基于機(jī)器學(xué)習(xí)和生物信息學(xué)分析的脂肪酸代謝相關(guān)基因在牙周炎中的作用研究

[摘要]目的 通過機(jī)器學(xué)習(xí)和生物信息學(xué)方法研究脂肪酸代謝相關(guān)基因在牙周炎中的作用。方法 從GEO數(shù)據(jù)庫下載牙周炎數(shù)據(jù)集GSE10334和GSE16134，GeneCards數(shù)據(jù)庫下載脂肪酸代謝相關(guān)基因集。通過R語言“l(fā)imma”包篩選牙周炎中差異表達(dá)的脂肪酸代謝相關(guān)基因（DEFAMRGs），并進(jìn)行功能富集和通路分析。進(jìn)一步用遞歸特征消除、最小絕對(duì)收縮和選擇算子和Boruta算法確定樞紐DEFAMRGs，并用其構(gòu)建診斷模型且進(jìn)行內(nèi)部和外部驗(yàn)證。利用一致性聚類分析構(gòu)建樞紐DEFAMRGs相關(guān)的牙周炎亞型。利用CIBERSORT軟件分析牙齦組織的免疫細(xì)胞浸潤，并探究樞紐DEFAMRGs和免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。結(jié)糶共篩選出113個(gè)牙周炎DE-FAMRGs。富集分析結(jié)果表明，DEFAMRGs主要和免疫炎癥反應(yīng)以及免疫細(xì)胞趨化相關(guān)。最終確定8個(gè)樞紐DE-FAMRGs（BTG2、CXCL12、FABP4、CLDN10、PPBP、RGS1、LGALSL和RIFl）并構(gòu)建了診斷模型（AUC=0.967），基于此將牙周炎分為兩個(gè)亞型。此外，樞紐DEFAMRGs與不同免疫細(xì)胞群體之間存在顯著的相關(guān)性，其中相關(guān)性較高的免疫細(xì)胞是肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。結(jié)論 該研究為牙周炎的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的見解和思路，基于樞紐DEFAMRGs構(gòu)建的診斷模型可為牙周炎的診斷和治療提供新的方向。

[關(guān)鍵詞]牙周炎；脂肪酸代謝；生物信息學(xué)；機(jī)器學(xué)習(xí)；免疫浸潤

[中圖分類號(hào)]R781.4[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[doi]10.7518/hxkq.2024.2024214

牙周炎是一種以牙周組織破壞為主要特征的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病率較高，是造成全球慢性疾病負(fù)擔(dān)的最重要的口腔疾病之一。牙周炎的病因復(fù)雜，涉及環(huán)境、生活方式、飲食和遺傳等多種因素。異常免疫炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是促進(jìn)軟組織炎癥和牙槽骨吸收的主要機(jī)制，而一些代謝相關(guān)的系統(tǒng)性疾病與機(jī)體的炎癥免疫反應(yīng)有著緊密聯(lián)系，可通過改變?nèi)頎顩r以及免疫，微生物組反應(yīng)來促進(jìn)牙周炎持續(xù)發(fā)展。所以評(píng)估患者代謝狀態(tài)對(duì)于牙周炎的預(yù)防有著重要意義。

脂肪酸代謝是人體代謝活動(dòng)的重要組成部分，其參與機(jī)體多項(xiàng)生理功能的調(diào)節(jié)，并與機(jī)體炎癥免疫反應(yīng)和全身狀態(tài)相互關(guān)聯(lián)。脂肪酸代謝產(chǎn)物可作為信號(hào)分子影響炎癥細(xì)胞的活化狀態(tài)，而炎癥反應(yīng)也會(huì)影響脂肪酸代謝通路中相關(guān)酶的活性以及基因的表達(dá)，進(jìn)而可能增加代謝性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。牙周炎作為一種與機(jī)體免疫和全身狀態(tài)密切相關(guān)的慢性炎癥性疾病，與脂肪酸代謝之間存在著密切關(guān)系。近年來，越來越多研究表明脂肪酸代謝異常與牙周炎之間存在雙向促進(jìn)的關(guān)系，兩者互為風(fēng)險(xiǎn)因素。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)血清脂肪酸譜與牙周炎的疾病活動(dòng)性相關(guān)，且患有脂肪酸代謝異常及其相關(guān)并發(fā)癥的人群發(fā)生牙周炎的幾率顯著上升。此外，牙周炎也會(huì)顯著增加脂肪酸代謝異常及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，例如一項(xiàng)研究顯示牙周炎可使血脂異常的發(fā)生率增加15％。

