果生刺盤孢菌LFD-RPA可視化快速檢測(cè)方法的建立

摘要 建立針對(duì)果生刺盤孢菌（Colletotrichum fructicola）的快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。根據(jù)果生刺盤孢菌的基因序列設(shè)計(jì)了特異性檢測(cè)引物和探針，建立了重組酶聚合酶擴(kuò)增與側(cè)流層析試紙條（LFD-RPA）相結(jié)合的可視化快速檢測(cè)果生刺盤孢菌的方法。該檢測(cè)方法與其他病原菌無交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，且檢測(cè)靈敏度達(dá)1 pg/μL。該檢測(cè)方法無需 PCR 儀等復(fù)雜設(shè)備，在39 ℃恒溫反應(yīng) 12 min 即可完成檢測(cè)過程，為果生刺盤孢菌的檢驗(yàn)檢測(cè)和早期預(yù)警提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 果生刺盤孢菌；LFD-RPA；可視化快速檢測(cè)

中圖分類號(hào) S 436.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）23-0136-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.028

The Visual Rapid Detection of Colletotrichum fructicola Based on LFD-RPA Assay

PAN Rui， XU Hui-yong， ZANG Hao-yu et al

（Institute of Plant Protection and Agro-products Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230001）

Abstract In order to establish a rapid， accurate and simple detection method of Colletotrichum fructicola. A visual rapid detection assay of C. fructicola was established by designing specific primers and probe according to the gene sequence of C. fructicola based on the combination recombinase polymerase amplification with lateral flow dipsticks （LFD-RPA）. The detection method had strong specificity and high sensitivity （1 pg/μL）， besides， there was no cross-reaction with other pathogens. This method could be applied without any expensive and complex equipments such as PCR apparatus， meanwhile， the temperature of reaction condition was 39 ℃ and detection time was less than 12 min. This study provided a quick and simple technology for the detection and early warning of Colletotrichum fructicola.

Key words Colletotrichum fructicola;LFD-RPA;Visual rapid detection

基金項(xiàng)目 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)創(chuàng)制與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（部省共建）項(xiàng)目；國(guó)家梨產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-28）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院平臺(tái)項(xiàng)目（2023YL015）；安徽省果樹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（皖農(nóng)科函〔2021〕711號(hào)）；園藝作物種質(zhì)資源創(chuàng)制與高效栽培安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（皖科基地秘〔2023〕430號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介 潘銳（1995—），女，安徽舒城人，助理研究員，碩士，從事植物病害防治研究。

*通信作者：楊雪，副研究員，碩士，從事植物病害檢測(cè)及防治研究；高正輝，研究員，碩士，從事果樹栽培與育種研究。

收稿日期 2023-12-28；修回日期 2024-02-27

果生刺盤孢菌（Colletotrichum fructicola）是一種常見的植物致病菌，可侵染咖啡屬［1］、柑橘屬［2-3］、梨屬［4-7］、杧果屬［8-9］、蘋果屬［10-12］等多種植物，且具有廣泛的地域和物種多樣性，在世界范圍內(nèi)均有危害報(bào)道［13-20］。梨炭疽病是由刺盤孢屬真菌（Colletotrichum sp.）引起的，相關(guān)研究表明我國(guó)梨炭疽病的病原菌有12種，其中，果生刺盤孢菌為優(yōu)勢(shì)種［6］。雖然梨炭疽病的病原鑒定已經(jīng)取得一些進(jìn)展，但僅僅依賴形態(tài)學(xué)特征辨別、PCR分子檢測(cè)以及單基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等方法均易受到人為因素和環(huán)境條件的干擾。此外，上述鑒定方法需要專業(yè)技術(shù)人員和特殊儀器設(shè)備，檢測(cè)程序煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，不符合快速檢測(cè)的要求。因此，建立快速簡(jiǎn)便的方法對(duì)由果生刺盤孢菌引起的病害進(jìn)行檢測(cè)和早期預(yù)警具有現(xiàn)實(shí)意義。

