強(qiáng)于A，而A強(qiáng)于B［11］，此分析與表3結(jié)果吻合。

通過(guò)Design-Expert 8.0.5 b軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到最優(yōu)工藝為提取時(shí)間25.77 min、料液比1∶21.32、超聲頻率57.53 kHz，在此工藝下，龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的提取率分別為0.326%、0.270%，總體滿意度為0.847 6。為了試驗(yàn)的可操作性，修正秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取條件為提取時(shí)間26 min、料液比1∶21、超聲頻率58 kHz，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)性試驗(yàn)，得到此工藝下龍膽苦苷和獐牙菜苦苷平均提取率分別為0.312%和0.258%，比預(yù)測(cè)值分別相差0.014百分點(diǎn)、0.012百分點(diǎn)，總體滿意度為0.810 6，與預(yù)測(cè)者僅相差0.037。各試驗(yàn)值與模擬值接近，表明該模型擬合度較高，可用于秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

超聲提取法是利用超聲波的空化作用，將植物中的化學(xué)成分快速提取出來(lái)的方法，相比較傳統(tǒng)的提取方法其具有提取溫度低、時(shí)間短、提取效率高等特點(diǎn)，目前常用于中藥材的提?。?2］。甲醇作為一種親脂親水性溶劑，可將植物中絕大多數(shù)活性成分提取出來(lái)，常作為提取溶劑使用。龍膽苦苷和獐牙菜苦苷為秦嶺龍膽中的活性成分，其藥理活性已得到證實(shí)，如具有治療肝臟疾病、代謝、抗炎鎮(zhèn)痛等方面作用，在臨床上應(yīng)用也較為廣泛［13］。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于藥材中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷的提取都是將其中一種成分進(jìn)行提取，少有同時(shí)將2種成分同時(shí)提取出來(lái)，且提取率也不是特別高。因此，該研究以秦嶺龍膽作為研究對(duì)象，以甲醇作為提取溶劑，采用超聲輔助提取法，考察提取時(shí)間、料液比、超聲頻率對(duì)秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取的影響，并采用響應(yīng)面-滿意度函數(shù)對(duì)提取工藝進(jìn)行

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優(yōu)化，得到的最優(yōu)工藝條件為提取時(shí)間26 min、料液比1∶21（g∶mL）、超聲頻率58 kHz，在此條件下龍膽苦苷、獐牙菜苦苷的提取率分別為0.312%、0.258%，分別與預(yù)測(cè)值（0.326%、0.270%）接近。表明響應(yīng)面-滿意度函數(shù)可用于秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取工藝的優(yōu)化，該方法快速、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可行。該研究結(jié)果可為其他中藥中化學(xué)成分的共提取工藝研究提供參考依據(jù)。

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