脂肪酸代謝異常與牙周炎之間相互影響的機(jī)制尚未明確，目前主要認(rèn)為與免疫炎癥及骨代謝異常相關(guān)。首先，脂肪酸代謝異常可以通過多種機(jī)制來促進(jìn)牙周炎的發(fā)生發(fā)展。研究顯示脂肪酸代謝異?；颊叩难褐兄舅徇^氧化物（fatty acid peroxidation product，F(xiàn)APP）、脂質(zhì)過氧化物（lipid hydroperoxide，LPO）以及飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）的含量顯著上調(diào)。FAPP和LPO是與牙周炎相關(guān)的氧化損傷中最常被研究的毒性代謝產(chǎn)物，其可造成細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂并損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而參與牙周組織炎癥和破壞的進(jìn)程等。SFA類似于脂多糖，其能與Toll樣受體4及髓樣分化蛋白2形成蛋白復(fù)合體，通過激活下游信號(hào)通路直接加重牙周炎癥。此外脂肪酸代謝異?；颊咻^強(qiáng)的氧化應(yīng)激水平也可通過多種途徑干擾骨代謝，進(jìn)而誘導(dǎo)牙周炎的發(fā)生和發(fā)展。另一方面，牙周炎也可通過某些機(jī)制加重脂肪酸代謝異常，研究顯示牙周炎患者的牙周組織中游離脂肪酸受體以及脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白顯著上調(diào)，這可能引起細(xì)胞攝人過量的游離脂肪酸，最終導(dǎo)致脂肪酸代謝紊亂和過氧化反應(yīng)的增加。以上機(jī)制涉及眾多細(xì)胞、分子及信號(hào)通路，且存在復(fù)雜的交叉作用。然而，目前關(guān)于脂肪酸代謝相關(guān)基因（fatty acid metabolism related genes，F(xiàn)AMRGs）在牙周炎中作用的研究較少，相關(guān)病理生理過程和基因調(diào)控機(jī)制尚未明確。

本研究通過使用基因表達(dá)庫（gene expression omnibus，GEO）和GeneCards數(shù)據(jù)庫的公共數(shù)據(jù)集，識(shí)別了牙周炎差異表達(dá)脂肪酸代謝相關(guān)基因（differentially expressed fatty acid metabolism related genes，DEFAMRGs），然后通過多種機(jī)器學(xué)習(xí)方法篩選樞紐DEFAMRGs，并初步構(gòu)建了一個(gè)牙周炎的診斷列線圖模型。此外通過一致性聚類分析，本研究對(duì)樞紐DEFAMRGs相關(guān)的牙周炎亞型進(jìn)行了初步探索，并比較了不同牙周炎亞型中樞紐DEFAMRGs的表達(dá)差異。最后，本研究分析了牙周炎中免疫細(xì)胞的浸潤水平，并對(duì)樞紐DEFA-MRGs與各種免疫細(xì)胞的相關(guān)性進(jìn)行分析。該研究可為牙周炎和脂肪酸代謝的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供初步參考，同時(shí)可為臨床上脂肪酸代謝異常人群在牙周炎的預(yù)防、早期診斷和個(gè)性化治療等方面提供一定的幫助。

1材料和方法

1.1數(shù)據(jù)獲取與處理

通過GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索牙周炎的相關(guān)數(shù)據(jù)集。納入標(biāo)準(zhǔn)為：1）樣本來自牙齦組織；2）存在疾病組和對(duì)照組樣本；3）所有樣本來自于智人。最終選擇的數(shù)據(jù)集為GSE10334和GSE16134。其中，GSE10334包括247例樣本（炎性牙齦183例，健康牙齦64例），GSE16134包括310例樣本（炎性牙齦241例，健康牙齦69例）。FAMRGs來自GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）。對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正和歸一化處理。