重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)是一種在恒溫條件下進(jìn)行短時(shí)（5～20 min）反應(yīng)就可以擴(kuò)增出靶標(biāo)片段的核酸擴(kuò)增技術(shù)［21］，具有快速、靈敏、特異性高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，已經(jīng)成功應(yīng)用于多種病原真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等的檢測(cè)［22-27］。同時(shí)，RPA技術(shù)與側(cè)流層析試紙條（lateral flow dipsticks，LFD）相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的可視化，大大提高了該檢測(cè)技術(shù)的實(shí)用性并且擴(kuò)大了適用范圍［28-32］，但該結(jié)合技術(shù)對(duì)果生刺盤孢菌的檢測(cè)應(yīng)用尚少見報(bào)道。

該研究根據(jù)已報(bào)道的果生刺盤孢菌的特異性基因序列設(shè)計(jì)引物，同時(shí)依據(jù)基因組聚類分析方法，建立了果生刺盤孢菌的RPA-LFD檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)單、快速靈敏、特異性強(qiáng)，便于基層人員對(duì)果生刺盤孢菌的早期快速檢測(cè)，從而盡早對(duì)梨炭疽病采取防治措施，實(shí)現(xiàn)提高防控效果，減少損失的目的。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株（表1）均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所提供并保存。碭山酥梨炭疽病病葉和病果采集于安徽省碭山縣園藝場(chǎng)。側(cè)流層析檢測(cè)試紙條（彩虹型，JY0201）購(gòu)于北京寶盈同匯生物技術(shù)有限公司。RPA檢測(cè)試劑盒（WLB8201KIT）和植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）分別由安普未來生物科技有限公司和天根生化科技（北京）有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA制備。

根據(jù)真菌基因組DNA 提取試劑盒（Omega，D3390）操作說明書進(jìn)行供試菌株的基因組DNA提取，并將該基因組DNA保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和篩選。

通過系統(tǒng)比對(duì)篩選，將已報(bào)道的果生刺盤孢菌Unknown contig序列（NCBI Reference Sequence：NW_022474237.1：811738-813106）作為檢測(cè)的目標(biāo)基因，通過DNAMAN軟件設(shè)計(jì)出特異性擴(kuò)增引物Cf-F（5′-CGATTGTGAGTGAGCCCTAGTGGCGAGCCT-3′）、引物Cf-R（5′-CTTCGTATTTGTGGGAGTTGATTCGGGACT-3′）和探針Cf-Probe（5′-GAACTCTGTTACCATCAAGAAGTGCAGTCGC-TTCATCTGATATACTGCTT-3′），其中反向引物Cf-R的5′端修飾了一個(gè)生物素標(biāo)記，探針Cf-Probe的5′端標(biāo)記了異硫氰酸熒光素（FITC）基團(tuán)，3′端的標(biāo)記磷酸（PHO）基團(tuán)，且5′端起第33位與第34位堿基中標(biāo)記四氫呋喃（THF）基團(tuán)。引物和探針均由通用生物（安徽）股份有限公司合成。

1.2.3 LFD-RPA檢測(cè)體系及方法的建立。

使用RPA檢測(cè)試劑盒，以果生刺盤孢菌的基因組DNA為模板，依照試劑盒說明書所述反應(yīng)體系（總體積：50.0 μL），向RPA凍干酶中加入29.5 μL Buffer A、14.2 μL超純水、10.0 μmol/L引物Cf-F 1.0 μL、10.0 μmol/L引物Cf-R 1.5 μL、10.0 μmol/L探針Cf-Probe 0.3 μL、1.0 μL DNA模板及2.5 μL Buffer B，充分振蕩混勻，瞬時(shí)離心3 s，39 ℃恒溫?cái)U(kuò)增12 min。反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，并將側(cè)流層析檢測(cè)試紙條置于稀釋液中，室溫放置1 min后觀察反應(yīng)結(jié)果，根據(jù)LFD試紙條的條帶判斷待測(cè)樣品是否含有果生刺盤孢菌。

1.2.4 檢測(cè)體系的特異性分析。

為驗(yàn)證該研究所設(shè)計(jì)的引物探針組合的檢測(cè)特異性，以表1中所列的炭疽菌屬的近緣種菌株的基因組DNA為模板，按照“1.2.3”中描述的LFD-RPA檢測(cè)體系及方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用等量無菌水替換模板DNA作為陰性對(duì)照。