1.2牙周炎差異表達(dá)脂肪酸代謝相關(guān)基因的鑒定

在GSE10334數(shù)據(jù)集中，利用R語言“l(fā)imma”包篩選牙周炎的差異表達(dá)基因（differentially ex-pressed genes，DEGs），篩選閾值設(shè)置為Plt;0.05且llogFCI≥l。將牙周炎的DEGs與GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得的FAMRGs取交集，獲得牙周炎DEFAM-RGs。使用R語言“ggVennDiagram”包繪制DEGs與FAMRGs的韋恩圖，使用R語言“ggplot2”包繪制牙周炎DEFAMRGs的火山圖，并使用R語言“pheatmap”包繪制牙周炎DEFAMRGs的熱圖。

1.3牙周炎DEFAMRGs的富集分析

為了進(jìn)一步分析DEFAMRGs的功能和作用途徑，使用R語言“clusterProfiler”包對(duì)其進(jìn)行了基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopediaof genes and genomes，KEGG）通路富集分析，以Plt;0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4基于機(jī)器學(xué)習(xí)方法篩選樞紐DEFAMRGs

為了進(jìn)一步鑒定對(duì)牙周炎的診斷具有關(guān)鍵意義的樞紐DEFAMRGs，本研究使用最小絕對(duì)收縮和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）、遞歸特征消除（recursive feature elimination，RFE）和Boruta三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法，在GSE10334數(shù)據(jù)集中對(duì)DEFAMRGs進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，并將篩選結(jié)果取交集獲得樞紐DE-FAMRGs。LASSO算法可以降低模型復(fù)雜度、避免過擬合，并提高模型的泛化能力。RFE算法常用于處理高維數(shù)據(jù)，它能迭代去除對(duì)模型影響較小的特征從而提高模型性能。Boruta算法是一種與隨機(jī)森林相結(jié)合的特征選擇算法，可以用于確定顯著影響目標(biāo)變量的特征，從而提高模型的泛化能力。本研究使用R語言“glmnet”包來實(shí)現(xiàn)LASSO算法，以最小值為閾值。使用R語言“caret”包來實(shí)現(xiàn)RFE算法，以最小交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤為閾值。使用R語言“Boruta”包實(shí)現(xiàn)Boruta算法，并將確定無效特征的閾值設(shè)置為0.05。使用R語言“ggVennDiagram”軟件包繪制三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選結(jié)果的韋恩圖。

1.5基于樞紐DEFAMRGs構(gòu)建和驗(yàn)證牙周炎診斷模型

以GSE10334為訓(xùn)練集，基于樞紐DEFAMRGs構(gòu)建牙周炎診斷的列線圖模型。以GSE10334為內(nèi)部驗(yàn)證集，GSE16134為外部驗(yàn)證集，利用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線來對(duì)樞紐DEFAMRGs的診斷能力進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)列線圖模型的診斷效能進(jìn)行評(píng)價(jià)。此外，使用校準(zhǔn)曲線來評(píng)估模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，并通過決策曲線來展示不同閾值下的真陽性率和假陽性率之間的關(guān)系，以直觀地反映模型在不同決策點(diǎn)下的性能表現(xiàn)。本研究使用R語言“rms”包構(gòu)建列線圖，使用R語言“pROC”包來繪制ROC曲線，使用R語言“calibrate”包繪制校準(zhǔn)曲線，使用R語言“DecisionCurve”包繪制決策曲線。

1.6一致性聚類分析

基于樞紐DEFAMRGs對(duì)牙周炎患者進(jìn)行一致性聚類分析，構(gòu)建不同樞紐DEFAMRGs相關(guān)的牙周炎亞型，并比較不同牙周炎亞型中樞紐DE-FAMRGs的差異。一致性聚類分析是使用R語言“ConsensusClusterPlus”包來實(shí)現(xiàn)的。

1.7免疫浸潤分析

為了進(jìn)一步探索免疫過程在牙周炎疾病進(jìn)展中的作用，本研究使用GSE10334數(shù)據(jù)集進(jìn)行了免疫浸潤分析。此分析基于CIBERSORT算法，采用由22個(gè)免疫細(xì)胞基因（LM22）組成的參考集，通過Web分類工具（http：//CIBERSORT.stanford.edu/）來實(shí)現(xiàn)。使用R語言“ggplots”包和“pheatmap”包對(duì)免疫細(xì)胞浸潤的結(jié)果進(jìn)行可視化。Pearson相關(guān)性分析用于確定不同免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性，以及免疫細(xì)胞豐度與樞紐DEFAMRGs表達(dá)之間的相關(guān)性。使用R語言“corrplot”來對(duì)相關(guān)性分析的結(jié)果進(jìn)行可視化。

2結(jié)果

2.1牙周炎DEFAMRGs的鑒定結(jié)果

本研究共識(shí)別出113個(gè)牙周炎DEFAMRGs（在健康組中36個(gè)基因顯著上調(diào)、77個(gè)基因顯著下調(diào)）（圖1A、B）。熱圖直觀地顯示了113個(gè)DEFA-MRGs中的前40個(gè)基因的表達(dá)水平（圖1C），相關(guān)性熱圖展示了各基因之間的相關(guān)性（圖1D）。

2.2牙周炎DEFAMRGs富集分析結(jié)果

GO富集分析顯示，在生物學(xué)過程（biological process，BP）中，DEFAMRGs主要富集在對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、中性粒細(xì)胞脫顆粒、參與免疫反應(yīng)的中性粒細(xì)胞激活以及對(duì)細(xì)菌來源的分子的細(xì)胞反應(yīng)中（圖2A）；在細(xì)胞成分（cellular component，cc）中，主要富集在角質(zhì)化包膜、三級(jí)顆粒、分泌顆粒膜、質(zhì)膜外側(cè)和血小板u顆粒中（圖2B）；在分子功能（molecular function，MF）中，主要富集在CXCR趨化因子受體結(jié)合、趨化因子活性、趨化蛋白受體結(jié)合、皮膚表皮結(jié)構(gòu)成分和G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合中（圖2C）。KEGG通路富集分析顯示，DEFAMRGs在與細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體相互作用、瘧疾、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、金黃色葡萄球菌感染和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的通路中顯著富集（圖2D）。

2.3機(jī)器學(xué)習(xí)篩選樞紐DEFAMRGs的結(jié)果

本研究使用LASSO算法篩選出13個(gè)樞紐DE-FAMRGs（圖3A、B），使用RFE算法篩選出21個(gè)樞紐DEFAMRGs（圖3C），使用Boruta算法篩選出70個(gè)樞紐DEFAMRGs（圖3D）。最后對(duì)三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法的篩選結(jié)果取交集，獲得8個(gè)樞紐DEFAMRGs，包括BTG2、CXCL12、FABP4、CLDN10、PPBP、RGSl、LGALSL和RIFl （圖4Al）。

2.4基于樞紐DEFAMRGs構(gòu)建和驗(yàn)證牙周炎診斷模型的結(jié)果

本研究以GSE10334數(shù)據(jù)集為訓(xùn)練集，基于樞紐DEFAMRGs構(gòu)建了牙周炎的診斷列線圖模型（圖4A2）。使用內(nèi)部（GSE10334）和外部（GSE-16134）數(shù)據(jù)集對(duì)8個(gè)樞紐DEFAMRGs

以及診斷模型的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行驗(yàn)證。在內(nèi)部驗(yàn)證集GSE10334中，BTG2、CXCL12、FABP4、CLDN10、PPBP、RGS1、LGALSL和RIF1的AUC值均大于0.7（圖481）。列線圖模型的AUC值為0.958（95％CI 0.924-0.991）（圖482）。決策曲線表明該模型具有良好的臨床適用性（圖483）。校準(zhǔn)曲線表明該模型具有較好的準(zhǔn)確性和可靠性，可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)牙周炎的發(fā)生（圖484）。在外部驗(yàn)證集GSE16134中，BTG2、CXCL12、FABP4、CLDNIO、PPBP、RGS1、LGALSL和RIF1的AUC值均大于0.7（圖4C1）。列線圖模型的AUC值為0.967 （95％C10.938-0.997）（圖4C2）。且決策曲線和校準(zhǔn)曲線的結(jié)果表明，該模型具有良好的分類、判別能力和臨床有效性（圖4C3、C4）。