1.2.5 檢測(cè)體系的靈敏度分析。

為評(píng)估該研究中設(shè)計(jì)的引物探針組合的檢測(cè)靈敏度，將果生刺盤孢菌的基因組DNA梯度稀釋為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL，按照“1.2.3”中描述的LFD-RPA檢測(cè)體系及方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用等量無菌水替換模板DNA作為陰性對(duì)照。

1.2.6 檢測(cè)體系的適用性評(píng)價(jià)。

人工接種果生刺盤孢菌、梨黑斑病菌和梨輪紋病菌24 h后，將誘發(fā)的果實(shí)病害樣品進(jìn)行表面消毒處理并分別稱取5 g的發(fā)病組織2份，一份使用植物基因組DNA提取試劑盒提取總核酸，一份置于無菌水中進(jìn)行研磨，以研磨液為模板，利用該研究設(shè)計(jì)的引物及探針組合物，按照“1.2.3”中描述的LFD-RPA檢測(cè)體系及方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用等量的健康梨果實(shí)的DNA提取物和組織研磨液作為陰性對(duì)照。

1.2.7 檢測(cè)體系的田間應(yīng)用。

將田間采集的不同癥狀的梨病葉或病果樣品，先用75%的乙醇進(jìn)行表面消毒處理30 s，再用無菌水清洗3次，隨后稱取適量樣品放入無菌水中進(jìn)行研磨，以其研磨液為模板，利用該研究設(shè)計(jì)的引物及探針組合物，按照“1.2.3”中描述的LFD-RPA檢測(cè)體系及方法進(jìn)行檢測(cè)，用果生刺盤孢菌的DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，等量無菌水替換模板DNA作為陰性對(duì)照。同時(shí)，對(duì)田間病樣進(jìn)行病原菌的分離鑒定，以對(duì)LFD-RPA檢測(cè)體系及方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)特異性驗(yàn)證

為驗(yàn)證該研究中所設(shè)計(jì)的引物和探針組合物及檢測(cè)體系的特異性，從表1所示菌株中選取2株果生刺盤孢菌株和9種不同的炭疽病病原菌進(jìn)行LFD-RPA檢測(cè)，并根據(jù)LFD試紙條的條帶判斷待測(cè)樣品是否含有果生刺盤孢菌。當(dāng)LFD試紙條出現(xiàn)一條藍(lán)色條帶位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)，一條紅色條帶位于檢測(cè)區(qū)的情況，則結(jié)果為陽(yáng)性，表明待測(cè)樣品中含有果生刺盤孢菌；當(dāng)LFD試紙條質(zhì)控區(qū)內(nèi)只出現(xiàn)一條藍(lán)色條帶，則結(jié)果為陰性，表明待測(cè)樣品中不含有果生刺盤孢菌。

特異性檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，只有2株果生刺盤孢菌的檢測(cè)區(qū)出現(xiàn)紅色目的條帶，其他同屬不同種的炭疽病菌與陰性對(duì)照均只出現(xiàn)藍(lán)色的質(zhì)控條帶，說明該研究中，基于果生刺盤孢菌的基因序列設(shè)計(jì)的引物和探針具有種間特異性，可以用于區(qū)分果生刺盤孢菌與炭疽病菌的其他種，且檢測(cè)結(jié)果肉眼可見，無需借助任何儀器，檢測(cè)過程中操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)迅速便于基層檢驗(yàn)檢疫。

2.2 檢測(cè)靈敏度驗(yàn)證

為評(píng)估該研究中設(shè)計(jì)的引物探針組合的檢測(cè)靈敏度，利用系列梯度濃度為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL的果生刺盤孢菌的基因組DNA進(jìn)行LFD-RPA檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)基因組DNA濃度為1 pg/μL時(shí)即可檢出病原菌，表明該研究中LFD-RPA技術(shù)體系具有較高檢測(cè)靈敏度。