2.5牙周炎一致性聚類分析結(jié)果

本研究基于樞紐DEFAMRGs，對(duì)GSEI0334數(shù)據(jù)集中的247個(gè)樣本進(jìn)行一致性聚類分析，以構(gòu)建不同的牙周炎亞型。結(jié)果顯示，當(dāng)聚類數(shù)k=2時(shí)達(dá)到最佳的聚類效果（圖5A-C）。此時(shí)247個(gè)樣本被分為了聚類l（n=170）和聚類2（n=77），且主成分分析顯示它們之間存在顯著差異（圖5D）。跟蹤圖展示了樣本分配在k值變化時(shí)的穩(wěn)定性（圖5E）。此外，8個(gè)樞紐DEFAMRGs在不同亞型牙周炎之間均存在顯著差異（圖5F）。亞型1（n=170）和亞型2 （n=77）在牙周炎患病率上存在顯著差異（Plt;0.001），亞型1的患病率（95.3％）顯著高于亞型2（27.3％）（表1）。在基因表達(dá)特征方面，亞型1和亞型2間在8個(gè)樞紐基因上均存在顯著差異（Plt;0.001）。相對(duì)于亞型2，亞型1的BTG2、CXCL-12、FABP4、CLDN10、PPBP、RGS1基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，LGALSL和RIF1基因表達(dá)水平顯著下調(diào)（表1）。這些結(jié)果進(jìn)一步闡明了樞紐DEFA-MRGs在牙周炎發(fā)病機(jī)制中的重要作用，而基于樞紐DEFAMRGs構(gòu)建的牙周炎亞型，可為臨床上脂肪酸代謝紊亂人群的牙周炎分類、診斷和治療提供依據(jù)。

2.6免疫浸潤分析結(jié)果

本研究通過分析牙周炎和健康樣本的免疫細(xì)胞浸潤，以及樞紐DEFAMRGs表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系，以探索其與牙周炎宿主免疫過程之間的潛在聯(lián)系。圖6A顯示了免疫細(xì)胞之間的Pearson相關(guān)性，圖6B顯示了每個(gè)樣本的免疫細(xì)胞浸潤的百分比。樞紐DEFAMRGs與牙周炎免疫細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，RIF1和LGALSL與活化的樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞呈顯著的負(fù)相關(guān)。CLDN10、FABP4和RGS1與活化的樹突狀細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)性，CXCL12和BTG2也與記憶B細(xì)胞、靜息NK細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞顯示出顯著的正相關(guān)，而與y8T細(xì)胞細(xì)胞顯示出負(fù)相關(guān)。此外，PPBP僅與MO巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)，與其他免疫細(xì)胞無顯著相關(guān)性（圖6C）。免疫細(xì)胞豐度的對(duì)比結(jié)果表明，相比于健康個(gè)體，牙周炎患者的幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯著較高。相反，在牙周炎患者中，活化記憶性CD4+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、活化NK細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞的比例顯著較低（圖6D）。這些結(jié)果表明在牙周炎的發(fā)生和發(fā)展過程中，樞紐DEFAM-RGs和宿主免疫過程之間有著密切的關(guān)系。

3討論

牙周炎的病因復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的代謝和免疫狀態(tài)密切相關(guān)。而脂肪酸代謝是機(jī)體代謝和免疫過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與機(jī)體蛋白質(zhì)代謝、糖代謝及內(nèi)分泌功能狀態(tài)之間相互影響，并在炎癥免疫反應(yīng)的調(diào)控中起到關(guān)鍵作用。相關(guān)研究表明脂肪酸代謝與多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，肥胖個(gè)體、患有心血管疾病或2型糖尿病的患者血液中游離脂肪酸水平顯著升高。而牙周炎作為一種與全身健康狀況密切聯(lián)系的慢性炎癥性疾病，與脂肪酸代謝之間也存在潛在聯(lián)系。探索脂肪酸代謝與牙周炎的共同的生物標(biāo)志物或分子路徑，并分析其與免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系，有助于揭示它們之間的相互作用機(jī)制，進(jìn)而有可能為脂肪酸代謝異常的患者在牙周炎的診斷和治療方面提供新的臨床見解和指導(dǎo)。

本研究基于GeneCards和GEO數(shù)據(jù)庫，共識(shí)別出113個(gè)牙周炎DEFAMRGs。GO富集分析顯示，這些基因顯著富集于對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、中性粒細(xì)胞脫顆粒等生物學(xué)過程；角質(zhì)化包膜、三級(jí)顆粒、分泌顆粒膜等細(xì)胞成分；CXCR趨化因子受體結(jié)合、趨化因子活性、趨化蛋白受體結(jié)合等生物學(xué)功能。在KEGG通路中牙周炎DEFAMRGs主要富集在細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體相互作用、病毒蛋白與綱胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用等通路上。以上結(jié)果表明，脂肪酸代謝在炎癥和免疫反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，其主要通過調(diào)控細(xì)胞因子釋放和免疫細(xì)胞趨化等方面來影響牙周炎的進(jìn)展。Rocha等的研究表明脂肪酸代謝會(huì)影響炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，飽和脂肪酸的攝入與血液中促炎細(xì)胞因子和趨化因子水平的升高有關(guān)，這與本研究相符。此外相關(guān)研究也表明脂肪酸代謝與免疫細(xì)胞激活、增殖和遷移密切相關(guān)，在炎癥過程中一些免疫細(xì)胞會(huì)釋放脂肪酸代謝產(chǎn)物如烯丙二酸、白三烯和前列腺素作為信號(hào)分子參與炎癥和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

本研究采用LASSO、RFE和Boruta算法篩選得到8個(gè)樞紐DEFAMRGs（BTG2、CXCL12、FA-BP4、CLDN10、PPBP、RGS1、LGALSL和RIF-1），并構(gòu)建了牙周炎的診斷模型。在內(nèi)部和外部驗(yàn)證中，該診斷模型的AUC值均大于0.9，表明其具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力。此外決策曲線和校準(zhǔn)曲線的結(jié)果也表明，該模型具有良好的準(zhǔn)確性和臨床有效性。此外本研究發(fā)現(xiàn)的8個(gè)樞紐DEFAMRGs在內(nèi)部和外部驗(yàn)證中AUC值均大于0.7，提示這些脂肪酸代謝相關(guān)基因在牙周炎的診斷中有一定的潛在價(jià)值。根據(jù)既往文獻(xiàn)，這8個(gè)樞紐DEFAM-RGs可通過各種機(jī)制來影響牙周炎的進(jìn)展，各基因的主要機(jī)制如下：BTG2是BTG/Tob家族的成員，主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯和細(xì)胞功能，如增殖、凋亡和生長。Li等的一項(xiàng)研究揭示了牙周炎和口腔鱗狀細(xì)胞癌之間的miRNA串?dāng)_，結(jié)果表明BTG2是最關(guān)鍵的候選miRNA失調(diào)基因之一。CXCL12是一種趨化因子蛋白，主要參與活化白細(xì)胞的趨化作用，并在牙周炎骨免疫微環(huán)境中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Mahandoda等報(bào)道，在牙齦炎和牙周炎患者中CXCL12的表達(dá)顯著上調(diào)。FABP4屬于脂肪酸結(jié)合蛋白家族，在牙周炎進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。Kim等的一項(xiàng)研究表明，牙周病原體可以通過調(diào)節(jié)FABP4的表達(dá)來刺激巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)攝取。另一項(xiàng)研究表明牙周治療可顯著降低牙周炎患者的血清FABP水平。CLDN10是編碼緊密連接蛋白的關(guān)鍵基因，該蛋白在各種組織中維持上皮屏障的完整性。研究表明，CLDN10可調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性和離子穿過上皮細(xì)胞層的轉(zhuǎn)運(yùn)，故其可能通過調(diào)控上皮屏障的完整性來影響牙周炎的進(jìn)展。PPBP是CXC趨化因子家族中的一種血小板衍生生長因子，其可能作為中性粒細(xì)胞的強(qiáng)效化學(xué)引誘劑和激活劑來參與牙周炎的進(jìn)程。Zeng等報(bào)道，炎癥牙齦組織中PPBP的表達(dá)顯著高于健康牙齦組織。RGS1編碼G蛋白信號(hào)通路中的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化和增殖過程中發(fā)揮重要作用，且深刻影響著與細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)的各種生理過程，包括神經(jīng)傳遞、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)。LGALSL編碼影響乳糖代謝和半乳糖凝集素表達(dá)的蛋白質(zhì)，它通過與半乳糖凝集素相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)，影響粘附、遷移和免疫反應(yīng)。RIF1是一種對(duì)調(diào)節(jié)DNA復(fù)制時(shí)間和維持基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要的基因。研究表明RIF1主要負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)DNA復(fù)制、端粒維持和DNA修復(fù)過程，其失調(diào)與各種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。上述作用機(jī)制是基于當(dāng)前文獻(xiàn)對(duì)這些基因功能的普遍理解。然而牙周炎的生物學(xué)機(jī)制可能涉及多種因素之間的復(fù)雜相互作用，未來還需要進(jìn)一步的研究來分析這些基因在牙周炎中的作用。