2.3 檢測(cè)適用性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證該研究所建立的LFD-RPA檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用情況，采用人工接種方法誘導(dǎo)果實(shí)發(fā)病，分別使用發(fā)病組織的DNA提取物及發(fā)病組織的無菌水研磨液作為檢測(cè)樣本，利用該研究設(shè)計(jì)的引物及探針組合物，按照“1.2.3”中所述體系及方法進(jìn)行LFD-RPA檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，由果生刺盤孢菌引起的果實(shí)病樣的總核酸及研磨液的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其他病害樣品和健康樣品的檢測(cè)結(jié)果為陰性，說明該研究所建立的LFD-RPA檢測(cè)技術(shù)體系能夠成功應(yīng)用于梨病害樣品中果生刺盤孢菌的檢測(cè)分析。同時(shí)，該技術(shù)體系可直接將無菌水研磨液作為檢測(cè)樣本，大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程，更適宜于基層田間檢測(cè)應(yīng)用，體現(xiàn)了LFD-RPA檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。

2.4 田間應(yīng)用驗(yàn)證

收集不同來源的梨病葉或梨病果樣品，進(jìn)行表面消毒處理后，加入無菌水進(jìn)行研磨，以其研磨液為模板，利用該研究設(shè)計(jì)的引物及探針組合物，按照“1.2.3”中所述LFD-RPA檢測(cè)體系及方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以果生刺盤孢菌的DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，用等量無菌水替換模板DNA作為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖4所示，7份病樣中有5份樣品顯示果生刺盤孢菌存在，與常規(guī)病原菌分離鑒定的結(jié)果一致。同時(shí)筆者對(duì)病樣進(jìn)行病原菌分離時(shí)發(fā)現(xiàn)有其他炭疽病菌與果生刺盤孢菌共存現(xiàn)象，說明該檢測(cè)體系可以排除其他病原菌干擾，準(zhǔn)確檢測(cè)出果生刺盤孢菌。

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)植物病害的病原菌檢測(cè)方法耗時(shí)耗力。隨著PCR等分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，植物病原物檢測(cè)的速度和準(zhǔn)確性都得到了極大的提高。然而，目前多數(shù)檢測(cè)方法在使用時(shí)需要配備專業(yè)技術(shù)人員和高值儀器設(shè)備等，這限制了它們?cè)诨鶎拥氖褂?。隨后發(fā)展起來的LAMP 恒溫檢測(cè)技術(shù)等雖不需要變溫儀器，但對(duì)引物設(shè)計(jì)較為嚴(yán)格也難以被廣泛應(yīng)用。與之相比，RPA技術(shù)恰好可以克服前述問題，同時(shí)具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。此外，由于RPA技術(shù)的擴(kuò)增反應(yīng)溫度低，有報(bào)道表明可以不利用任何儀器設(shè)備，僅靠體溫加熱即能完成反應(yīng)［33］，大大提高了該技術(shù)在基層推廣使用的可行性［34］。

由于果生刺盤孢菌是多種植物炭疽病的重要致病菌，建立快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)于預(yù)防該病原菌引起的病害具有重要意義?？紤]到基層檢驗(yàn)檢測(cè)條件有限，該研究依據(jù)果生刺盤孢菌的特異性基因序列，設(shè)計(jì)出擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)的引物和探針，建立了基于LFD-RPA的果生刺盤孢菌的可視化檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法不僅特異性強(qiáng)，與其他近緣種及其他屬病原菌均無交叉反應(yīng)，可從不同的植物病原細(xì)菌中特異性地檢測(cè)到參試果生刺盤孢菌，且對(duì)模板的制備要求低，操作簡(jiǎn)便，不需要貴重儀器設(shè)備，既擺脫了傳統(tǒng)分子檢測(cè)耗時(shí)耗力及設(shè)備昂貴和反應(yīng)條件的嚴(yán)格限制，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果肉眼可見，更適合于基層條件不足的植保植檢部門用以進(jìn)行病害檢測(cè)，在果生刺盤孢菌的檢驗(yàn)檢測(cè)、田間診斷、輔助鑒定和早期預(yù)警等方面具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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