基于8個(gè)樞紐DEFAMRGs，本研究進(jìn)一步采用一致性聚類算法對(duì)牙周炎樣本進(jìn)行了聚類分析。聚類算法是一種常用的無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，它可以根據(jù)數(shù)據(jù)的相似性自動(dòng)將數(shù)據(jù)劃分為不同的類別。在醫(yī)療領(lǐng)域，聚類算法可以用于疾病分類和診斷，可以根據(jù)某些特征將患者分為不同的亞型或群體，使得醫(yī)生能夠更好地了解患者的病情特點(diǎn)，為疾病預(yù)防、診斷和個(gè)性化治療提供依據(jù)。本研究最終將牙周炎患者分為了兩個(gè)亞型，亞型1的牙周炎患病率顯著高于亞型2，此外亞型1的BTG2、CXCL12、FABP4、CLDN10、PPBP、RGS1基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，LGALSL和RJF1基因表達(dá)水平顯著下調(diào)。根據(jù)該結(jié)果可推測(cè)BTG2、CXCL12、FABP4、CLDN10、PPBP、RGS1的表達(dá)水平與牙周炎的發(fā)生率成正相關(guān)，LGALSL和RIF1的表達(dá)水平與牙周炎的發(fā)生率成負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果為更深入地理解和解釋牙周炎與脂肪酸代謝之間的關(guān)系提供了有力的證據(jù)。此外，在臨床中通過對(duì)牙周組織樣本進(jìn)行基因表達(dá)分析，并根據(jù)本研究的結(jié)果對(duì)牙周炎的亞型進(jìn)行判斷。醫(yī)生可以對(duì)患者的牙周炎患病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，并將患者歸類到相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)群體中。這種方法有助于醫(yī)生給出有針對(duì)性的建議，從而降低患者牙周炎風(fēng)險(xiǎn)并提高治療效果。此外，在本研究基礎(chǔ)上研究人員可以進(jìn)一步探索個(gè)性化療法，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)或修復(fù)基因缺陷來對(duì)與脂肪酸代謝異常相關(guān)的牙周炎進(jìn)行精準(zhǔn)治療。

根據(jù)富集分析，DEFAMRGs主要富集在免疫炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞趨化等生物功能和通路上，因此本研究對(duì)牙齦組織進(jìn)一步進(jìn)行了免疫浸潤分析。結(jié)果顯示，牙周炎患者牙齦組織中幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、Ml巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的比例顯著高于對(duì)照組。相反，活化記憶性CD4+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、活化NK細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞的比例顯著低于對(duì)照組，該結(jié)果與既往研究相比具有很高的一致性。各類免疫細(xì)胞在牙周炎進(jìn)展中發(fā)揮著不同的作用，淋巴細(xì)胞中對(duì)牙周炎的進(jìn)展有促進(jìn)作用的是輔助性T細(xì)胞、Th17和記憶B淋巴細(xì)胞，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、B10細(xì)胞則可以顯著抑制炎癥反應(yīng)。

M1巨噬細(xì)胞是一種促炎型巨噬細(xì)胞，它們可以分泌促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-a（tumor necrosis factor-a，TNF-a）、白細(xì)胞介素-1B（interleukin-1B，IL-1B）等來促進(jìn)炎癥反應(yīng)，引發(fā)牙齦組織的炎癥和破壞。Treg細(xì)胞對(duì)于維持健康牙周組織的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，并可能與一些患者的牙齦炎病變不繼續(xù)進(jìn)展有著密切聯(lián)系。本研究牙周炎樣本中Treg細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，這也驗(yàn)證了既往研究中所報(bào)道的Treg細(xì)胞可以抑制免疫應(yīng)答而減輕牙周炎的病理過程的觀點(diǎn)。NK細(xì)胞可以抑制菌斑微生物對(duì)健康牙齦的侵襲，但NK細(xì)胞的過度活化會(huì)導(dǎo)致組織損傷和牙槽骨吸收。Seidel等認(rèn)為，NK細(xì)胞通過細(xì)胞因子產(chǎn)生、細(xì)胞毒作用、樹突狀細(xì)胞串?dāng)_和自身免疫反應(yīng)而在牙周炎進(jìn)展中主要起到促炎作用。但也有研究的觀點(diǎn)與之相反，因此NK細(xì)胞在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用還需進(jìn)一步研究。

此外本研究還分析了樞紐DEFAMRGs表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系，結(jié)果顯示樞紐DEFA-MRGs與不同免疫細(xì)胞群體之間的存在顯著相關(guān)性。其中與樞紐DEFAMRGs相關(guān)性最高的免疫細(xì)胞是肥大細(xì)胞，它在RIF1、LGALSL、LDN10、FABP4、RGS1、CXCL12和BTG2調(diào)控牙周炎中均起著重要作用。其次是活化的樹突狀細(xì)胞，其在RIF1、LGALSL、CLDN10、BTG2、FABP4和RGS1調(diào)控牙周炎中起著重要作用。肥大細(xì)胞與牙周炎的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系。作為一種在牙周炎進(jìn)展中明顯失調(diào)的免疫細(xì)胞，肥大細(xì)胞可以作為牙周炎的標(biāo)志物。相關(guān)研究表明，與健康組織相比牙周炎組織中肥大細(xì)胞的計(jì)數(shù)和密度顯著升高。肥大細(xì)胞可以通過多種機(jī)制促進(jìn)牙周炎的發(fā)生發(fā)展：首先，肥大細(xì)胞可以釋放多種炎癥介質(zhì)，如組胺、前列腺素和白三烯等，這些介質(zhì)可以引起局部血管擴(kuò)張、滲透性增加和炎癥細(xì)胞的趨化，從而加劇牙周組織的炎癥反應(yīng)。此外肥大細(xì)胞是促炎細(xì)胞因子如IL-1、TNF和IL-33的潛在來源，這些細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化和募集，并通過多種機(jī)制介導(dǎo)牙周組織的局部炎癥和破壞。另外，牙齦卟啉單胞菌可激活應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SA-PK）和NF-KB信號(hào)通路來誘導(dǎo)肥大細(xì)胞產(chǎn)生IL-31，IL-31可通過下調(diào)牙齦上皮細(xì)胞中緊密連接分子claudin-l的表達(dá)引起牙齦上皮屏障功能障礙。除了以上機(jī)制外，肥大細(xì)胞還可影響牙周組織中的膠原蛋白成熟而誘導(dǎo)牙周病的發(fā)生發(fā)展。在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中樹突狀細(xì)胞也扮演著重要角色：首先，樹突狀細(xì)胞在牙齦固有層原位成熟，除了釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子外，其還可與CD4+T細(xì)胞形成免疫復(fù)合物來調(diào)節(jié)T細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng)進(jìn)而調(diào)控牙周炎癥反應(yīng)。其次，牙齦樹突狀細(xì)胞的表征與牙周病的發(fā)生相關(guān)，研究表明在牙周炎患者的牙齦組織中漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞顯著增加。此外有研究顯示，牙齦卟啉單胞菌可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分泌外泌體來促進(jìn)牙周炎癥和牙槽骨吸收，在實(shí)驗(yàn)性牙周炎的病理生理過程中起著關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究將機(jī)器學(xué)習(xí)結(jié)合到生物信息學(xué)當(dāng)中，篩選出了在牙周炎進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用的8個(gè)脂肪酸代謝相關(guān)基因，分別為BTG2、cx-CLI2、FABP4、CLDN10、PPBP、RGS1、LG-AL-SL和RIF1。基于這些基因，本研究構(gòu)建了牙周炎的診斷列線圖模型，并根據(jù)基因表達(dá)量的不同將牙周炎分為了兩個(gè)亞型。此外還探討了牙周炎與健康組的免疫細(xì)胞的浸潤特征，并發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞是樞紐DEFAMRGs調(diào)控牙周炎的炎癥免疫反應(yīng)過程中較為關(guān)鍵的免疫細(xì)胞?？傊撗芯繛樯钊胩剿餮乐苎着c脂肪酸代謝關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制提供了初步參考，同時(shí)可為臨床上脂肪酸代謝異常人群在牙周炎的預(yù)防、早期診斷和個(gè)性化治療策略的制定上提供一定幫助。但仍存在一定的局限性，該研究得出的結(jié)論基于公共數(shù)據(jù)庫，缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可能會(huì)使結(jié)果產(chǎn)生偏差，需要在以后的實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。